性肺炎症 损伤模型中对肺组织显微结构的影响(E)以及对炎症因子TNF-a和IL-6的影响(F)。
【具体实施方式】
[0017] 本发明通过对高致病性流感病毒和低致病性流感病毒感染小鼠的肺组织在6小 时，1天，2天，3天，7天，14天时间点进行全基因组转录组学分析，筛选出显著差异表达的宿 主分子TFF2,其在低致病性流感病毒感染过程中先微量下降，随后逐步升高，而在高致病性 的流感病毒感染过程中急剧下降，这与其体重丢失的曲线非常类似，提示它可能在预防流 感病毒引起的呼吸道损伤中具有重要作用。为了验证TFF2在流感感染中的作用，我们构建 了TFF2真核表达载体pSVl. 0-TFF2，在293FT细胞中表达，收集上清，浓缩，采用Western Blot验证TFF2的表达，然后用ELISA Kit对上清中的TFF2进行定量。采用含TFF2的上清与对 照上清分别在感染前2小时，感染后的3天和8天滴鼻处理小鼠，观察H7N9感染后小鼠体重变 化和生存率。发现含TFF2的细胞培养上清处理组能显著提高小鼠的生存率，减少体重丢失， 改善高致病性禽流感感染的症状与预后。在此基础上，我们采用亲和层析的方法纯化了 TFF2蛋白，进一步验证其对流感病毒H1N1毒株PR8以及H9N2毒株攻毒的保护效果；同时， TFF2基因敲除小鼠对H9N2病毒更为敏感，体重下降程度更高，恢复的时间更慢。机制研究表 明：TFF2不影响流感病毒复制，而是通过降低炎症因子表达，减少呼吸道组织损伤与促进损 伤修复以达到改善预后的效果。另外，TFF2对流感病毒感染的保护并非特异性保护，而是广 谱性的保护作用，其在LPS诱导的急性炎症损伤模型中也能发挥同样的功能。这些结果充分 证明TFF2在呼吸道病原体或其他因素诱导的急性炎症损伤模型中发挥了重要的保护作用。
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0019] 实施例一:建立高致病性流感和低致病性流感感染小鼠的模型 本实施例采用高剂量的流感病毒H7N9病毒株A/Shanghai/4664T/2013(3.5*105半数组 织细胞感染量 TCID50/50ul 体积）和 H9N2 病毒株 A/Chicken/Shanghai/F/98( 1.7*107 鸡胚半 数感染量EID50 /50ul体积)通过滴鼻的方法感染C57小鼠，感染前采用氯胺酮40ul/只麻醉 小鼠。将小鼠放入IVC笼中，连续14天称量小鼠体重，观察小鼠存活情况及生存状态。在感染 后的6小时，1天，2天，3天，7天，14天取肺组织，液氮速冻，备用（图1A)。图1B所示，H7N9感染 的小鼠体重持续下降，在第7天，大部分小鼠体重丢失30%以上，而H9N2感染的小鼠在感染后 的前3天体重下降了 12.6%，从第4天开始体重逐渐恢复，第8天体重恢复到感染前水平，第9 天开始体重逐渐增加。生存率分析（图1C)显示，H7N9感染的小鼠在感染后第4天开始死亡， 第7天死亡率达到37%，第8天全部死亡;而H9N2感染后，12%的小鼠死亡是由于病毒感染引发 的狂怒，暴躁而被咬伤(有伤口），非直接病毒感染致死，剩余88%的小鼠能持续生存2周以 上。（H7N9试验在P3试验室完成，H9N2试验在P2试验室完成）。
[0020] 实施例二:转录组芯片分析筛选重症流感和轻症流感感染小鼠肺组织的显著差异 基因表达，筛选到TFF2为保护性分子 本实施例采用了 Agi lent2100系统检测了H7N9与H9N2感染小鼠的0天，6小时，1天，2天， 3天，7天，14天时间点的肺组织的全基因组表达谱。如图2A，我们将P值设为0.01，筛选到188 个显著差异的基因，其中在H7N9组中高表达的基因有85个，而在H9N2组中高表达的基因有 103个。典型的H7N9组中高表达的基因包括:01打11，1?肌3，1?恥1，1(^17，这些基因与炎症 相关；而H9N2组中高表达差异基因包括了??2,6?2，1此513，11^53，(：1〇33，这些基因与宿主防 御和上皮细胞修复密切相关。其中，TFF2在两组中差异最大，达到106.7倍，P值为0.002。 TFF2 mRNA在H9N2感染的前2天略有下降，第3天开始逐渐升高；而在H7N9感染中则持续下降 (图2B)。为了进一步验证TFF2在H7N9和H9N2中的表达情况，我们采用SYBR Real-time PCR 的方法，采用引物[TFF2-F(SEQ ID N0:1): GAGAAACCTTCCCCCTGTCG; TFF2-R(SEQ ID NO: 2): TTTCGACTGGCACAGTC CTC]，根据 GoTaq qPCR Master Mix(Promega，A6001)的说明进 行qPCR试验，在两组每个时间点的3只小鼠中验证了TFF2 mRNA的变化，其变化趋势与芯片 数据一致（图20。下一步，我们检测了 TFF2蛋白水平的表达情况，对照组有很微弱的TFF2蛋 白表达，H7N9感染后，TFF2蛋白逐渐消失；而H9N2感染后，肺组织中TFF2蛋白随时间推移越 来越多（图2D)。
[0021] 实施例三:TFF2基因的克隆与TFF2蛋白的真核表达 本实施例首先根据TFF2序列克隆基因（人源TFF2蛋白（hTFF2)核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序列如SEQIDN0:4所示，鼠源TFF2蛋白（mTFF2)核苷酸序列如SEQID NO: 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示），将重组的pSVl. 0-TFF2或pSVl. 0-TFF2-6xHis 质粒转染进入293T细胞后，再通过WB检测TFF2蛋白的真核表达，并通过镍柱采用不同浓度 梯度的咪唑洗脱，收集目的蛋白后过滤，洗涤，得到高纯度的TFF2蛋白，其具体步骤如下： 以感染H9N2的小鼠肺组织抽提的RNA反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增，上游引物 为SEQ ID N0:7，即5'-CGCTCTAGAATGCGACCTCGAGGTGCCCC-3'，下游引物为SEQ ID N0:8,即 5' -CCTGGATCCTCAGTAGTGACAATCTTCCA-3 ' JFFS-exHis的引物序列为：上游引物为SEQ ID N0:9,即5'-CGCTCTAGAATGCGACCTCGAGGTGCCCC-3'，下游引物为SEQ ID N0:10,5'_ CGGGATCCTCAGTGATGATGATGATGATGGTAGTGACAATCTTCCA -3 '。其扩增程序为:预变性95 °C，2 分钟；变性95 °C，15秒;退火55°C，30秒;延伸，72°C，30秒;终延伸，72°C，10分钟；循环数为 30。扩增结束后，在1%的琼脂糖凝胶中分离目的基因，再使用Sanprep柱式DNA胶回收试剂 盒回收扩增产物TFF2。将TFF2回收产物和载体pSVl.O都用内切酶BamHI、XbaI双酶切回收。 37 °C水浴酶切7小时，1%琼脂糖凝胶电泳后使用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收其 片段。目的片段了?？2与载体？3￥1.0,4°(：连接过夜，形成重组质粒？3￥1.04??2和？3￥1.0-TFF2_6xHis。将重组质粒转化至大肠杆菌E. coli T0P10，后通过菌落PCR和双酶切(BamHI、 Xbal)鉴定阳性克隆，经测序鉴定目标序列完全正确，无突变产生。构建的克隆图谱见图3A。 [0022] 将测序正确的重组质粒pSVl. 0-TFF2转染进入293FT细胞，转染试剂为TurboFect， 培养基为DMEM完全培养基（10%FBS和1%P.S. )，37 °C孵箱培养72h后将细胞取出，收集细胞 到预冷的EP管中，并以RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并在上清中加入5 XSDS Loading Buffer，沸水浴中加热10分钟使蛋白变性，瞬时离心后将上清作为点样样品。后通过SDS-聚 丙烯酸胺凝胶电泳（SDS - PAGE)分离蛋白，分离胶浓度为15%。电泳的电压为70 V，时间为 30-40分钟（以marker开始分离为标志），待溴酚蓝迀移出浓缩胶位置后，将电压调至110 V，1 h30分钟后关闭电源，并进行转膜，恒流200 mA，时间1.5小时。转膜完毕后，将PVDF正 面膜(与胶接触的面)作好记号，并置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1小时。后加入合适稀释 比例的一抗(TFF2:1:400或β-actin: 1:1000)，采用5%脱脂奶粉稀释，置于摇床4 °C孵育过 夜。用0 · 05%PBST洗膜后加入二抗，TFF2-羊抗兔（1:3000) ;β-Actin-羊抗鼠（1: 3000)，5%脱 脂奶粉稀释，室温摇床孵育1小时后洗膜，对膜进行显色，胶片采用定量分析仪曝光2分 钟，记录并分析显色结果。结果表明（图3B)，细胞大量表达TFF2蛋白，并被分泌到细胞上清 中，浓缩后，在滤过废液中不含TFF2蛋白。为了定量TFF2的浓度，我们采用U