鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学交叉领域，具体来说是一种鲍曼不动杆菌联合亚 单位蛋白疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 鲍曼不动杆菌存在于医院环境并在患者多部位定植，导致引起医院获得性肺炎、 血流感染、腹腔感染、脑膜炎、皮肤软组织感染和泌尿系感染等。由于其强大的获得耐药性 及克隆传播能力，鲍曼不动杆菌已成为全球流行并呈高度耐药的常见致病菌。在我国，鲍曼 不动杆菌已经成为医院感染最常见的病原菌之一，2013年中国CHINET细菌耐药性监测显示 鲍曼不动杆菌检出率为11.97 %，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其中大多数为多重耐 药菌(对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.8%和59.4%;对头孢哌酮舒巴坦、米诺环 素和左氧氟沙星的耐药率分别为36.4%、41.8%和43.4%)。全耐药鲍曼不动杆菌的出现和 不断增多已成为临床面临的另一重大挑战，XDR鲍曼不动杆菌主要分布于重症监护病房或 烧伤病房，显著增加患者住院费用，延长患者住院时间，并导致感染患者陷入无药可用的困 境。当前新的有效抗菌药物研发严重滞后，新的针对性的治疗手段刻不容缓。近年来，国内 研究主要聚焦在监测鲍曼不动杆菌耐药性动态变化及耐药机制的研究，国外研究则涵盖了 耐药机制、致病机理、耐药变化等方面，关于疫苗的研究则包括灭活疫苗、外膜蛋白疫苗、基 因重组疫苗和荚膜多糖疫苗。McConnell、Bomerger等人的研究结果表明IWC( inactivated whole cell灭活全菌）、0MC(outer membrane complex外膜蛋白复合物）、0MV(outer membrane vesic 1 e外膜囊泡)免疫的小鼠均能抵抗鲍曼不动杆菌的侵袭。然而由于所含成 分繁多且复杂，在生产过程中难以标准化疫苗剂量;而且其中脂多糖（内毒素)含量过高，可 产生明显的毒副作用。对应的重组蛋白疫苗诸如Bap (biofilm associated protein生物膜 相关蛋白）、OmpA ( outer membrane protein A外月莫蛋白 A )和 A t a (t r imer i c autotransporter protein三聚体自转运蛋白）均为保守基因表达产物，具有高度同源性， 并覆盖了较大部分的鲍曼不动杆菌毒株，表现了良好的免疫效果，且成分单一、重复性好、 产品批间差异小、易于控制细菌内毒素含量等优势，但单一成分疫苗可能免疫保护不足，并 易将鲍曼不动杆菌置于强大的选择压力下诱导细胞膜靶蛋白下调，出现免疫逃避导致疫苗 最终失效。
[0003] 多种革兰阴性菌基因组中小蛋白A(small protein A，SmpA)几乎都有同源性表 达，SmpA是鲍曼不动杆菌细胞膜重要成分之一;SmpA被认为是维持细胞膜完整的重要结构， 是外膜形成过程中重要的功能配件。磷脂酶D(phospholipase D，PLD)被证实在病原菌血源 传播的过程中发挥了重要的作用，同时，研究证明PLD是鲍曼不动杆菌的重要致病因子。逆 向免疫学提示SmpA和PLD可以作为一个良好的蛋白疫苗靶点。此外，SmpA和PLD均可诱导机 体产生免疫应答，SmpA抗体可破坏体内鲍曼不动杆菌细胞膜的完整性，PLD抗体可灭活PLD 活性，减低体内鲍曼不动杆菌毒力，两者协同作用可发挥更完善的保护作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗及其制备方法。利用 免疫信息学和逆向遗传学，分析多重耐药鲍曼不动杆菌的外膜蛋白成分的抗原性和免疫原 性，进行基因克隆，蛋白表达、纯化以及免疫学研究，筛选出有效的外膜蛋白成分鲍曼不动 杆菌外膜蛋白small protein A(SmpA)、鲍曼不动杆菌磷脂酶D(PLD)，并予以联合，提高疫 苗的安全性和有效性，较以往疫苗有更现实和诱人的应用前景。
[0005] -种鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗，是由如SEQ ID No . 1所示的鲍曼不动杆 菌SmpA和如SEQ ID No . 2所示的鲍曼不动杆菌PLD核酸序列，分别连入表达载体，分别构建 SmpA和PLD重组质粒，分别诱导表达重组SmpA和PLD蛋白（蛋白序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No. 4)，再将两种蛋白混合佐剂制备的疫苗。
[0006] 所述的鲍曼不动杆菌联合亚单位蛋白疫苗的制备方法：
[0007] (1)根据SmpA、PLD基因序列，设计合成SmpA、PLD序列引物，在两端引物分别引入 Nde I和Xho I的酶切位点，PCR合成SmpA和PLD基因；
[0008] (2)回收纯化PCR产物，TA克隆至载体pMD 18-T，构建克隆载体pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，并将其转化到E.coli BL21中，PCR筛选阳性转化子，小量提取质粒，经酶切鉴定测 序；
[0009] (3)用Nde I和Xho I双酶切测序正确的pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，与经同样酶切 的pET28b质粒用T4 DNA连接酶连接，构建表达质粒pET28b-SmpA和pET28b-PLD，并将其转化 到表达宿主E. co 1 i BL21 (DE3)中，PCR筛选阳性转化子；
[0010] (4)将阳性单菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，IPTG诱导表达重组SmpA和重 组PLD蛋白；
[0011] (5)SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白；
[0012] (6)采用离子交换层析法纯化重组蛋白并去除内毒素；
[0013] (7)重组的SmpA蛋白和重组PLD蛋白混合后，再与佐剂混合制备疫苗。
[0014] 步骤(7)具体是将重组的SmpA蛋白25yg和重组PLD蛋白5yg混合后，再与1 %氢氧化 错溶液按质量比1:1混合制备疫苗。
[0015] 本发明在GenBank中检索到的ATCC19606来源SmpA基因序列和PLD基因序列，SmpA 蛋白（转录基因名称ABAYE2921，GeneBankID: CAM87743.1)和PLD蛋白（转录基因名称A1 S_ 2989,Genebank ID：AB013392.1)〇
[0016] 本发明重组质粒构建：
[0017] ⑴在GenBank中检索到的ATCC19606来源SmpA基因序列和PLD基因序列，设计合成 SmpA和PLD序列的引物，并在两端引物分别引入Nde I和Xho I酶切位点；
[0018] (2)以测序正确的质粒为模板，以pfu酶进行PCR扩增，引入酶切位点；
[0019] (3)反应条件：94°C 预变性 5111丨11，941€3〇8,511€3〇8,721€3〇8,30个循环，72°(：延伸 1 Omin，1.5 %凝胶电泳后回收纯化PCR产物；
[0020] (4)用Nde I和Xho I双酶切PCR产物，所得产物与经同样酶切的pET28b质粒用T4 DNA连接酶连接并转化至表达宿主E. col i。
[0021 ]本发明重组蛋白的原核表达及纯化过程具体如下：
[0022] (1)取lul重组的pET28b质粒转化BL21(DE3)，42°C热击90s后冰上静置2min后涂含 有30ug/mL卡那霉素的培养基平板，37°C培养过夜；
[0023] (2)挑取转化了重组质粒的表达菌株BL21(DE3)的单菌落于装有4mL含有30ug/mL 卡那霉素的LB培养基的试管中，37°C，220rpm过夜培养；
[0024] (3)将培养的菌液按体积比1:100的比例接种于LB液体培养基中，添加30ug/mL卡 那霉素，37°C，220rpm培养，当0D值达到0.6左右时，添加终浓度为0.2mM的IPTG，37°C， 220rpm，5h，离心收集细胞菌体；
[0025] (4)收集菌体并用PBS缓冲液悬浮；
[0026] (5)SDS-PAGE 电泳检测；
[0027] (6)将收集的细菌菌体用破碎Buffer溶解，破碎Buffer配方为50mM Tris，300mM NaCl，0.1%Triton 乂-114 4!1 = 8.0，冰浴中超声破碎菌体，功率5001，25111丨11，超声28，暂停 6s为一个循环;超声完毕，12000rpm/min，4°C离心20min，弃上清，沉淀再用加尿素的破碎 Buffer溶解（8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，0.1%Triton Χ-114，ρΗ = 8·0)，冰浴中超声 破碎菌体，功率500W，25min，超声2s，暂停6s为一个循环;超声完毕，12000rpm/min，4°C离心 20min，上清用于亲和层析；
[0028] (7)取10mL Ni-NTA，用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/ min，Binding Buffer配方为：8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，pH=8.0;
[0029] (8)样品上柱，流速为2mL/min;
[0030] (9)上样结束后，用10倍柱体积的去内毒素 buffer冲洗柱子，去内毒素 buffer配 方:8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，l%Triton Χ-114，ρΗ=8·0;
[0031 ] (10)用 10倍体积的Wash Buffer清洗柱子，流速2mL/min;Wash Buffer配方为：8Μ 尿素，50mM Tris，300mM NaCl，20/50咪唑，ρΗ=8·0;
[0032] (ll)Elution Buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液；Elution Buffer配方为：8M 尿素，50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，ρΗ=8·0。
[0033] 本发明实施例中尝试将两种蛋白分别与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠，收集免疫 后小鼠血清，进行ELISA检测鲍曼不动杆菌SmpA和PLD抗体滴度，发现经SmpA和PLD免疫后体 内均产生了较高的抗体水平。然后将两种蛋白一起与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠，小鼠 雾化吸入临床分离的鲍曼不动杆菌，观察72h，在小鼠肺组织中细菌负荷在联合免疫组较对 照组降低1〇 2倍，优于单用PLD免疫组（10倍)和单用SmpA免疫组(几乎无变化），且在血清中 炎症因子水平显著降低，肺组织炎症细胞浸润明显减少。显示了该联合疫苗具有更高的免 疫原性。而且将SmpA和PLD免疫后小鼠抗血清通过尾静脉注射进入小鼠体内，在以临床分离 的耐药鲍曼不动杆菌感染，发