剂处理的细胞中的细胞核更大;在 拉帕酚F处理的细胞中还注意到凋亡片段细胞核（图2B，右侧，箭头）。这些结果表明拉帕酚F 诱导细胞周期阻滞在且它还触发肿瘤细胞亚群中的细胞死亡。
[0058] 拉帕酚F通过调控关键的细胞周期调控因子影响周期进程。我们研究了拉帕酚F诱 导细胞周期阻滞的分子机制。图3A-D显示细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制因子p21和 P27在拉帕酚F处理的细胞中的表达水平明显升高，而CDK2、细胞周期蛋白B和CDK1在不同的 细胞株中的水平明显降低。确定的是CDK2活性对于G1/S转换是至关重要的；而p21和p27诱 导阻止G1/S转换；另一方面，G^M转换需要细胞周期蛋白B/CDK1活性且有丝分裂的早期需 要细胞周期蛋白B/CDK1。
[0059]拉帕酚F对凋亡信号转导的影响。上述结果表明拉帕酚F不仅诱导GjPGdH胞周期 阻滞还触发肿瘤细胞群体的亚群中的细胞死亡。接下来，我们试图检测拉帕酚F对凋亡信号 转导的影响。我们发现拉帕酚F引起HeLa细胞中半胱天冬酶9和3激活（图4)。然而，在MCF-7 细胞中对于半胱天冬酶8和9没有发现半胱天冬酶激活的明显证据。由于外显子3中的基因 敲除，在MCF-7细胞中没有检测到半胱天冬酶3。在拉帕酚F处理的MDA-MB-231细胞中观察到 半胱天冬酶8、9和3的激活（图4)。因此，这些结果提供表明拉帕酚F激活一些细胞类型中的 凋亡信号转导的生化证据。
[0060] P21对拉帕酚F介导的G2-阻滞和细胞周期蛋白B/⑶K1下调是至关重要的。已经确 定的是作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的P21在调控G1向S的转换中发挥着重要作 用。然而，很少研究口21在62-1转换中的作用。我们的上述结果表明p21诱导与细胞周期蛋白 B和⑶K1的下降以及拉帕酚F处理的RK0和MDA-MB-231细胞中的G2阻滞同时发生（图3)。先前 的研究已经显示由组蛋白脱乙酰酶抑制因子丁酸盐介导的细胞周期蛋白B的下调需要p21 诱导;且T-钙粘蛋白介导的62阻滞也需要p21。因此我们试图确定p21诱导是否对拉帕酚F介 导的CDK1/细胞周期蛋白B抑制和6 2细胞周期阻滞发挥作用。在本文中，我们首先使用p21- 敲除的细胞研究缺失P21是否影响细胞周期蛋白B和CDK1在拉帕酚F处理的细胞中的表达水 平。图5A显示由拉帕酚F引起的细胞周期蛋白B和CDK1的下降在p21-缺陷(ρ2ΓΛ)细胞(泳道 4)中被明显消失。我们还使用慢病毒介导的RNAi敲除方法研究p21敲除对细胞周期蛋白Β和 CDK1调控的作用。如图5B所示，在拉帕酚F处理后的任意序列RNAi细胞(泳道2)中观察到的 细胞周期蛋白B和CDK1的下降在p21敲除的细胞(泳道4和6)中被削弱。我们进一步研究了 P21敲除是否对拉帕酚F介导的G2阻滞有影响。如图5C和5D所示，通过靶向p21转录的不同区 域的两种不同的shRNA进行的p21敲除显著降低了阻滞于6 2期的细胞的群体。这些结果表明 P21对于拉帕酚F介导的细胞周期蛋白B和CDK1的抑制以及G2阻滞是至关重要的。
[0061]拉帕酚F在转录水平以不依赖于P53的方式使P21上调。我们接下来研究拉帕酚F在 转录水平或后转录水平是否使P21上调发生。图6显示p21mRNA(6A)和蛋白（6B)的水平在拉 帕酚F处理的细胞中均有所提高。这些结果表明在转录水平发生拉帕酚F介导的p21上调，尽 管不能排除在后转录水平发生其他调控。然后我们确定拉帕酚F使p21mRNA水平升高是否归 因于对p21启动子的诱导活性。用拉帕酚F处理或未用拉帕酚F处理后对引入了 p21启动子荧 光素酶构建体的细胞进行荧光素酶活性的检测。如在图6C中所看到的，在用拉帕酚F处理 后，P21启动子活性在四种不同的细胞株(狀0、1?^-7、他1 &、1?^-1?-231)中被显著增强。值 得注意的是，RK0和MCF-7细胞表达野生型p53、MDA-MB-231细胞在280密码子(精氨酸至赖氨 酸)处具有P53突变，HeLa细胞拥有使p53失活的人类乳头瘤病毒。为了进一步确定拉帕酚F 介导的P21上调是否是p53依赖性的，使用RKO p53-精通(ρ53+Λ)和p53-缺陷(p53+)细胞研 究口21的启动子活性。如图60所示，拉帕酚?导致?53 +/+细胞中？21启动子的3.5倍诱导。有趣 的是，尽管相比于未处理的P53-精通(ρ53+Λ)细胞中p21的基础水平，未经处理的p53-缺陷 (P53+)细胞中的p21的基础水平显著较低，拉帕酚F能够使p53+细胞中p21启动子活性上 调8.3倍（图6D)。虽然p53可能有助于p53精通细胞中的p21调控是仍有可能的，但是我们的 数据表明拉帕酚F介导的p21转录诱导可能以不依赖于p53的方式发生。
[0062] 拉帕酚F通过降低突变型-p53的半衰期抑制突变型-p53。已经确定的是突变型-P53不仅失去了作为肿瘤抑制因子的功能，而且获得了有助于致癌性转化的致癌潜力。接下 来，我们试图确定拉帕酚F对突变型-p53是否具有调控作用。如图7所示，拉帕酚F似乎对 MCF-7细胞中野生型-p53的水平没有显著影响（图7A)但显著降低了 MDA-MB-231细胞中突变 型-P53的水平(B)。为了进一步检测拉帕酚F对p53表达的作用，我们检测了三种其它表达野 生型-p53(RK0)或突变型-p53(MDA-MB-468，T47D)的肿瘤细胞株。如图7C所示，拉帕酚F并没 有显著影响RK0细胞中野生型-p53的表达水平，而MDA-MB-468和T47D细胞中拉帕酚F处理强 烈抑制了突变型-P53。我们还检测了拉帕酚F下调突变型-p53水平的可能机制并为此研究 了拉帕酚F对突变型p53蛋白的稳定性的作用。如图7D-7F所示，拉帕酚F处理导致突变型-p53蛋白半衰期的下降，突变型-p53蛋白半衰期从未经处理的细胞中的>8小时降低至处理 过的MDA-MB-231细胞中的~3小时（图7D和7E)。且在用拉帕酚F处理的T47D细胞(表达突变 型p53)中也观察到相同的结果（图7F和7G)。这些结果表明拉帕酚F处理至少部分通过降低 突变型-P53蛋白的半衰期下调了突变型-p53的水平。这些结果还表明拉帕酚F部分通过其 对降低突变型-P53水平的作用似乎导致肿瘤细胞生长抑制。
[0063]拉帕酚F显著下调包括c_My、MDM2和HuR的多种其他致癌蛋白的表达。我们检测了 拉帕酚F对c-My、MDM2和HuR的蛋白表达的作用。这些蛋白通常在人类癌症中过度表达且在 致癌过程中发挥重要作用;且它们还对保持癌细胞的致癌表型很重要。c_Myc和MDM2是抗癌 药物开发的重要靶标。HuR也已被证明是癌症发展的决定因素且在多种人类癌症类型中的 肿瘤侵袭中发挥重要作用。呈现于图8中的我们的结果表明拉帕酚F强烈下调这些癌基因蛋 白。我们的结果表明通过抑制包括上述突变型-p53、c-Myc、MDM2和HuR的多种致癌蛋白以及 细胞周期进程启动子（如CDK1、CDK2、细胞周期蛋白B)，拉帕酚F可以有效地抑制癌细胞生 长。拉帕酚F抑制多种致癌靶标的能力令人意想不到且是这种新型抗癌药物的重要优势。
[0064] 拉帕酚F抑制动物体内的肿瘤生长。使用HeLa细胞作为裸鼠内的异种移植物，我们 还研究了拉帕酚F对体内肿瘤生长的作用。肿瘤细胞接种九天后，每天用溶剂或拉帕酚F (5mg/kg或10mg/kg)对小鼠进行一次静脉注射并持续15天。我们的结果（图9)揭示在接受拉 帕酚F处理的小鼠体内显著抑制肿瘤生长。如图9A所示，药物处理15天后，相对于溶剂处理 群组，拉帕酚F抑制54%(5毫克/千克/天，？〈0.001小=7)和64%(10毫克/千克/天，？〈 0.001，N=6)的肿瘤生长。图9还显示拉帕酚F剂量从5毫克/千克/天增加至10毫克/千克/天 进一步降低了肿瘤体积和重量。重要的是，我们没有观察到给予15天的拉帕酚F(5毫克/千 克/天和10毫克/千克/天)处理的小鼠致死或体重减轻（图9D)。这些结果表明给以小鼠的拉 帕酚F耐受性良好且抑制体内肿瘤生长。因此我们的结果首次表明拉帕酚F能够有效地抑制 移植在动物上的人类肿瘤(HeLa肿瘤)并因此提供表明拉帕酚F具有开发为用于治疗人类癌 症的抗癌药物的很大潜力的重要信息。
[0065] 尽管通过具体的实施方式描述了本发明，但本领域技术人员将认识到可以对本发 明进行常规修改且这样的修改意在成为本公开的范围之内。
【主权项】
1. 一种减少癌细胞生长的方法，包括向需要治疗的个体给药有效量的药学上可接受的 载体中的拉帕酚F。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述拉帕酚F通过避免首过代谢的途径给药。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述途径包括静脉内、肠胃外、肿瘤内、肺内、鼻内、 卢页内和皮下。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述给药在化疗、手术治疗或放射治疗之前进行， 与化疗、手术治疗或放射治疗同时进行，或继化疗、手术治疗或放射治疗之后进行。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述个体对用化疗药物进行的治疗没有响应。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞表现为突变型-p53或野生型p53。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞在肿瘤内。
【专利摘要】提供了一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向需要治疗的个体给药包括治疗有效量的拉帕酚F的组合物。还提供了包括拉帕酚F和药学上可接受的载体的组合物。
【IPC分类】A61K31/015
【公开号】CN105592845
【申请号】CN201480038463
【发明人】黄英, 胡英杰, 孙清, 刘抗伦, 沈小玲, 赛义德·M.·舍克
【申请人】纽约州立大学研究基金会, 广州中医药大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年5月6日
【公告号】EP2994118A1, WO2014182653A1, WO2014182653A8