猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，本发明具体设及一种猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂 灭活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（Transmiss;Lble gastroenteritis of pigs,TGE)是由猪传染性 胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)引起的高度接触性 传染病，该病显著的临床症状为严重腹泻、呕吐和脱水等。此病属于国际兽医局（OIE)法典 中B类疫病。各品种和各饲养阶段的猪对本病均易感，运是由于仔猪的肠道内还没有建立起 稳定的微生态系统，自身抵抗力较弱，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响， 其中两周龄W内的仔猪死亡率最高，可达100%。而随着日龄的增加，5周龄W上仔猪死亡率 开始降低，成年猪几乎没有死亡，但有很多不良后果，常常造成饲料报酬率和生产性能下 降，运给畜牧业带来极大的经济损失。1946年，Doyle和化t化ings两位学者在美国首次对该 病作了比较详细的报道，1956和1957年，该病相继在日本和英国发生。随之欧洲、美洲W及 亚洲的大部分国家相继报道了本病。从此，该病受到世界各个国家的高度关注和重视，而我 国就本病的报道始于上世纪60年代末。近年来该病毒与轮状病毒、流行性腹泻病毒混合感 染的流行的趋势加剧。我国多数省份均有本病的发生，给中国养猪业乃至整个畜牧业带来 了严重危害。
[0003] TGE是一种局部感染性疾病，该病治疗效果差，重在预防。实际生产常采用疫苗接 种来获得免疫保护力，但畜牧行业目前所使用的疫苗在不同程度上存在免疫效果不理想， 潜伏感染，重组复活，毒力返祖W及排毒散毒等不足。研发新型、安全性疫苗，从而达到有效 防制TGE是一个亟需解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗及其制备方 法。
[0005] 本发明的技术方案是:猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗，所述疫苗由灭 活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂W质量比为1:2-3的比例混合制成。
[0006] 所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为Img/ml。
[0007] 所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。
[000引所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：
[0009] (1)将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；
[0010] (2)制备纳米硅胶；
[0011] (3)将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6 °C静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗。
[001^ 所述步骤(2)中将正娃酸乙醋和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调pH为9-10,将 氨水加入到反应液中，在转速为750-80化pm的条件下，揽拌3~5分钟，然后在200-4(K)rpm的 条件下揽拌12至16h，得到纳米硅胶。
[0013] 本发明的有益效果在于:本发明在18只6周龄SPF级昆明乳鼠和猪体上对疫苗进行 安全评价，其中粒径70皿、150皿的纳米娃TGEV灭活疫苗组诱导的I gG和I gA的抗体水平均高 于其它各实验组，其中150皿组的抗体水平最高;在对CD4+/CD8+比值的检测结果表明，在首 免后第1周，70皿组CD4+/CD8+比值明显高于其它各试验组;在第2周，70皿组和油乳剂组CD4 +/CD8+比值较高，明显高于市售侣胶佐剂组。运说明各试验均能加强小鼠的细胞免疫状态， 其中佐剂为纳米二氧化娃的70nm组免疫增强效果最佳。本发明猪传染性胃肠炎病毒纳米娃 佐剂疫苗具有无遗传毒性，无免疫原性，不引起机体产生免疫反应，可祀向输送药物，有缓 释作用的优越性。
【附图说明】
[0014] 图1为粒径为70nm纳米的二氧化娃电镜图X60000;
[0015] 图2为粒径为150nm纳米的二氧化娃电镜图X60000;
[0016] 图3为免疫后不同时间血清中IgG含量标准曲线；
[0017] 图4为特异性IgG抗体含量标准曲线；
[0018] 图5为免疫后不同时间血清中IgG含量；
[0019]图6为IgA含量标准曲线；
[0020] 图7为免疫后不同时间血清中IgA含量；
[0021] 图8为免疫后小鼠外周血CD3+细胞所占百分比；
[0022] 图9为免疫后小鼠外周血CD4+细胞所占百分比；
[0023] 图10为免疫后小鼠外周血CD8+细胞所占百分比；
[0024] 图11为免疫后小鼠外周血CD4+/CD8+的动态变化。
【具体实施方式】
[0025] 猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗，所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病 毒液与纳米硅胶佐剂W质量比为1:2-3的比例混合制成。
[00%] 所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为Img/ml。
[0027] 所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。
[0028] 所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：
[0029] (1)将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；
[0030] (2)将正娃酸乙醋和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调抑为9-10,将氨水加入到 反应液中，在转速为750-8(K)巧m的条件下，揽拌3~5分钟，然后在200-40化pm的条件下揽拌 12至1611，得到纳米硅胶；
[0031] (3)将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6 °C静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米娃佐剂灭活疫苗。
[0032] 本发明具体操作如下：
[0033] -、不同佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备
[0034] 1材料与方法
[0035] I. I材料
[0036] 1.1.1病毒株和细胞株
[0037] ST细胞购自中国兽药监察所，由本试验室冻存;猪传染性胃肠炎病毒(TGEV HN-2012)由河南省动物性食品安全重点试验室分离鉴定、纯化并保存。
[003引 1.1.2试验动物
[0039] 6周龄SPF级昆明乳鼠18只，购自河南省试验动物中屯、；许可证号为：SCXK(豫） 2010-0002;编码为 No. 41003100000673。
[0040] 1.1.3主要仪器
[0041 ] 小型台式离屯、机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国 MiLLipore公司;AB204-N电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SZ-93自 动双重纯水蒸馈器，购自上海亚荣生化仪器厂;超净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公 司；LEICA DMIL倒置显微镜，购自德国莱卡公司；0)2培养箱，购自美国化ermo化rma公司； fj200s数显高速分散均质机，购自上海索映仪器设备有限公司。
[0042] 1.1.4主要试剂
[0043] "四季青"胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI-1640培养液购自 GIBCOBR公司；甲醒溶液(分析纯)购自西晚化工股份有限公司；0.25%膜蛋白酶、吐溫-80均 购自Solarbio公司；司本-80购自上海申宇医药化工有限公司;M0NTANIDE ISA206VG成品白 油佐剂为法国赛比克公司产品；正娃酸四乙醋(TEOS)购自国药;氨水购自烟台市双双化工 有限公司；无水乙醇购自原天津市化学试剂S厂。纳米二氧化娃溶胶(粒径为70nm、150nm) 购自南京东检生物有限公司。
[0044] 1.2 方法
[0045] 1.2.1ST细胞复苏及传代培养
[0046] 在无菌条件下，将冻存的ST细胞从液氮罐中取出，立即投入37°C水浴中适当晃动， 使冰冻的细胞迅速融化(60s内）。1500巧111离屯、IOmin后用75%酒精将冻存管壁进行消毒，弃 去冻存液，再转入细胞培养瓶中，加入适量的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，吹打细 胞进行充分悬浮，置于5%、37°C恒溫培养箱中培养，她~12h后更换营养液，然后继续放置 于5 %、37 °C恒溫培养箱中培养。待细胞铺满细胞瓶后，用0.25 %膜蛋白酶消化3~5min，经 倒置显微镜下观察，待大部分贴壁的扁平细胞变圆并有少许细胞开始脱落时加营养液停止 消化，加入少许营养液吹打数次至分散成单个细胞时，吸取适量细胞悬液至另一干净的细 胞培养瓶中，继续培养4~5代，待ST细胞适应培养环境并且形态较好时即可使用。
[0047] 1.2.2TGEV病毒的增殖
[004引常规方法培养ST细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液作为ST细胞的培养 液(pH 7.2~7.4);采用非同步接种猪传染性胃肠炎病毒化N-2012株)第10代病毒液进行细 胞传代培养病毒，IO5TCIDso接毒W 5M尋其置于5%C02,37。直溫培养箱中进行吸附，吸附1~ 化后加维持液，换成含2 %胎牛血清的RPMI-1640培养液，继续培养24~36h，待贴壁细胞出 现80 %的C阳时收获病毒，将收获的病毒反复冻融