15]2.正常人肝微粒体CYP2E1代谢活性
选用CZX、DMN和DEN三种底物，检测83例正常人肝微粒体CYP2E1的代谢活性。
[0016]2.1 CYP2E1 对 CZX 的代谢底物:CZX;
代谢产物:6-0H-CZX;
色谱条件:色谱柱为Diamond C18柱(5μηι，46mm X 200mm)，流动相为甲醇:水(55:45)，流速为Iml.min—^UV检测波长287nm。
[0017]样品处理:孵育体系总体积为ΙΟΟμΙ，包括不同浓度的CZX、肝微粒体蛋白(终浓度0.3mg.1111—1)，磷酸盐缓冲液(终浓度10011^，？!17.4)，1^(:12(终浓度511^)40了4(终浓度0.1禮)。预孵育511^11，加入熟0?!1启动反应，37°(:孵育301^11，放入冰水中终止反应，加入11111乙酸乙酯，祸旋混合3min，4500rpm离心lOmin，吸取上层有机相0.8ml，于40°C氮气吹干，100μ I流动相复溶，取60μ1进样。
[0018]标准曲线:于孵育体系中加入系列浓度的6-0H-CZX对照品溶液10μ1，终浓度分别为16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5口1，按“样品处理”项操作(不加嫩0?!0。以样品峰面积(六)为横坐标，样品浓度(C)为纵坐标求其回归方程。
[0019]专属性:观察在该色谱条件下微粒体中杂质是否干扰样品峰的测定。
[0020]精密度:于90 μ?微粒体中加入系列浓度的6-0H-CZX对照品溶液10μ1，配制成高、中、低系列浓度16、4及ΙμΜ的溶液，按“样品处理”项操作，测定日内、日间精密度。
[0021]回收率:于90μI微粒体中分别加入系列浓度的6-0H-CZX对照品溶液10μI，配制系列浓度为16、4及ΙμΜ的溶液，按“样品处理”项下操作，测定样品峰面积(Al)。另取与上述等量的6-0H-CZX对照品，不经提取，溶解后直接进样，测定样品峰面积(Α2)。两组峰面积之比(Al/ Α2)即为微粒体中6-0H-CZX的提取回收率。
[0022]稳定性:于空白微粒体中分别加入系列浓度的6-0H-CZX对照品溶液，配制系列浓度为16、4及ΙμΜ的溶液。分为4组:第I组按“样品处理”项下操作;第2组，室温下放置4h;第3组，-30°C反复冻融3次;第4组-30°C冷冻I周。分别按“样品处理”项下操作后测定考察6-0H-CZX在上述条件下的稳定性。
[0023]最适蛋白浓度的确定:反应体系中加入微粒体蛋白，其浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.lS0.5mg.1111^,37 °C水浴分别孵育30min。考察微粒体蛋白浓度对CZX代谢的影响。
[0024]最适反应时间的确定:反应体系(蛋白浓度0.3mg.ml—1)中加入NADPH启动反应，于37 0C水浴分别孵育5、10、20、30及40min，考察孵育时间对CZX代谢的影响。
[0025]人肝微粒体CYP酶动力学参数的测定:反应体系中底物CZX的浓度为7.8?500μΜ，以代谢产物的生物转化程度(TR)为反应速度，计算KjPVmax<3TR(pmol.min—1.mg—1MAC父1000)/(8\1')，其中厶(:为代谢产物6-0!^2乂的浓度化10，8为微粒体蛋白的浓度(1^.ml—1)，!'为孵育时间(min);
采用上述检测条件，测定83例正常人肝CYP2E1代谢CZX的固有清除率。
[0026]2.2 CYP2E1 对DMN的代谢底物:DMN;
代谢产物:2，4-二硝基苯肼甲醛腙；
色谱条件:色谱柱为Diamond C18柱，(5μηι，46_Χ 200mm)，流动相为甲醇:水(70:30)，流速为Iml.min—^UV检测波长356nm。
[0027]样品处理:孵育体系总体积为ΙΟΟμΙ，包括不同浓度的DMN、肝微粒体蛋白(终浓度0.3mg.1111—1)，磷酸盐缓冲液(终浓度10011^，？!17.4)，1^(:12(终浓度511^)40了4(终浓度0.1禮)。预孵育511^11，加入熟0?!1启动反应，37°(:孵育201^11，放入冰水中终止反应，加入11111二氯甲烧，祸旋混合3min，4500rpm离心1min，吸取下层有机相0.8mI，于40°C氮气吹干，100μ?流动相复溶，取Ι0μ?进样。
[0028]标准曲线:于孵育体系中加入系列浓度的甲醛溶液10μ1，终浓度分别为2500、1250、625、312.5、156、78、39和184]?，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60°(:，孵育201^11，按“样品处理”项操作(不加NADPH)。以样品峰面积(A)为横坐标，样品浓度(C)为纵坐标求其回归方程。
[0029]专属性:观察在该色谱条件下微粒体中杂质是否干扰样品峰的测定。
[0030 ] 精密度:于90 μ I微粒体中加入10μ I的甲醛(不加NADPH )，配制成甲醛的系列浓度为18、156和1250μΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60 °C孵育20min，按“样品处理”项下操作，测定日内、日间精密度。
[0031 ]回收率:于90μ1微粒体中分别加入?ομ?的甲醛(不加NADPH)，配制成甲醛的系列浓度为18、156和1250μΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60 °C孵育20min，按“样品处理”项下操作，测定样品峰面积(Al)，另取10μ1的甲醛(不加NADPH)，配制成甲醛的系列浓度为18、156和1250μΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，不经提取，直接进样，测定样品峰面积(Α2)。两组峰面积之比(Al/ Α2)即为微粒体中2，4_二硝基苯肼甲醛腙的提取回收率。
[0032]稳定性:于空白微粒体中分别加入10μ1的甲醛(不加NADPH)，配制成甲醛的系列浓度为18、156和125(^11的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60 °C孵育20min，将样品分为3组，按“样品处理”项下操作第一组立刻进样，第二组室温下放置4h进样，第三组4°C下放置24h进样。考察在上述条件下放置的稳定性。
[0033]最适蛋白浓度的确定:反应体系中加入微粒体蛋白，其浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.lS0.5mg.1111^,37 °C水浴分别孵育20min。考察微粒体蛋白浓度对DMN代谢的影响。
[0034]最适反应时间的确定:反应体系(蛋白浓度0.3mg.ml—1)中加入NADPH启动反应，于37 0C水浴分别孵育5、10、20、30及40min，考察孵育时间对DMN代谢的影响。
[0035]人肝微粒体CYP酶动力学参数的测定:反应体系中底物DMN的浓度为18?2500μΜ，以代谢产物的生物转化程度(TR)为反应速度，计算KjPVmax<3TR(pmol.min—1.mg—1MAC\1000)/化\1')，其中八(:为代谢产物2，4-二硝基苯肼甲醛腙的浓度化10，8为微粒体蛋白的浓度(mg.ml—1)，T为孵育时间(min);
采用上述检测条件，测定83例正常人肝CYP2E1代谢DMN的固有清除率。
[0036]2.3 CYP2E1 对DEN的代谢底物:DEN
代谢产物:2，4-二硝基苯肼乙醛腙
色谱条件:色谱柱为Diamond C18柱，(5μηι，46_Χ 200mm)，流动相为甲醇:水(60:40)，流速为Iml.min-1，UV检测波长356nm。
[0037]样品处理:孵育体系总体积为ΙΟΟμΙ，包括不同浓度的DEN、肝微粒体蛋白(终浓度0.3mg.1111—1)，磷酸盐缓冲液(终浓度10011^，？!17.4)，1^(:12(终浓度511^