白细胞介素35在制备抗病毒药物的用图
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于医药技术领域，涉及白细胞介素35(interleukin-35，IL-35)的药物新 用途，具体是其在制备抗病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 白细胞介素-35是IL-12家族的新成员，由IL-27的β链EBI3(EB病毒诱导基因3)和 IL-12的α链P35组成，最早在BJAB B淋巴细胞、C0S7细胞及胎盘滋养层细胞中发现分泌型的 EBI3及p35,2007年，研究人员在分子水平上将EBI3和p35通过3xGGGGS的柔性结合肽段连接 起来，并命名为IL-35JL-35的受体是由IL-12Ri32和gpl30组成的异源二聚体，或他们各自 形成的同源二聚体。在过敏性哮喘、多发性硬化症、结节病等疾病中发现IL-35的表达。
[0003] I型干扰素包括IFNa、IFNP、IFN-δ、IFN-ε、IFN-δ、IFN-K、IFN-v、IFN-τ、和IFN- ω。I 型干扰素运用两条信号通路，Toll样受体(TLRs)和胞衆受体(cytosolic receptor)。1型干 扰素有多种功能，例如抗病毒、抑制细胞生长和免疫调节作用。III型干扰素 （Type III interferon，IFNs)，是一个新型的干扰素家族，坐落在第19号染色体ql3上，包括3种λ干扰 素：IFN-A1 (也被称为 IL-29)、IFN-X2(也被称为 IL-28A)和 IFN-X3(也被称为 IL-28B)<JII 型 干扰素的信号转导与I型干扰素类似，激活Jak/STAT信号通路，转录多种IFN相关的基因。 III型干扰素的抗病毒功能与I型干扰素相比较弱，而且只能针对某些病毒种类，如甲型流 感病毒、VSV、脑心肌炎病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。III型干扰素抑制病毒的复制保 护宿主细胞免于病毒感染。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供IL-35在制备抗病毒药物中的应用。
[0005] 本发明证明IL-35具有抗病毒作用。通过探讨流感病毒感染后诱导IL-35上调表 达，促进I型和III型干扰素表达的抗病毒作用机制；以及IL-35的广谱抗病毒功效。
[0006] 为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案：
[0007] IL-35在细胞和分子水平上对流感病毒复制有抑制作用，预示IL-35可以做为临床 抗病毒药物而进一步研究开发。首先我们在季节性流感病人的临床样本包括血液PBMC和咽 拭子中发现了 IL-35的高表达，且与流感病毒呈正相关。然后我们在A549细胞、人外周血淋 巴细胞和人肺泡二型原代细胞系中，发现A型流感病毒感染时诱导IL-35在mRNA和蛋白水平 上的高表达。IL-35过表达或外源的rhIL-35都能激活I型和III型干扰素的表达，以及干扰 素诱导基因 PKR、0AS、Mx的表达进而抑制病毒的复制，对包括EV71、VSV、IAV等病毒都具有抑 制病毒复制的作用。总体实验首次发现了 IL-35能促进免疫细胞产生干扰素且激活下游通 路而达到广谱抗病毒效果的机制。
[0008] IL-35作为一种新的细胞因子，在多种疾病中发现有表达，其机制及与疾病的相互 关系将不断被发现。本发明揭示了 IL-35的一种新的生物学功能，能够诱导免疫细胞产生干 扰素且激活干扰素下游通路进而发挥广谱抗病毒的作用，这一新发现为研制抗病毒药物提 供理论基础。
[0009]本发明作为开发一种新的抗病毒因子IL-35的方法，具有以下优点和效果：
[0010] 本发明采用体内天然存在的蛋白IL-35，促进人体免疫细胞产生IFNa、正婦和正似 1，具有完备的生物学功能，且不用引入异源性的成分因而不会导致机体产生毒副作用。
【附图说明】
[0011] 图I: IL-35在A型流感病人临床样本中高表达
[0012] A.Real-time PCR检测健康人和IAV病人血液PBMC中IL-35/EBI3mRNA(左）和IL-35/p35mRNA(右）；
[0013] B.Real-time PCR检测健康人和IAV病人咽拭子中IL-35/EBI3mRNA(左）和IL-35/ p35mRNA(右）；
[0014] C.Pearson's correlation assay分析IAV病人血液PBMC中IL_35/EBI3mRNA与IAV NP mRNA相关性(左)和IL-35/p35mRNA与IAV NP mRNA相关性(右）。
[0015] 图2:1六￥诱导几-35在多种细胞中表达
[0016] A.不同剂量IAV感染A549细胞，24h后收集细胞样，Real-time PCR检测IL-35mRNA;
[0017] Β· IAV(MOI = I)感染A549细胞，收集他、611、1211、2411、4811细胞，1^31-衍1116?0?检测 IL-35mRNA；
[0018] C.mock、灭活的IAV，IAV(MOI = I)感染A549细胞，24h后收集细胞，Real-time PCR 检测 IL-35mRNA;
[0019] D. IAV(MOI = I)感染A549细胞，24h后收集细胞上清，ELISA检测IL-35蛋白；
[0020] E .mock、灭活的 IAV，IAV(M0I = 0· 1)感染 PBMC 细胞，12h 后收集细胞，Real-time PCR 检测 IL-35mRNA;
[0021 ] F .mock、IAV(M0I = 1)感染AT-II细胞，24h后收集细胞，Real-time PCR检测IL-35mRNA〇
[0022] 图3:pCMV-IL-35的构建和鉴定
[0023] A ·通过PCR技术将EBI3和p35连接插入pcDNA3 · 1 (-)载体上，构成pCMV-IL-35;
[0024] 8.?〇1^-11^-35电转了虹1^七细胞，1^&1-^1116?0?检测11^-35/^813和11^-35/ p35mRNA；
[0025] C. IL-35ELISA试剂盒检测B中培养上清的IL-35蛋白；
[0026] D·293细胞转染pCMV-IL-35，Westernblot分别用EBI3和p35的一抗检测胞内IL-35蛋白。
[0027] 图4: IL-35诱导I型和III型干扰素表达
[0028] A. Jurkat细胞分别转染vector和pCMV-IL-35，24小时后收集Jurkat细胞，提取 RNA，Real-time 检测 IFNa、IFNP 和 IFNAl 的 mRNA;
[0029] B. PBMC细胞分别转染vector和pCMV-IL-35，24小时后收集PBMC细胞，提取细胞内 总 RNA，Real-t ime 检测 IFNa、IFNP 和 IFNAl 的 mRNA;
[0030] C. Jurkat过表达pCMV-IL-35或vector 36小时，收集上清液，孵育A549细胞12小 时，加 IAV (MO I = 1)感染12小时，收集细胞样检测PKR、OAS、Mx的mRNA;
[0031] D.同E实验，感染24小时，western blot检测胞内PKR、0AS、Mx的蛋白表达;E.rhIL- 35刺激Jurkat细胞，不同时间点收集细胞，Real-time检测IFNa、IFN0和IFNAl的mRNA;
[0032] F .mock或rhIL-35刺激Jurkat细胞24h，收集上清液，孵育A549细胞12小时，加 IAV (MOI = I)感染24小时，western blot检测胞内PKR、0AS、Mx的蛋白表达。
[0033] 图5: IL-35通过Jurkat细胞间接抗病毒
[0034] Jurkat细胞分别转染pCMV-IL-35和Vector，36小时后离心收集上清做抗病毒实 验。
[0035] A.A549细胞用Jurkat上清孵育 12小时，加入IAV(M0I = I)，Real-time PCR检测胞 内IAV三种RNA;
[0036] B.血凝实验检测上清中IAV的滴度；
[0037] C·RD细胞，用Jurkat上清孵育 12小时，加入EV71 (Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR绝对定 量检测EV71的拷贝数；
[0038] D · A549细胞用Jurkat上清孵育12小时，加入重组病毒VSV-eGFP(M0I = 1)，荧光显 微镜观察绿色荧光蛋白的表达；
[0039] E.流式细胞技术检测E中GFP阳性的细胞。
[0040] 图6: IL-35通过PBMC间接抗病毒
[00411 PBMC分别转染pCMV-IL-35和Vector，36小时后离心收集上清做抗病毒实验。
[0042] A·A549细胞用PBMC上清孵育12小时，加入IAV(M0I = I)，Real-time PCR检测胞内 IAV 三种 RNA;
[0043] B.血凝实验检测上清中IAV的滴度；
[0044] C·RD细胞，用PBMC上清孵育12小时，加入EV71(Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR绝对定量 检测EV71的拷贝数；
[0045] D · Vero细胞用Jurkat上清孵育12小时，加入重组病毒VSV-eGFP(M0I = 1)，流式细 胞技术检测GFP阳性的细胞。
[0046] 图7: rhIL-35的抗病毒作用
[0047] 以100ng/ml rhIL-35或对照DMSO刺激Jurkat细胞24小时，收集上清进行抗病毒实 验。
[0048] A.RD细胞，用Jurkat上清孵育 12小时，加入EV71(M0I = l)，Real-time PCR 绝对定 量检