一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺。
【背景技术】
[0002]传统的植物药研究思路一般为繁琐的提取分离，最终需要从提取的复合成分中分离出具有活性的单一成分。然而植物药的相关有效成分往往含量较低，分离步骤繁琐，采用传统的提取方法效率很低，会无法满足后期的研究生产需要。当今分子生物技术已日趋成熟，利用基因工程实现某一目的产物的异源生产已经成为了新的研究热点。近年来，随着提取分离技术的发展，人们从苦瓜中分离到多种具有降血糖、抗突变、抗肿瘤以及提高人体免疫力等功效的核糖体失活蛋白，其中在这些苦瓜蛋白成分中，分子量为30kD的I型核糖体失活蛋白MAP30(Momordica ant1-HIV protein of 30kD)的各项性能优越，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗真菌作用，对人体健康十分有益，可制成一种保健药品。但作为一种蛋白，制成普通的制剂会在胃中被消化破坏，而通过从苦瓜中利用传统方法提取MAP30污染大，效率低，故准备先利用基因工程技术通过工程菌大规模发酵生产活性苦瓜蛋白MAP30，最终制成一种富含活性蛋白MAP30的苦瓜蛋白肠溶片。
【发明内容】
[0003]为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，采用基因工程生产高纯度苦瓜蛋白MAP30，制成极具保健功能的苦瓜蛋白肠溶片；苦瓜蛋白肠溶片不仅避免了传统苦瓜片口感差、易在胃中分解的问题，更减少了传统苦瓜蛋白MAP30提取带来的污染，且这种苦瓜片中有效蛋白MAP30的含量高，更能促进人体的健康。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0005]—种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，包括以下步骤:
[0006]步骤一:苦瓜原料的处理:取适量的成熟苦瓜中的种子，除去种子壳，然后放入研钵中，加入适量的液氮研磨成粉末状，分装得到处理后苦瓜种子粉；
[0007]步骤二:苦瓜种子粉的处理:将步骤一中分装后的苦瓜种子粉，利用CTAB法提取得到苦瓜全基因组，作为PCR反应的模板；
[0008]步骤三:PCR反应的确定:首先根据相关苦瓜蛋白MAP30的基因序列设计相关的引物，并最终确定PCR的条件及体系；
[0009]步骤四:TA克隆:PCR产物回收后进行TA克隆，并导入感受态细胞DH5a，经蓝白斑筛选、菌落PCR，筛选出阳性菌落，提取目标DNA片段后进行双酶切；
[0010]步骤五:表达载体的处理:过夜培养PET-28a，提取表达质粒，并用与步骤四相同的两种酶进行酶切；
[0011]步骤六:连接:将用步骤四与步骤五中相同酶切的片段在SOI ut i on I的体系中进行过夜连接；
[0012]步骤七:将步骤六中的过夜连接的产物导入感受态细胞BL21(DE)，经蓝白斑筛选、菌落PCR，筛选出阳性菌落；
[0013]步骤八:将步骤七中筛选出的阳性菌落放大培养并在IPTG的诱导下进行苦瓜蛋白MAP30的表达；
[0014]步骤九:发酵培养后经一系列处理将步骤八得到的的苦瓜蛋白MAP30进行纯化干燥；
[0015]步骤十:制肠溶片:首先将步骤九中确定发酵得到的苦瓜蛋白MAP30与辅料的比例，最后经粉碎、过筛、配料、混合、湿法制粒、颗粒干燥、压片、包肠溶衣、包装、储存。
[0016]所述步骤一中苦瓜粉分装为:每管中分装的具体量为10-15g。
[0017]所述步骤二中CTAB法的具体过程为:将水浴锅温控钮调至60°C，预热CTAB提取缓冲液—研磨得到的苦瓜粉末转移至1mL预热CTAB提取缓冲液中，60°C下不时晃动离心管，保温lh—冷却片刻，加入1mL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈震荡离心管，10000r/min离心15min—上清液转入装有25mL 100%乙醇的新离心管，轻柔地颠倒混勾—lOOOOr/min离心15min，弃上清，得到DNA沉淀—加700μ1 70%乙醇，70μ1 3mol/L NaAc溶液以漂洗DNA沉淀，然后转至1.5mL Eppendorf—lOOOOr/min离心30s—再用70%乙醇漂洗DNA沉淀，离心30s，弃上清液—室温下挥发乙醇—加入500μ1 TE，4°C过夜溶解DNA—加4-10μ1 RNase Α，颠倒混匀，并在55°C下保温30-60min—加入1.25mL乙醇、54μ1 NaAc，沉淀DNA—离心30s，室温下挥发乙醇—DNA沉淀溶解在300μ1 TE中。
[0018]所述步骤三中引物设计为
[0019]F157-CGTCGACCTGTGGTATGCTTACTACTT-37F2
[0020]57 -GGAATTCTCAATTCACAACAGATTCC-37，引入的酶切位点为SalI和EcoRI。
[0021]所述步骤三中PCR的体系和条件具体分别为:PCR20μ1体系为:ddH20 7μ1、引物各lyl、DNA模板lyl、2XTaq PCR Master Mix 10μ1 ;PCR反应条件为:95°C5min、(95°C30s，58°C30s，722min)35cycle;72°C7min，4°C ⑴。
[0022]所述步骤四中的双酶切体系条件为:质粒DNA 25μ1，SalI和EcoRI分别Ιμ? ,Buffer5μ1，CldH2O 5μ1，混匀，37°Clh。
[0023]所述步骤五中的表达质粒双酶切体系条件为:质粒DNA 25口1，5&1:^阳(301?1分别仏
I,Buffer 5μl,ddH20 5μ1，混匀，37°Clh。
[0024]所述步骤六中经相同酶处理后进行连接的10μ1体系具体为:S0luti0nI5yl，目标DNA 3μ1，表达质粒2yl，16°C过夜连接。
[0025]所述步骤八中IPTG诱导表达的具体条件为:IPTG浓度为0.65mol/L，诱导温度27°C，诱导时间4h。
[0026]所述步骤九中蛋白MAP30纯化步骤具体为:在IPTG诱导表达完毕后，收集菌体，然后用无菌水清洗3次，80Hz频率下进行超声破碎，待到细菌全部破碎，溶液变清亮为止，然后在12000r/min离心15min，收集上清液，然后再利用镍离子柱子手动纯化蛋白，上样后先用50mmol/L PBS(pH7.4)，以60mL/min流速洗涤杂蛋白至基线，然后再分别用50、100和200mmol/L咪唑洗脱，收集各洗脱峰进行SDS-PAGE检测，接着收集得到纯净重组蛋白，冷冻干燥后4 °C保存备用。
[0027]所述步骤十中因考虑到苦瓜蛋白MAP30在胃中易分解的性质，最终制得的片剂包肠溶衣，保证了苦瓜片的效果。
[0028]所述步骤十中制肠溶片的具体工艺步骤为:称取大规模发酵得到的纯净苦瓜蛋白MAP3060g，与6g淀粉混匀，加10 %的淀粉浆作粘合剂搅拌制成软材，接着用14目尼龙筛制粒，将湿颗粒置于干燥器中40-60°C通风干燥，过14目尼龙筛整粒，称干颗粒重量，加入颗粒量5%的滑石粉混匀，接着用压片机压片得到片芯;最后包肠溶衣。
[0029]所述步骤十中包肠溶衣的具体工艺步骤为:先将Π号丙烯酸树脂和95%乙醇按1:14重比例溶解制成5%树脂溶液，再将邻苯二甲酸二乙酯、聚山梨酯-80、蓖麻油按10:7:15的重量比混匀，研磨后加入5% Π号丙烯酸树脂溶液中，过120目筛得到备用树脂包衣液，将苦瓜蛋白MAP30片芯置包衣锅中，按一般包衣方法包粉衣六层后，喷入上述树脂包衣液，锅温控制在35 °C左右，4小时内喷完。
[0030]所述步骤十中包肠溶衣处方为:Π号丙烯酸树脂2.5kg、蓖麻油0.75kg、95%的乙醇