一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别是涉及一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，尤其是涉及用于预防、治疗，条件致病菌烧伤、术前及术后等感染的吸附联合疫苗制备方法，包括奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原、金黄色葡萄球菌胞质抗原、金黄色葡萄球菌类毒素、铜绿假单胞菌类毒素及氢氧化铝凝胶吸附联合疫苗的制备方法，属于医药领域。
【背景技术】
[0002]近些年来，由于国内抗生素乱用现象日趋严重，奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌等目前已成为严重的医院感染病原菌，同时也是烧伤患者创面感染的重要致病菌。当患者免疫功能不良时常引起重症奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌感染，尤其是囊性纤维变性、严重烧伤、外科创伤及或手术移植、癌症、泌尿道疾患等患者深受其害。感染引起不同的疾病，从轻微的皮肤感染至菌血症、骨髓炎、内膜炎、毒脓症等严重危害广大群众的身体健康。
[0003]国内外目前还没有报道关于奇异变形杆菌疫苗，而对于绿脓杆菌疫苗研究也不是很多，目前对铜绿假单胞菌候选疫苗的适当成分的研究集中于假单胞菌菌体及外膜表达成分，例如甲醛灭活菌体、外毒素A(PEA)、弹性蛋白酶及碱性蛋白酶、纤毛、杀白细胞素等，通过资料收集，主要包括Pseudostat?疫苗、铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝(PA-MSHA)菌毛株疫苗和IC43疫苗。大量资料表明金黄色葡萄球菌候选疫苗主要包括荚膜多糖(CP5、CP8和CP336等)和毒素
(α-HemoIysin、PVL、TSST-1 等)，葡糖胺(PNAG、PNSG)和表面蛋白(IsdA、IsdB、SdrD andSdrE)，DNA疫苗FnBPA-CifA和肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)等。面对金黄色葡萄球菌感染的复杂性，金黄色葡萄球菌含有多种致病性因子，而这些因子在细菌生长不同阶段依序表达。近些年来，国内外相关疫苗公司积极开展金黄色葡萄球菌候选疫苗方面的研究以及临床试验，然而大多数金黄色葡萄球菌疫苗候选疫苗临床研究没有达到临床预期目标。而且菌株致病因子很多，且含量较低，而且全菌体疫苗、减毒虽具有一定免疫原性，但是副反应较强，直接从全菌体中分离纯化具有保护性的抗原组分工艺难度较大，方法复杂，回收率低，不利于疫苗的产业化制备，利用基因重组技术获取相关活性组分，其活性组分天然结构不完整，免疫原性不强。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，给出一种新型制备奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)的方法。本发明采用奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌进行通过大规模发酵，采用酶法消化、离心、超滤、乙醇沉淀等获取奇异变形杆菌胞膜可溶性组分，采用离心、机械破碎、等电点沉淀、酶解等获取金黄色葡萄球菌胞质可溶性组分，采用离心、预过滤、超滤、脱毒等获取金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌类毒素活性组分，然后将四种原液、佐剂等按照一定比例进行配伍、混合形成吸附联合疫苗。该疫苗包括6株奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原、金黄色葡萄球菌胞质抗原、金黄色葡萄球菌类毒素和铜绿假单胞菌类毒素，上述9种抗原混匀后吸附于氢氧化铝凝胶(ai(oh)3)。该法工艺简单，所获取活性抗原成分种类多，覆盖范围广，能够有效的提高免疫原性和保护性。
[0005]本发明给出的技术方案是:一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)的制备方法，其特征在于有以下步骤:
(1)奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液制备；
(2)金黄色葡萄球菌胞质抗原原液制备；
(3)金黄色葡萄球菌类毒素原液制备；
(4)铜绿假单胞菌类毒素原液制备；
(5)奇异变形杆菌6价抗原混合液制备；
(6)奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备。
[0006]所述步骤(I)奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液制备:通过高密度培养奇异变形杆菌Proteus mirabilis 13(PMl3)株制备。将产生的培养液在位消化、高速离心、预过滤、超滤及沉淀，获取适当的奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液。其余5株Proteus mirabilis28(PM28)、Proteus mirabilis 43(PM43)、Proteus mirabilis 62(PM62)Proteusmirabilis 92(PM92)、Proteus mirabilis 104(PM104)培养及纯化条件相同。也可以使用上述以外的其他奇异变形杆菌菌株和培养及纯化方法获取适当的奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液。
[0007]所述步骤(2)金黄色葡萄球菌胞质抗原原液制备:通过高密度培养金黄色葡萄球菌Staphylococus aureus79(SA79)株制备，将产生的菌悬液经过离心、破碎、离心、过过滤、沉淀、酶解、透析获得适当的金黄色葡萄球菌胞质抗原原液。也可以使用上述以外的其他金黄色葡萄球菌菌株和培养及纯化方法获取适当的金黄色葡萄球菌胞质抗原原液。
[0008]所述步骤(3)金黄色葡萄球菌类毒素原液制备:是经过高密度培养金黄色葡萄球菌Staphylococus aureus26002(CMCC26002)株制备。将产生的培养液离心、预过滤、加入福尔马林脱毒去毒后纯化，获取适当的灭活金黄色葡萄球菌类毒素原液。也可以使用上述以外的其他金黄色葡萄球菌株和培养及纯化方法获取适当的金黄色葡萄球菌类毒素抗原原液。
[0009]所述步骤(4)铜绿假单胞菌类毒素原液制备:经过高密度培养铜绿假单胞菌pseudomonas 3610^;[11083(?4101)株制备。将产生的培养液离心、预过滤、加入福尔马林脱毒去毒后纯化，获取适当的灭活铜绿假单胞菌类毒素原液。也可以使用上述以外的其他铜绿假单胞菌株和培养及纯化方法获取适当的铜绿假单胞菌类毒素抗原原液。
[0010]所述步骤(5)奇异变形杆菌6价抗原混合液制备:选择6株奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原，经过冷冻干燥，要求冻干抗原残留水份控制在3.0?8.0%，测定单一抗原干重，要求单一抗原干重不低于2mg/ml，将每一株抗原加入生理盐水稀释成浓度为9ug/ml或其倍数，然后6株抗原按照配比1:1:1:1:1:1进行混合，其余用生理盐水补足，摇匀调节pH6.8?7.2，制备成奇异变形杆菌6价抗原混合液。
[0011]所述步骤(6)奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备:制备Iml吸附联合疫苗制剂的有效剂量需要奇异变形杆菌抗原混合液48?60ug，金黄色葡萄球菌胞质抗原组分0.8?1.2mg，金黄色葡萄球菌类毒素抗原组分3?8EC，铜绿假单胞菌类毒素组分20?50ug，0.8?1.2mg铝佐剂。
[0012]本发明使用的适当的吸附剂包括氢氧化铝、磷酸铝及氧化铝凝胶。氢氧化铝、磷酸铝及氧化铝凝胶可以购买或用已知方法制备。
[0013]本发明使用的菌种为。
[0014]奇异变形杆菌:Proteusmirabilis 13(PM13)、Proteus mirabilis 28(PM28)、Proteus mirabilis 43(PM43)、Proteus mirabilis 62(PM62)、Proteus mirabilis 92(PM92)、Proteus mirabilis 104CPM104)0
[0015]金黄色葡萄球菌:Staphylococusaureus79(SA79)、Staphylococus aureus26002(CMCC26002)o
[0016]铜绿假单胞菌:pseudomonasaeruginosa(PAlOl)。
[0017]以上6株奇异变形杆菌Proteusmirabilis 13(PM13)、Proteus mirabilis 28(PM28)、Proteus mirabilis 43(PM43)、Proteus mirabilis 62(PM62)、Proteusmirabilis 92(PM92)、Proteus mirabilis 104(PM104)。！株金黄色葡萄球菌Staphylococus aureus79(SA79)，I株铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa(PAlOl)均来自于中国医科大学附属盛京医院。本公司将奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌株的采集和初步筛选工作委托给中国医科大学附属盛京医院来完成。中国医科大学附属盛京医院负责采集和筛选来自中国华南、东南、西北、西南及东北五个地域的三甲医院临床分离的相关菌株，根据《用于PSP疫苗的匹配菌株采集协议》中国医科大学附属盛京医院每种菌提供125株原始菌株。根据项目研究要求，本公司筛选出6株奇异变形杆菌、I株金黄色葡萄球菌、I株铜绿假单胞菌作为项目研究原始菌株。
[0018]金黄色葡萄球菌Staphylococus aureus26002(CMCC26002)由中国食品药品检定研究院提供。
[0019]与现有技术相比较，本发明的有益效果是:采用奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌进行通过大规模发酵，采用酶法消化、离心、超滤、乙醇沉淀等获取奇异变形杆菌胞膜可溶性组分，采用离心、机械破碎、等电点沉淀、酶解等获取金黄色葡萄球菌胞质可溶性组分，采用离心、预过滤、超滤、脱毒等获取金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌类毒素活性组分，然后将四种原液、佐剂等按照一定比例进行配伍、混合形成吸附联合疫苗。该法工艺简单，所获取活性抗原成分种类多，覆盖范围广，能够有效的提高免疫原性和保护性。避免了现有技术造成的副反应大，回收率低，不利于疫苗的产业化制备的弊端。
【附图说明】
[0020]图1.奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液制备工艺流程。
[0021]图2.金黄色葡萄球菌胞质抗原原液制备工艺流程。
[0022]图3.金黄色葡萄球菌类毒素原液制备工艺流程。
[0023]图4.铜绿假单胞菌类毒素原液制备工艺流程。
[0024]图5.奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)工艺流程。
【具体实施方式】
[0025]实施例1:奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液。
[0026]对6株菌株PM13、PM28、PM43、PM62、PM92和PM104进行发酵罐高密度培养，收集菌体。通过酶解对菌体细胞膜进行酶解、离心、预过滤、超滤、沉淀对奇异变形杆菌细胞膜可溶性组分进行分离纯化，获取高保护性的奇异变形杆菌抗原原液(6株菌株发酵和纯化条件相同)，工艺流程如图1所示。
[0027]所述纯化步骤如下。
[0028](I)酶解:将发酵罐高密度培养获取的菌体溶液pH6.0?8.0无菌0.9%NaCl溶液中混匀，然后按照4.0?6.0 X 19个/ml细菌浓度加入I?2g胰酶，pH7.8?8.5，50?65 °C消化4.5小时。
[0029](2)离心:通过10000?12000rpm，4°C，10?15min冷冻高速离心，收集上清液。
[0030](3)预过滤:采用0.2+0.45um