一种自发组装的多聚赖氨酸接枝物纳米粒及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能自发组装的多聚赖氨酸接枝物纳米粒及制备方法与应用，特别 涉及维生素 E琥珀酸酯-接枝-多聚赖氨酸自组装的纳米粒及制备方法与应用。 技术背景
[0002] 纳米药物传递系统(NDDS)自从20世纪90年代以来被用作抗癌药物递送的有效手 段开始研究，包括聚合物胶束、囊泡、纳米粒、脂质体、纳米乳等，其粒径在l〇-l〇〇〇nm，统称 为纳米药物。纳米药物载体因其独特的纳米尺寸，静脉注射后，经肿瘤组织增强渗透与滞留 效应(EPR效应），能被动聚集在肿瘤组织，提高化疗药物的选择性；同时，还能对所装载的药 物起保护作用，避免其体内快速降解、消除，延长其血液循环时间。与纳米乳、纳米粒以及脂 质体相比，两亲性高分子聚合物组装的纳米胶束具有更优越的性质如组装材料的结构多样 性，纳米粒理化性质的可调节性，表面完全的亲水层覆盖，更长血液循环时间，更强的组织 穿透能力。这些有利的性质奠定了其在化疗药物传递中广泛应用的基础，并且已有多个产 品进入市场或临床试验。当前生物医药领域关于生物可降解、生物相容性的两亲性高分子 材料主要聚焦在聚乙二醇(PEG)化的聚乳酸共聚羟基乙酸类、聚谷基酸类材料制备的纳米 胶束。
[0003] 该类材料制备的纳米胶束转运存在制剂学和生物学双重障碍。制剂方面如不同理 化性质的药物装载缺陷、载药稳定性差导致的药物泄露问题;生物方面如难以穿透致密的 血脑屏障，逆压力差的脑组织渗透转运，脑胶质瘤细胞溶酶体逃逸，以及血液单核-巨噬细 胞系统的吞噬、补体激活介导的快速清除等障碍。
[0004] 聚赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢 神经组织功能的作用。由赖氨酸为构建单元，组成的聚赖氨酸具有生物可降解、生物相容 性，在食品、医药领域具有广泛的应用。多聚赖氨酸包括α-L-型多聚赖氨酸以及异构型的ε-多聚赖氨酸，该类聚氨基酸材料具有很好的水溶性，侧链含有大量的氨基，能细胞表面负电 荷作用，具有超强的细胞粘附能力。因多聚赖氨酸为水溶性物质，对生物膜穿透性能差，缺 乏两亲性无法自组装成纳米载体，限制其在药物递送领域的应用。文献报道了将结晶性的 聚己内酯（PCL)修饰ε-多聚赖氨酸，制备PCL-g-PLL接枝聚合物（Zhao RF，et al.Biodegradable cationic ε-poly-L-lysine-conjugated polymeric nanoparticles as a new effective antibacterial agent. Sci .Bull .(2015)60(2) :216-226)。该聚合物 需要有机溶剂的辅助，才能在水相中自发组装，并且纳米粒粒径为大于500nm，而且因 PCL结 晶性，纳米胶束稳定性差、载药性能差。
[0005] 非结晶性的长碳链类如油酸、硬脂酸、硬脂醇、维生素 E及衍生物或胆留醇类如胆 酸、胆固醇及胆固醇琥珀酸单酯等疏水性小分子，作为接枝基团，修饰亲水性多糖类聚合 物，能显著提高目前抗癌药物的溶解度。中国专利(专利申请号:CN201410571048.8)公开了 一种ε_聚赖氨酸-维生素 E琥珀酸酯酰胺复合物的制备及用作食品保鲜方面的应用，但该专 利并没有利用该聚合物制备纳米颗粒以及用于药物递送中的应用。此外，研究发现，维生素 E及其衍生物具有较强的抗肿瘤作用，其中以维生素 E琥珀酸酯抗肿瘤活性最强，备受广泛 关注。细胞的放射自显影技术、超威结构以及细胞表面变化也证实维生素 E琥珀酸酯可以抑 制肿瘤细胞的增生、促进肿瘤细胞退化。但维生素E琥珀酸单酯在水中溶性差，25°C水中溶 解度仅有〇.〇41mg/mL、对光、热不稳定，容易氧化降解，给药后体内消除快、半衰期短等缺陷 (郑燕升，天然维生素E琥珀酸单酯(VES)的合成，广西大学硕士论文(2007))。本发明使用维 生素E琥珀酸酯(VES)，修饰多聚赖氨酸，合成两亲性的维生素E琥珀酸酯-接枝-多聚赖氨酸 (VES-g-PLL)聚合物。无需有机溶剂的辅助，该聚合物能自发在水中组装成10-1000nm的纳 米粒，一方面能显著增加VES在水中溶解度，自身具有抗癌作用。另一方面，该接枝聚合物组 装的纳米粒可以作为目前抗癌药物递送载体，改善疏水性药物溶解度。利用组装的纳米粒 微小的粒径以及肿瘤组织血管的不完整性，载药纳米粒静脉注射后，经肿瘤组织增强穿透 滞留效应(EPR效应)被动聚集在肿瘤组织，提高选择性。考虑到纳米载体表现出较强的正电 荷，能与肿瘤细胞表面的负电荷经静电吸附，使纳米载体具有更强的肿瘤组织穿透能力。
[0006] 本发明的目的在于克服多聚赖氨酸细胞膜穿透性差、缺乏两亲性、无法自组装成 纳米粒的缺陷，利用微生素 E琥珀酸酯修饰多聚赖氨酸，合成两亲性的微生素 E琥珀酸酯-接 枝-多聚赖氨酸，在无需有机溶剂辅助下自发组装制备纳米粒，应用该纳米粒作为水难溶性 抗癌药物的载体，改善药物水溶性和肿瘤组织靶向性与穿透性，提高抗癌效果。
[0007] 本发明可以通过下列技术方案实现：
[0008] -种能自发组装的多聚赖氨酸接枝聚合物纳米粒，由两亲性的多聚赖氨酸接枝聚 合物与多巴胺-接枝-聚谷氨酸组装而成，粒径大小在l〇-l〇〇〇nm，具有Zeta电位在0~50mV。
[0009] 上述的多聚赖氨酸接枝聚合物纳米粒中多聚赖氨酸接枝聚合物与多巴胺-接枝-聚谷氨酸质量的比为100:1~10:1，优选质量的比为50:1~12:1。
[0010] 上述的两亲性多聚赖氨酸接枝聚合物由多聚赖氨酸亲水链段和疏水性接枝链段 构成，其中，多聚赖氨酸亲水链选自分子量在6，000~70，000Da的α-L-多聚赖氨酸或分子量 600-6000Da的ε-多聚赖氨酸，优选分子量在6,000~3,0000 &的€[-1^-多聚赖氨酸或分子量 2000~5000Da的ε-多聚赖氨酸;疏水性接枝链段为维生素 Ε琥珀酸酯。
[0011] 上述的多聚赖氨酸接枝聚合物中疏水性接枝段分子量占整个聚合物分子量的2-85%，优选 10-80%。
[0012] 上述的多聚赖氨酸接枝聚合物纳米粒的制备方法，其特征在于:包括以下步骤：
[0013] (1)称取10g多聚赖氨酸至圆底烧瓶中，加二甲基亚砜(DMS0)溶解;称取含有羧基 的维生素 E琥珀酸酯接枝物至另一反应瓶中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚 胺盐酸盐、N-羟基琥珀酸亚胺活化试剂，在室温搅拌反应活化羧基;将活化的疏水性接枝物 滴加至上述多聚赖氨酸的溶液中，在10-50°C、搅拌反应2-24h，得到反应粗液。
[0014] (2)将（1)所得反应粗液过滤，除去沉淀，将滤液先对95%乙醇透析(截留分子量为 3500Da的透析袋)除去未反应的小分子杂质，后对蒸馏水透析24h除去DMS0,冻干制备得到 聚合物。
[0015] (3)配制浓度0.01~100mg/mL的多巴胺-接枝-聚谷氨酸水溶液，将多聚赖氨酸接 枝聚合物冻干粉末以浓度为0.01-lg/mL分散在上述多巴胺-接枝-聚谷氨酸水溶液中，在5-60°C搅拌孵育0.5-24h后，自发组装成纳米粒，后经超声或高压均机匀化，使粒径均匀，制备 纳米粒。
[0016] 本发明所述多聚赖氨酸接枝聚合物纳米粒可具有抗癌效果，同时可以用作水难溶 性抗癌药物的纳米组合物的载体。
[0017] 本发明还公开了一种提高难溶性抗癌药物的纳米组合物，该组合物包含多聚赖氨 酸接枝聚合物纳米粒，难溶性抗癌药物选自紫杉醇、多西他赛、喜树碱、姜黄素中的一种或 多种组合。
[0018] 作为优选，所述组合物中，多聚赖氨酸接枝聚合物纳米粒与抗癌药物质量的比的 范围为100:1至100:50。
[0019] 本发明相比现有技术具有如下有益效果：
[0020] (1)本发明利用疏水性的维生素 E琥珀酸酯接枝多聚赖氨酸，制备两亲性的多聚赖 氨酸接