一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001 ]本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方 法和应用。
【背景技术】：
[0002] 乳腺癌是威胁女性健康的恶性肿瘤之一，目前临床对其治疗仍以手术为主，同时 配合放射治疗、化疗药物治疗(简称化疗)进行综合治疗，其中化疗在乳腺癌治疗中起着关 键作用，但临床应用中乳腺癌细胞多存在多药耐药性(multidrug resistance，MDR)现象， 从而导致化疗的失败。因此，逆转乳腺癌耐药成为关键技术。纳米技术的引入，不仅实现了 肿瘤的靶向性治疗、降低了毒副作用，而且有效的实现了耐药乳腺癌细胞的逆转。因此，制 备一种能靶向性治疗乳腺癌耐药的纳米递药系统具有非常重要的意义。
[0003] 纳米药物输送系统是于20世纪60年代开始发展的一种新型给药系统。纳米粒子也 叫超微颗粒，最常见的是固体胶体粒子制成的高分子材料，范围的大小从1到ΙΟΟΟηπι(Ιμπι)， 有时也认为粒子在1至200纳米范围内。纳米材料颗粒与多数大蛋白（也为纳米级）大小相 仿，在体内不易作为异物受到排斥，加之可对纳米材料进一步生物兼容性官能团化，更易满 足药物载体在组织、血液、免疫等生物兼容性方面的要求。
[0004] 胶束(micelles)亦称胶团，是过量的表面活性剂在水中自组装形成的胶体溶液， 表面活性剂分子缔合形成胶束时的最低浓度称为临界胶束浓度(CMC)。文献中常将胶束形 成的过程称为"自组装"。纳米胶束是由具有亲水基团和疏水基团的两亲嵌段共聚物在水中 自组装形成的纳米级大小的核一壳型胶束。
[0005] 由于肿瘤治疗的难度和复杂性，化疗药物和基因药物的协同传递系统成为近年来 肿瘤治疗研究的热点。共递送系统能提尚转染效率，提尚药物疗效的协同效应，从而提尚肿 瘤治疗的疗效。化疗药物和基因药物的运输的挑战之一是这些共同递送系统的设计和开 发。有效的输送系统可以跨越各种障碍，药物递送到体内细胞内而产生抗肿瘤作用。因此， 这些传递系统必须具有多种功能，而且必须长期稳定、专一，并且能够提高内涵体逃逸。
[0006] 多肽类载体主要是指各种细胞穿透肽。其在基因治疗方面因其高效传递基因物质 的能力及低毒性，容易制备而在过去20多年中成为研究热点。研究发现，多肽类载体中的精 氨酸因其表面富集的正电荷可有效地吸附带负电荷的基因物质而形成粒径小，结构稳定的 载体/基因复合物（Farkhani，S.M.，Valizadeh，A.，Karami，H.，Mohammadi，S.，Sohrabi， N.,&Badrzadeh,F.Cell penetrating peptides: efficient vectors for delivery of nanoparticles ,nanocarriers , therapeutic and diagnostic molecules . Peptides , 2014,57:78-94.)〇
[0007] 纳米胶束通过细胞内吞作用进入细胞后被内吞体吞噬，进而与溶酶体融合，基因 药物在进入溶酶体后容易被溶酶体中的酶降解，因此，基因物质只有在内涵体和溶酶体中 逃逸出来才能发挥作用。研究报道，组氨酸具有"质子海绵效应"而具有内吞体逃逸的能力。 本研究采用精氨酸与组氨酸相连的序列连接方式以达到高效转染、有效逃逸内涵体的目 的。
[0008] 硫辛酸是一种具有分子内五元环二硫键结构，末端羧基的两亲性物质，与细胞膜 具有脂质双分子层具有较好的亲和力，具有较好的包载化疗药物的作用，且二硫键可在细 胞还原性条件下裂解，为药物在肿瘤部位的有效释放提供条件。
[0009] 专利号为CN201210305540.1，公开号为CN102920649A的中国发明专利"载药纳米 胶束及其制备方法和应用"公开了一种载药纳米胶束，其中的纳米递送载体是由两亲性三 嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，其中，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二 醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与 所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连;所述聚亮氨酸构成所述 复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复 合体的外层;所述Bcl_2siRNA分散在中间层的所述聚赖氨酸中；药物一多烯紫杉醇分散在 内层的所述聚亮氨酸层中。
[0010] 专利申请号为CN201410053888.5,公开号为CN104840968A的中国发明专利申请 "甲基聚乙二醇誦-b-聚D，L-乳酸誦-漏嵌段共聚物载多烯紫杉醇纳米胶束制剂"公开了 一种利用两亲性嵌段共聚物甲基聚乙二醇 2_-13-聚D，L-乳酸纳米递送载体。
[0011]目前尚无一种硫辛酸修饰的多肽，并且能够靶向性治疗乳腺癌耐药的纳米递送载 体。
【发明内容】
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[0012] 本发明的目的在于提供一种可生物降解的，内部空腔包裹化疗药物，外部包载基 因的基因转染效率高的多肽类纳米载体。本发明的另一个目的是提供该纳米多肽载体的制 备方法;本发明的第三目的是提供该多肽载体在共载化疗药与基因治疗药物中的应用。
[0013] 本发明所要解决的主要技术问题是:如何提高多肽纳米载体引导基因片段进入细 胞的能力，以及如何提高多肽纳米载体共载化疗药与基因的能力，同时保证材料具有生物 可降解特性。
[0014] 本发明设计了 一种硫辛酸修饰的多肽类纳米载体，由精氨酸、组氨酸、硫辛酸和半 胱氨酸组成的多肽，精氨酸带正电荷可与带负电的基因片段结合并具有穿膜作用，组氨酸 因其质子海绵效应而促进基因片段内涵体逃逸，硫辛酸部分可以增加载体与细胞膜的亲和 力并可包载化疗药物达到共载，及其自身二硫键的交联而增加载药及转染能力，并可在生 物还原性条件下裂解而实现释药的目的。
[0015] 本发明的第一个方面，是提供了一种硫辛酸修饰的多肽，所述多肽的氨基酸序列 如下所示：
[0016] HHHRRRRRR(SEQ ID N0:1);氨基酸之间以肽键相连，多肽可简写为H3R6,缩写为HR。
[0017] 所述的硫辛酸修饰，是指硫辛酸羧基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。
[0018] 本发明所述的硫辛酸修饰的多肽可以简写为:LA-H3R6，可简写为LAHR，其中LA为硫 辛酸，Η为组氨酸，R为精氨酸，LA-H 3R6缩写为LAHR。
[0019] 进一步地，本发明提供了一种硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体，所述的纳米 载体为上述硫辛酸修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物的化学结构式如式(I)所示：
[0021 ]所述的硫辛酸修饰的多肽通过半胱氨酸经二硫键交联形成聚合物。
[0022]本发明的Η组氨酸，R精氨酸组成9肽，氨基酸之间以肽键连接，英文缩写为HR;在12 肽的N端，硫辛酸与氨基以酰胺键连接，硫辛酸修饰的多肽英文缩写为LAHR;硫辛酸的巯基 经半胱氨酸氧化交联形成聚合物，聚合物的英文缩写为LAHRss。
[0023] 本发明所述的一种硫辛酸修饰的多肽类纳米载体，聚合物的分子量优选为3000-30000Da，该分子量之外的聚合物不适宜，会降低基因载体的转染效率；最优为15000-30000Da〇
[0024] 本发明的第二个方面，是提供了上述的硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体的制 备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
[0025] (A)硫辛酸修饰的多肽和合成:合成LA_H3R6;
[0026] (B)硫辛酸修饰的多肽类可降解纳米载体的制备:将步骤(A)合成的硫辛酸修饰的 多肽溶于甲醇，加入半胱氨酸盐酸盐，使半胱氨酸的比列在5%_20%之间，调节溶液的pH为 7,避光搅拌反映12小时。
[0027] 在本发明的一个优选实施例中，步骤(B)具体为:取硫辛酸修饰的多肽LAHR与半胱 氨酸溶解于甲醇中，使得半胱氨酸的比例在10%之间，加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0， 搅拌反应12小时，反应温度为室温。
[0028] 步骤⑶反应后的溶液，用N2吹干。用腳欠干后的样品在-20 °C保持。
[0029] 步骤(B)反应后的溶液移入截留分子量为1000的透析袋中，透析液为蒸馏水，透析 12小时。
[0030] 为维持纳米载体材料较高的活性，将透析后的溶液冷冻干燥，并保存于-20 °C，纳 米材料在复溶后可在4°C长期保存。
[0031] 本发明的第三个方面，是提供了上述的硫辛酸修饰的多肽纳米载体共载基因与化 疗药物的耐药乳腺癌中的应用。
[0032] 所述的应用，是指纳米载体中的精氨酸带正电可以与带负电的基因进行结合。
[0033] 所述的应用，是指纳米载体中的硫辛酸的脂溶性可以包载脂溶性的化疗药物。