基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法与流程

本发明涉及一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法。

背景技术：

近年来，随着人口老龄化及运动损伤的增多，器官和组织的缺损或衰竭是发生最为频繁、最具破坏性和花费最为昂贵的问题。组织再生以及功能的恢复一直是困扰临床的一个难题。

组织工程与再生医学的发展为重建或修复人类病损组织和器官提供了有效的治疗手段。其支架材料的涉及决定组织工程成败的关键因素之一。支架材料的设计应最大限度仿生人体细胞外基质(ECM)结构与功能特点，才能有效解决材料的生物相容性问题。理想的支架材料不仅需要适度的力学为细胞生长提供三维支撑，还需有利于细胞在其表面粘附、增殖和迁移，促进机体再生与修复。因此，从结构和功能上仿生细胞外基质的理想组织工程支架具有广阔的开发前景。丝蛋白是一种从家蚕、野蚕以及蜘蛛丝中提取的天然共聚物，其作为一种天然纤维蛋白，含有对人体极具营养价值的18种氨基酸，是一种天然活性蛋白，具有较低的免疫原性、良好的生物相容性，其本身及其降解产物对细胞和机体无毒，不会或较少引起炎症和免疫排斥反应。同时，野蚕丝中的柞蚕丝蛋白分子中含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进细胞对于支架的识别及粘附。丝素蛋白支架可以通过结合细胞或生长因子为修复受损的组织提供一个合适的微环境，充当临时的组织替代支架材料。因此基于丝蛋白的生物支架材料在生物医用组织领域有很好的应用前景。但由于天然蛋白质力学性能较差无法满足组织功能的需要，所以限制了其在生物医学领域中应用。

高分子聚合物由于良好机械性能，被广泛用于组织工程和药物释放领域。但是其属于合成高分子材料，不能为组织生长丝蛋白和高分子聚合物混纺可以结合二者的优点，既能使支架材料具有较高且符合神经组织的力学性能，又能为组织生长提供生物信号，促进细胞的粘附、增值和分化，从而满足各种组织的需要。

氧化石墨烯是石墨烯的一种衍生物，微观结构可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，其片层上含有很多含氧基团如羧基、羟基与环氧基等，具有两亲性。氧化石墨烯如同界面活性剂一般存在界面，降低了界面间的能量，在水中具有优越的分散性。特别地，氧化石墨烯的含氧活性基团化学特性不同，为与多种丝素蛋白之间的相互作用提供了大量的结合位点。同时也存在离子键和氢键等非共价键的结合作用。另外，氧化石墨烯具有优异的力学性能和良好的生物相容性，可用作生物复合材料的力学增强相，提高了生物支架材料的力学性能。目前，氧化石墨烯在组织工程方面研究主要集中在二维薄膜、纳米片作为性能增强添加物以及采用化学气相沉淀技术制备石墨烯三维泡沫。将氧化石墨烯制备基于涂层复合纳米纤维组织工程支架材料的研究鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种物理化学性能优异，生物相容性好的复合纳米纤维组织工程支架的制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：将丝素蛋白与高分子聚合物溶于溶剂中，搅拌至完全溶解，得到纺丝液；

步骤2：将步骤1得到的纺丝液进行静电纺丝得到纳米纤维膜，采用乙醇或其溶液进行熏蒸处理，干燥得到丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料；

步骤3：将步骤2得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中，取出，干燥得到复合纳米纤维组织工程支架。

优选地，所述的氧化石墨烯分散液的制备方法包括：将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释，得到氧化石墨烯分散液。

优选地，所述的步骤2中的干燥为真空干燥，时间为24—72h。

优选地，所述的步骤1中的丝素蛋白的制备方法包括：将丝素蛋白原料进行脱胶、溶解、透析处理后得到丝素蛋白溶液，进行冷冻干燥，得到纯净丝素蛋白。

更优选地，所述的丝素蛋白原料为家蚕丝、野蚕丝、蜘蛛丝或者转基因丝，其中野蚕丝为柞蚕丝。

优选地，所述的丝素蛋白与高分子聚合物的质量比为1∶99-99∶1。

优选地，所述的纺丝液的浓度为4-12％(质量体积比)。

优选地，所述的静电纺丝的工艺参数为：调节电压为8-15KV，喷丝头和接受装置之间的距离(接收距离)为6-15cm，纺丝速率为0.8-1.2ml/h。

优选地，所述的氧化石墨烯分散液的浓度为0.05-10mg/ml。

优选地，所述的步骤3中的浸渍时间为20min-12h。

优选地，所述的高分子聚合物为PCL、PLA、PGA、PLLA、P(LLA-CL)、PLGA、PEO、PEUU、PVA或PU中的至少一种。

本发明还提供了上述的复合纳米纤维组织工程支架在制造血管、神经导管、骨组织、肌腱组织和皮肤中的应用。

本发明将丝素蛋白和和高分子聚合物共混采用静电纺丝技术制备的复合纳米纤维支架能最大限度的从结构和功能上仿生人体细胞外基质，另外，在其支架表面涂层氧化石墨烯不仅使复合纳米支架材料具有较大比表面积，可以与丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维材料充分接触，提高其机械性能，有利于界面应力的传导，而且可以与丝素蛋白产生协同作用，提高复合纳米纤维支架材料的生物活性。使其有望成为理想中的组织工程支架。在本发明作出之前，还没有文献和专利报道过有关氧化石墨烯涂覆丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维组织工程支架制备。本发明对于生物医用材料及生物医学领域神经组织工程领域具有重要的意义。

本发明以物理化学性能优异，生物相容性好的丝蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维为基体，通过物理静电相互作用及氢键作用，氧化石墨烯在复合纳米纤维基体上实现自组装，在其表面形成片径为50nm-200nm的片状涂层，经过干燥熏蒸等处理得到具有不同浓度的氧化石墨烯涂覆的丝素蛋白/高分子聚合物的组织工程支架。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的优点在于采用静电纺丝技术制备出物理化学性能优异，生物相容性好的丝蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架，在其表面涂层不同浓度的氧化石墨烯既能使支架材料具有较高且符合组织的力学性能，又能为组织生长提供生物信号，促进细胞的粘附、增殖和分化。

(2)复合纳米纤维支架材料和氧化石墨烯之间的接触即发生自组装，无需添加任何交联剂和调节PH，操作简单，重复性好。

(3)可通过调节氧化石墨烯浓度及浸渍时间、循环次数来控制组织工程支架的物理化学性能。制备的氧化石墨烯涂覆的复合纳米纤维支架材料不仅没有破坏掉原有的纳米纤维结构，使其仍具有纳米纤维支架材料高比表面积，孔隙率高等的优点，同时还同丝素蛋白产生协同作用，在原有的基础上提高了支架材料的生物活性。使其在神经组织工程方面具有很好地应用前景；

(4)具有广阔的应用前景：可以应用于多种组织修复：血管、神经导管、骨组织、肌腱组织、皮肤等

(5)本发明操作简单，能够实现工业化生产，原料安全可靠未使用到任何其他有害有毒的化学试剂，易实现工业化生产。

附图说明

图1为对比例1及实施例1-3中不同浓度的氧化石墨烯涂层柞蚕丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯复合纳米纤维支架光学图片：(a)未涂层的复合纳米纤维支架(b)涂层氧化石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)涂层氧化石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)涂层氧化石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架；

图2为对比例1及实施例1-4中不同浓度的氧化石墨烯涂层柞蚕丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯复合纳米纤维支架扫描电镜图片：(a)未涂层的复合纳米纤维支架(b)涂层氧化石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)涂层氧化石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)涂层氧化石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架(e)涂层氧化石墨烯2.0mg/ml复合纳米纤维支架。

图3为对比例1及实施例1-4不同浓度的氧化石墨烯涂层柞蚕丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯复合纳米纤维支架力学性能；

图4为对比例1及实施例1-4不同浓度的氧化石墨烯涂层柞蚕丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯复合纳米纤维支架的拉曼光谱。(a)未涂层的复合纳米纤维支架(b)涂层氧化石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)涂层氧化石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)涂层氧化石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架(e)涂层氧化石墨烯2.0mg/ml复合纳米纤维支架。

图5为雪旺细胞(SCs)在对比例1及实施例1-4中所述的不同浓度的氧化石墨烯涂层柞蚕丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯复合纳米纤维支架生长粘附的扫描电镜图片。(a)未涂层的复合纳米纤维支架(b)涂层氧化石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)涂层氧化石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)涂层氧化石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架(e)涂层氧化石墨烯2.0mg/ml复合纳米纤维支架。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明各实施例中所用的高分子聚合物为聚乳酸-聚己内酯，其为市售产品，其分子量Mn为30万，其中，乳酸单元和己内酯单元的摩尔比为50：50。

本发明各实施例中的氧化石墨烯水溶液为市售产品，浓度为2mg/ml。

对比例1

一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

2、称取丝素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶于5ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠5x5cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏，接收距离8cm，纺丝速率1.2ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料。

3、将得到的复合纳米纤维支架浸渍在纯水中3min，循环浸渍5次，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，取出，最后干燥得到复合纳米纤维组织工程支架。

实施例1

一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

2、称取丝素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶于5ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。进行静电纺丝，用铝箔平整包缠5x5cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏；接收距离8em，纺丝速率1.2ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料。

3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为0.5mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；将得到的复合纳米纤维支架浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，取出，最后干燥得到复合纳米纤维组织工程支架，其光学图片如图1所示，扫描电镜图片如图2所示。

实施例2

一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/LNa₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

2、称取丝素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶于5ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。进行静电纺丝，用铝箔平整包缠5x5cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏；接收距离8cm，纺丝速率1.2ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料。

3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为1.0mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；将得到的复合纳米纤维支架浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次。用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，取出，最后干燥得到复合纳米纤维组织工程支架，其光学图片如图1所示，扫描电镜图片如图2所示。

实施例3

一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

2、称取丝素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶于5ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。进行静电纺丝，用铝箔平整包缠5x5cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏；接收距离8cm，纺丝速率1.2ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料。

3、将所得的氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为1.5mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；将得到的复合纳米纤维支架浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，取出，最后干燥得到复合纳米纤维组织工程支架，其光学图片如图1所示，扫描电镜图片如图2所示。

实施例4

一种基于氧化石墨烯复合纳米纤维组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

2、称取丝素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶于5ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。进行静电纺丝，用铝箔平整包缠5x5cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏；接收距离8cm，纺丝速率1.2ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂。得到丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料

3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为2.0mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；将得到的复合纳米纤维支架浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，取出，最后干燥得到复合纳米纤维组织工程支架。

对比例1及实施例1-3所述的氧化石墨烯涂层的纳米纤维支架其光学图片如图1所示，其结果显示未涂层氧化石墨烯的支架材料为白色，涂层氧化石墨烯支架材料为棕色，其表明氧化石墨烯已存在于纳米纤维支架材料上。

对比例1及实施例1-4所述的氧化石墨烯涂层的纳米纤维支架其扫描电镜图片如图2所示。其结果表明涂层氧化石墨烯的支架纤维平整光滑，含有氧化石墨烯支架纤维表面粗糙有片层覆盖，其结果显示氧化石墨烯已涂层到纳米纤维支架材料上且不会破坏纳米纤维的结构。

对比例1及实施例1-4所述的氧化石墨烯涂层的纳米纤维支架力学性能如图3所示，将其支架材料剪成3cm x1cm的矩形样品在拉力拉伸测试仪上进行检测，其结果显示涂层氧化石墨烯后复合纳米纤维支架的力学性能明显优于未涂层的纳米复合纤维支架，断裂伸长率和断裂强度都有所提高。

对比例1及实施例1-4所述的氧化石墨烯涂层的纳米纤维支架拉曼光谱谱图如图4所示，将不同样品采用拉曼光谱分析仪测试，其结果显示涂层的氧化石墨烯支架D峰与G峰氧化石墨烯的比值小于1，表明氧化石墨烯已涂层到纳米纤维支架材料上。

对比例1及实施例1-4所述的雪旺细胞(SCs)在不同浓度的氧化石墨烯涂层柞蚕丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯复合纳米纤维支架生长粘附的扫描电镜图片如图5所示，将不同样品进行灭菌处理用于雪旺细胞的培养，具体为利用24孔打孔器进行各样品的准备，将个样品置于24孔培养板中，以盖玻片作为对照样，将各板置于体积分数为75％的酒精蒸汽缸中进行灭菌处理2h后置于超净工作台备用，利用PBS依次清洗支架以及空白培养板3次，以此除去未挥发的酒精蒸汽。雪旺细胞的种植密度为每孔1×10⁴个，再将配好的DMEM培养基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培养箱内孵育，以上操作步骤均在超净台内完成。进行酒精脱水处理，用于电镜的拍摄，其结果表明涂层氧化石墨烯的支架材料与未涂层的纳米纤维支架材料更有利于细胞生长粘附。