蚕丝制品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蚕丝材料加工领域，尤其是提供医用蚕丝材料。
【背景技术】
[0002] 蚕丝用于生物医学缝线已有几十年历史，观察到了潜在的宿主免疫反应。这可能 是蚕丝在过往的生物医学应用中不予考虑的主要原因。引发免疫反应的主因与丝胶蛋白 (sericin)有关。故，从生丝（rawsilk)彻底除去丝胶蛋白，是组织工程化和再生医学应用 中制备丝织物、但避免生物相容性问题的关键步骤。
[0003] 常见的蚕丝是从家蚕（Bombyxmori)幼虫的蚕茧获得的。单个蚕茧纤维由被称为 丝胶蛋白的胶状蛋白包绕两个丝素蛋白（fibroin)核心而成，其中由丝胶蛋白将多个丝素 蛋白纤维互相固定。丝素蛋白和丝胶蛋白分别占约75和25%wt.。
[0004] 蚕丝丝素蛋白在形态上以高度有序的晶态纤维结构为特征。这种结构使它不溶 于诸如水、乙醇、稀酸和碱等大多数溶剂。与丝素蛋白相反，球状的丝胶蛋白易溶于水性溶 剂。纺织业对于去除丝胶蛋白也有极大兴趣，因为蚕丝服装的光泽会被丝胶掩盖。因此，不 光是生物材料领域要研宄蚕丝，纺织业也在寻找最佳的脱胶方法。这导致出现多种脱胶方 法，包括，碱性溶液（加或不加表面活性剂）、尿素、酒石酸、柠檬酸、或诸如木瓜蛋白酶或内 肽酶等酶类。传统的脱胶法是将生丝置于有或无表面活性剂的碱性溶液中煮沸，表面活性 剂有助于使丝胶蛋白从纤维结构中脱离出来。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸钠溶液 在KKTC处理30-60min来完成脱胶，尤其是在组织工程化研宄领域。这种碱性脱胶常常以 批量处理，使用的是肥皂或表面活性剂加碱。
[0005] 工业蚕丝生产通常涉及将天然蚕丝纤维（nativesilkfibres)溶解成丝素蛋白 溶液、再用合适的方法如离心法从这种溶液中再加工出（reprocessing)纤维。
[0006] 提供医用蚕丝材料的方法几乎是唯一的：将蚕丝纤维以摩尔比1:2:8溶于 含水体系如Lifo或CaCl2/EtOH/水中（CN101736430B)，然后通过诸如离心、电纺丝 (electrospinning)、由水性系统或有机溶剂系统注衆成形（casting)、凝胶化、起泡等等， 将该蚕丝溶液再加工为所需形式的材料（V印ari等，2007,US5, 252, 285A;Sung-WonHa 等，Biomacromolecules4 (3) 2003p. 488-496) 〇
[0007] 但这些由丝素蛋白溶液再加工出的蚕丝材料与天然蚕丝结构不同，常导致三维产 物具有用于多种可能用途、尤其外科领域的用途时不令人满意的特性（特别是力学特性）。
[0008] 为避免所得的蚕丝结构的这些被削弱的特性，需要一些使用脱胶的蚕丝纤维作 为原材料的技术。蚕丝纤维用纺织工程化技术如编辫（braiding)、打结（knotting)、机 织（weaving)等加工时的高度可加工性，尤其在生物医学制品领域，已得到Horan等（J Biomech39(12)2006,p. 2232-2240)证实。尽管用纺织工程化技术制备骨架能实现上述 各种进步，仍有一些特殊情况有益于使纤维粘合，这是纺织工程化技术很难或根本不能实 现的。因此研发了不同的策略来用溶剂、粘合剂（埋在树脂中）或加热处理（US3 510 390A)使天然以及合成的纤维粘在一起。一种将蚕丝纤维与相邻纤维粘合的方法用到离 子液体。这些离子液体起到多种生物聚合物包括蚕丝的溶剂的作用。例如，Haverhals等(Macromolecularmaterialsandengineering295,IJanuary2010,p. 425-430)表明，用 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐可以将天然未脱胶的蚕丝"焊接（weld)"到一起。该工艺被描 述和展示为，将纤维表面粘合成无中断且无解体的结构（US8 202 379BI)。
[0009] 另一种用于将蚕丝纤维彼此粘连的化学试剂是甲酸。早在1915年就有人描述 了从短蚕丝纤维制备均质纤维浆的工艺（GB12374A)。在生物医学领域，Ghanaati等 (JTERM，2010 (4)p. 464-472)用甲酸将脱胶的无纺蚕丝纤维粘合在一起，形成可移植的稳定 骨架，但不会形成一长串粘在一起的蚕丝纤维。
[0010] 显然，生物医学材料（尤其植入材料）必需要有显著的力学稳定性，特别是要抵抗 压力时，而这类材料的任何意外断裂都必须阻止或排除。因此，需要改进的方法来基于改进 了力学特性和形态特性的蚕丝而提供结实耐用的生物医学材料。这些方法应允许稳健、可 再现且可靠的制备方法；另一方面，这些产物应允许制得的生物材料能加以应用，尤其用于 医药和用于细胞培养方法中。
【发明内容】
[0011] 因此，本发明的一个目标是提供这样的方法；这样的方法应该也特别适于医学目 的，尤其适于疗法和外科手术。
[0012] 因此，本发明提供制备三维蚕丝制品的方法，其中，将三维蚕丝制品用蚕丝溶剂 (silksolvent)处理一段时间，使该蚕丝制品发生部分解体（partialdisintegration)， 之后，通过物理的（physical) (6-片层（sheet)诱导而将该部分解体的蚕丝制品重新稳固。
[0013] 本发明中，"三维蚕丝制品"应该不仅理解为，其三维中没有一维不与其它两维发 生关联的那些制品，而且理解为，由至少两层丝素蛋白叠加而限定的那些制品，所述两层丝 素蛋白中，一层是均匀的丝素蛋白层（区，域，相，等），一层是纤维状丝素蛋白层，它们从空 间上允许产生非均质（anisotropic)材料性质。
[0014] 本发明的方法提供改进了力学特性的蚕丝结构物（silkconstructs)，尤其丝素 蛋白结构物。这允许将本发明方法可获得的产物移植到会暴露于特定机械作用力的区域 中。例如，在神经导管（nerveconduit)的例子中，体内移植物可能暴露于能引起这类移植 物崩解的压力。在这样的情形中，由未经处理的丝素蛋白构成的（梭织）管纱会崩解，阻碍 所述管纱所覆盖正在生长的神经。本发明的方法使移植物能抵抗这类引起挤压（crush)或 挫伤（contusion)的力量。鉴于之前在丝素蛋白结构物上实施了解体步骤或再稳定步骤但 未制出具有本发明所述优点的产物，说明是这两个步骤的组合导致了产物具有本发明所述 的改进的特性。
[0015] 本发明的部分解体步骤可视为蚕丝制品在暴露于解体溶液，蚕丝溶剂的区域内的 部分溶解。这涉及丝素蛋白中使之成形的beta-片层结构的部分解体。解体可以达到终产 物所需的程度，例如，仅仅靠近表面或贯穿整个蚕丝制品，当然是产物尚未变成溶液。起始 材料（即，蚕丝制品）的总体形状在部分解体步骤的全过程中基本保留。因此，蚕丝溶剂只 是施用有限的时间段，不会一直用到彻底溶解的程度（达到平衡）。蚕丝（丝素蛋白）材 料（再次）彻底液化成溶液或悬浮液的情形在本发明中不会发生，仅仅是产物的有限区域 内发生部分的去固化过程。此（部分）"溶解"步骤允许丝素蛋白分子更紧密地聚集在以 形成连续相为特征的产物的解体区域（disintegratedarea)内部。在蚕丝制品上实施的 解体步骤所能达到的程度因此导致本发明终产物的不同产物特征。
[0016]可见，本发明的"解体"明显有别于其它蚕丝加工步骤，如脱胶（"脱胶 (degumming) "是指将两类蛋白彼此分离，S卩，使丝胶蛋白脱离丝素蛋白纤维，它类似于使外 壳与核心脱呙）。
[0017] 在再稳定步骤中，蚕丝制品的解体部分再次固化，但形成了与该蚕丝制品的未解 体部分相比有不同形态和力学特征的区域。由于该再稳定步骤，蚕丝制品再次彻底固化，通 常形成非均质的终产物，其中最显著暴露于溶丝液的表面经历了最广延的结构变化，而蚕 丝制品的内部（或未暴露于溶丝液（"蚕丝溶剂"）的表面）能够维持几乎不变或至少未变 到更多暴露于蚕丝溶剂的部位所达到的程度。本发明的再稳定步骤因此引起形态上的晶样 状态（morphologicalcrystalline-likestate)。所述再稳定步骤是通过物理的0-片层 诱导来进行的。解体引起蚕丝的"无规"结构。此后，解体的蚕丝经物理处理而实现片 层再折叠。实施该步骤的典型方式是除去无规蚕丝形式中解体区的水分子，直至发生这类 再折萱。
[0018] 蚕丝丝素蛋白是多形性材料，有三种不同的相（phases)，通常称为蚕丝I、II和 III。蚕丝I代表一种螺旋且无规卷曲的水溶性结构状态，可见于离心处理前的蚕腺体或 作为（含水）蚕丝溶液（也称再生丝（regeneratedsilk))。蚕丝II的特征在于不对称 0 -片层结构，其中甘氨酸的氢侧链大都暴露在0 -片层的一侧、丙氨酸的疏水甲基侧链在 另一侧。结果，各个片层通过并肩式排列而自我装配，通过强氢键和范德华力而稳定。
[0019] 通过暴露于热或剪切力，引起蚕丝I向蚕丝II的结构变化。这种相变（phase transition)也可以通过用甲醇或其它促进蚕丝分子失水的试剂处理蚕丝结构来获得。结 果，从无规卷曲（蚕丝I)向片层形成（蚕丝II)的转变因链-链相互作用的增强而被 诱导。除了所述相变，此过程还确保水稳定性蚕丝结构。其它引起和控制beta-片层形成 的方法是，高压蒸汽灭菌（Park等，J.Mat.Sci43 (2008)，6967-6985)和水冷退火法（water annealingmethods,Hu等，Biomacromol. 12(2011)，1686-1696)。
[0020] 再稳定步骤优选按照本发明通过用再稳定溶液处理来进行。也可以使用不同的再 稳定溶液的多种组合。
[0021] 用再稳定溶液进行的再稳定可以用任何能实现蚕丝的e-片层形成的溶液来进 行。所述结晶（通过用再稳定溶液处理进行的再稳定）常常由两种目前业内的方法来诱导， 是浸没在诸如甲醇或乙醇等醇溶液中。醇浸没既简单又快速，但如果必须要避免使用醇的 话，可以使用诸如甲酸等无醇再稳定溶液。
[0022] 作为本发明的测试系统，研宄了用于神经修复的蚕丝丝素蛋白对照（control)结 构。更具体地，对坐骨神经（N.ischiadicus)缺损的搭桥已在大鼠体内观察到，显示出令人 意外的结果（见实施例部分）。
[0023] 在本发明过程中意外发现，蚕丝制品（尤其三维丝素蛋白产物），在应用了本发明 的两个处理步骤后，可以有效改进其力学特性，尤其是它们抵抗体内移植后瓦解的抗性。这 使得能产生与经丝素蛋白溶液再处理（无本发明的加固步骤）的蚕丝纤维相比具有显著优 势和潜能的三维蚕丝制品。
[0024] 根据本发明提供更结实耐用的复杂蚕丝结构，给当今手术带来明显好处。而且， 该制备过程整体上是可靠的，适于进行工业化大规模生产。优选地，本发明的蚕丝溶剂包 括LiBr、LiSCN、六氟代-2-丙醇（HFIP)、含乙醇和0&(：12的混合物或含甲醇和硝酸钙的混 合物；或它们的混合物。根据优选实施方案，LiBr在蚕丝溶剂中的使用浓度是1-10M，优 选3-10M，尤其5-7M。根据优选实施方案，LiSCN的使用浓度是1-17. 5M，优选5-15M，尤其 8-12M。根据优选实施方案，HFIP在溶液中的使用浓度是1-100 % (v/v)，优选50-100 % (v/v)HFIP，尤其90-100 % (v/v)HFIP。乙醇可以，例如，在蚕丝溶剂中使用含水溶液，其 包含1-50% (v/v)乙醇，优选5-40% (v/v)乙醇，尤其10-30% (v/v)乙醇。CaCl2可以， 例如，在蚕丝溶剂中与乙醇的摩尔比为1 :〇? 3-1:3 (即，ImolCaCl2:0. 3molEtOH至Imol CaCl2:3molEt0H)，优选 1:1-1:2. 5,尤其 1:1. 5-1:2. 2。
[0025] 本发明的方法适用于广泛多种不同的蚕丝制品，尤其丝素蛋白制品。优选，所 述三维蚕丝制品是梭织物（wovenfabric),无纺织物（non-wovenfabric),管纱（tube), 编织物（knittedproduct)或压制品（pressedproduct)。尽管本发明的方法可以用任何 丝架（silkscaffold)来实施，但所述方法特别适于处理由蚕丝纤维构成的骨架。那些制 品可以转而形成一个区域有解体而其它区域仍保留原始丝纤维结构的丝架，优选提供非均 质（anisotropic)制品，S卩，表面已解体、内部仍包含丝纤维的制品。尤其优选使用丝素蛋 白制品或由天然蚕丝纤维构成的梭织制品（wovenproduct)。本发