黑曲霉全细胞催化降解造纸白水中聚半乳糖醛酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及全细胞催化技术领域，具体涉及一种用黑曲霉全细胞生物催化降解造纸白水中的聚半乳糖醛酸的方法及应用条件的优化。
【背景技术】
[0002]纸厂一直都是用水和污水排放大户，从环境和生产成本方面考虑，都要求纸厂白水系统封闭循环，减少清水的使用和废水排放。但随着白水封闭循环程度的提高和白水循环次数的增加，白水中的有害物质也逐渐积累，以致影响纸机效率和成纸质量。研究表明，白水中的有害物质主要是溶解和胶体物质(简称DCS)。这些物质带有很高的负电性，会降低阳离子助剂的效率，并且树脂成分往往会聚集污染造纸网、毛毯、烘缸、压光辊、使纸面产生孔洞、斑点等纸病，引起断纸、滤水性能降低、浆料腐烂、泡沫产生到生产设备的腐蚀和结垢，引起生产效率下降以及成纸质量差等。
[0003]因此，必须寻找一种经济高效去除这些溶解与胶体物质的有效方法。果胶分子是羧基完全游离的多聚半乳糖醛酸长链，大量存在于植物的细胞壁与细胞液中，是一种较强的有机酸，在水中容易发生电离作用而带有大量负电荷。随着制浆技术的快速发展，高得率浆(HYP)不仅生产成本低，而且具有较好的浆料性能，因而得到了广泛的应用。但HYP含有较高含量的果胶类物质，果胶在碱性H2O2漂白中发生脱甲基反应使其酯化的羧基游离出来，此类物质的积累容易对纸机的湿部造成严重的影响，是DCS的主要组分之一。
[0004]全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。全细胞催化是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技术。相比发酵法，全细胞催化克服了发酵法生产周期长、代谢产物复杂、底物转化率低、产物分离提取困难及能耗高等缺点。相比提取酶的催化反应，全细胞中各酶系保持原有生活细胞所处的状态和特定位置，酶稳定性更好，半衰期更长，适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生；细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，从而弥补酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，提高了催化效率，同时，又省去了繁琐的酶纯化过程，制备更加简单，生产成本更低。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种环境友好、生产成本低、酶稳定性更好、半衰期更长、适应性更强的黑曲霉全细胞生物催化降解造纸白水果胶类物质(主要是聚半乳糖醛酸)的新方法。
[0006]本发明的目的通过如下技术方案实现:
黑曲霉全细胞生物催化降解聚半乳糖醛酸的方法，其包括如下步骤:
(I)在斜面培养基内(PDA)，接种一环黑曲霉种子，30~50 °C培养48~120 h后，用无菌水水洗，收集得到活化的黑曲霉； (2)得到活化黑曲霉后发酵扩大培养，最适培养基的配制:加入麸皮1%~10%(以下均是基于蒸馏水的质量)，果胶0.1%~0.5%，(NH4)2SO4固体1%~4%，K 2ΗΡ04固体0.06%~0.12%，KCl 固体 0.03%~0.08%，MgSO4.7H20 0.03%~0.08%，Na2SO4 0.03%~0.08%，FeSO4.7H200.000001%~0.000003%，溶于装有蒸馏水的锥形瓶中作为发酵培养基；
(3)调节发酵培养基pH为6.0-8.0，接种占蒸馏水重量的3~5%活化黑曲霉，视工艺要求的不同，在30~50°C条件下150~300 r/min振荡培养5~10 d后，用滤网过滤发酵液后，收集的黑曲霉冷冻干燥10~24 h，即可得到黑曲霉全细胞催化剂(以下称黑曲霉全细胞)；
(4)用得到的黑曲霉全细胞催化剂处理造纸白水中果胶类物质的模型物，过滤后测定滤液所需的阳离子需求量。
[0007]进一步地，步骤(4)中用3，5- 二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定并对比黑曲霉产生果胶酶活性和商品碱性果胶酶活性。在甲、乙两只25 ml比色管中分别加入5 g/L果胶底物5 ml ο并置于50 °C水浴中预热5 min后，分别加入5 mL pH为8的磷酸缓冲；再向甲管中加入0.065 g黑曲霉、乙管中加入0.065 g商品碱性果胶酶，立即摇勾，并置于50 °〇水浴中准确反应30 min;最后将甲、乙两管立即置于沸水浴中煮沸5 min，终止反应，冷却后分别用DNS法测定酶活性；
利用0.1 mo I/L NaOH溶液溶解聚半乳糖醛酸(PGA)配制成0.5-1.0 g/L的PGA溶液，用稀盐酸调节溶液至pH为6.0-8.0 ；
黑曲霉在不同条件下处理PGA溶液，过滤反应液后，测定滤液所需的阳离子需求量(CD值)并优化反应条件。
[0008]上述黑曲霉全细胞生物催化降解聚半乳糖醛酸的方法中，果胶酶来源于黑曲霉发酵培养，发酵液中及黑曲霉细胞内和细胞外壁。
[0009]上述黑曲霉全细胞生物催化降解聚半乳糖醛酸的方法中，用聚半乳糖醛酸(PGA)作为造纸白水中果胶类物质的模型物。
[0010]上述黑曲霉生物全细胞催化降解聚半乳糖醛酸的方法中，黑曲霉酶活性测定为119.67 U/g,商品碱性果胶酶酶活性32.5 U/g。相同条件下黑曲霉酶活性大于商品碱性果胶酶酶活性。
[0011]上述曲霉生物催化分解聚半乳糖醛酸的方法中，反应最优条件为黑曲霉用量0.25-2.0 g，反应温度 40~60 °C，反应时间 10-120 min。
[0012]与现有的技术相比，本发明具有如下的优点:
(I)全细胞催化克服了发酵法生产周期长、代谢产物复杂、底物转化率低、产物分离提取困难及能耗高等缺点。
[0013](2)全细胞催化中各酶系保持原有生活细胞所处的状态和特定位置，酶稳定性更好、半衰期更长、适应性更强、更易实现能量和辅酶的原位再生。
[0014](3)细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，弥补酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，提高了催化效率，又省去了繁琐的酶纯化过程，制备更加简单，生产成本更低。
[0015](4)与传统的采用阴离子垃圾捕集剂和絮凝剂去除白水DCS破坏白水原有平衡相比，黑曲霉能较好催化降解白水中的果胶类物质，彻底去除白水中的阴离子垃圾，不会破坏白水中原有的电荷平衡，最终处理效果较好。
[0016](5)反应条件温和，催化效率高，环境友好等优点。
【具体实施方式】
[0017]为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
[0018]实施例1
在 100 mL 蒸馈水中加入麸皮 1.0g、商品果胶(pectin, from citrus fruits) 0.3 g、(MM)2SO4固体 2.0 g、K2HP04固体 0.I g、KCl 固体 0.05 g、MgS04.7Η20 0.05 g^Na2SO4 0.05g,FeSO4.7Η200.0001 g，调节pH为6.0，形成扩大培养基，接入4 ml浓度为I X 10s/L黑曲霉(Aspergillus niger GIM3.462购自中国科学院微生物研究所)孢子悬浮液，在30 °C，180 r/min的摇床上培养5 d后离心收集黑曲霉，并冷冻干燥24 h制成全细胞催化剂；用3，5- 二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定并对比黑曲霉产生果胶酶活性和商品碱性果胶酶活性；在甲、乙两只25 ml比色管中分别加入5 g/L果胶底物5 ml ;并置于50 °(:水浴中预热5 min后，分别加入5 mL pH为8的磷酸缓冲液；再向甲管中加入0.065 g黑曲霉、乙管中加入0.065 g商品碱性果胶酶，立即摇勾，并置于50 °C水浴中反应30 min;最后将甲、乙两管立即置于沸水浴中煮沸5 min，终止反应，冷却后分别用DNS法测定酶活性；利用0.1mo I/L NaOH溶液溶解聚半乳糖醛酸(PGA)配制成I g/L的PGA溶液，用稀盐酸调节溶液至pH为7.0 ;把50 mL pH为7.0的PGA (I g/L)溶液和2.0 g黑曲霉全细胞催化剂放入锥形瓶中，置于60 °C水浴恒温箱中反应10 min后，用无菌过滤器过滤后取滤液测量阳离子需求量(⑶)，测得⑶值为0.77。
[0019]实施例2
在 100 mL 蒸馈水中加入麸皮 2.0g、商品果胶(pectin, from citrus fruits) 0.2 g、(NH4)2SO4固体 2.0 g、K2HP04固体 0.I g、KCl 固体 0.05 g、MgS04.7H20 0.05 g、Na2SO4 0.0