一种宽视场多尺度高分辨率显微成像系统和方法与流程

本发明属于光学显微技术领域，特别涉及一种宽视场多尺度高分辨的显微成像系统的设计及其方法。

背景技术：

随着科学技术的发展，人们在神经病理、遗传基因以及神经科学研究方面的研究上不断追求越来大的观测范围和越来越高的分辨能力。

在常规的成像仪器设计中，主要集中分析物面和像面是平面的情形，通常是采用从像点到物点的顺序独立模式，仅仅考虑的是像点对物点的映射设计。在计算光场设计中，综合光学系统、光电系统和信号处理系统之间的成像关系，通过系统的一体化设计和参数调整联合优化系统性能。基于计算摄像学理论，一个好的光电成像仪器的设计并不仅仅是将高质量的透镜和大面阵探测器组合起来，还需要把照明系统、透镜系统、光电探测器和信号处理算法等综合优化，这种非常规的光学成像仪器具有优异的性能指标，光电成像仪器中用于图像捕获的物理系统和图像处理的计算系统之间的关系应该被重新定义。

现在生命研究的趋势是在活细胞中实现小尺度的细节的观察，机体应从亚细胞、细胞、组织、器官到系统，构成多尺度的特征。基于计算光学原理获得的光学成像仪器不仅需要其能够对单个细胞自身的生物学特性进行精确观测，而且在机体完整的微环境状态下具备对病理生理过程和相互影响的评估能力，可望揭示生理和病理状态下的重要生命现象的规律，这给观测光学仪器的研制提出了苛刻的要求和挑战。

因此，需要找到一种成像方法，能够处理用于图像捕获的物理系统和图像处理的计算系统之间的关系。将常规成像和计算成像有机结合，利用计算摄像技术来补偿光学系统中的多种缺陷，最终突破成像仪器突破常规成像中的物理极限，获得常规成像方法无法达到的性能和功能。

综上，现在急需一种新的显微成像方法来在保证宽视场范围同时实现从细胞、组织到器官的宏微观结合的多尺度高分辨率观测。

技术实现要素：

本发明提供了一种宽视场多尺度高分辨率显微成像系统及方法，通过对物镜的设计和成像方法的改进，突破现有生物显微系统无法在大视场下进行高分辨率观测的困境，实现兼备大尺度宏观与高分辨微观的跨尺度观测。

一种宽视场多尺度高分辨率显微成像系统，包括光源、样本、显微成像物镜、采集系统和工作站；

所述的显微成像物镜，用于对光源发出的光束照射样品后成像得到宽视场曲形像面；

所述的采集系统，包括用于分视场采集曲形像面的采集镜阵列和用于二次成像的相机阵列；

所述的工作站，对采集得到的成像重叠视场分析并通过视场拼接得到最终的宽视场高分辨率图像。

所述的显微成像物镜和采集系统之间设有分光镜组和反射镜组，所述分光镜组由半反半透的分光镜和二向色镜组成，所述的反射镜组为平面反射镜。

所述的半反半透的分光镜和二向色镜与光轴的夹角均为45°，二者可通过机械导轨装置进行移动。

所述的采集镜阵列和相机阵列为与曲形像面一致的曲面型阵列。

所述的采集镜阵列包括中继透镜阵列和像感器透镜组阵列，所述的中继透镜阵列沿着显微成像物镜所成的曲形像面放置，所述的像感器透镜组阵列对显微成像物镜所称的曲形像面进行分视场采集。

所述的相机阵列用于对分视场采集后的光线进行二次成像。

本发明还提供一种宽视场高分辨率显微成像方法，包括以下步骤：

1)光源为在样本移动台上的样本提供照明；

2)光经过显微成像物镜一次成像，形成曲形像面；

3)通过采集系统对中间的曲形像面进行分视场采集，完成二次成像；

4)将相机获取的样本图像信息传给工作站进行图像存储和拼接处理，最终得到宽视场高分辨显微图像，提供从亚细胞、组织到器官的多尺度观测数据。

优选的，所述的二次成像，是指显微成像物镜形成的曲形像面进行分视场采集后利用相机再次成像。

优选的，所述的采集系统包括用于分视场采集曲形像面的采集镜阵列和用于二次成像的相机阵列。

优选的，所述的采集镜阵列和相机阵列为与曲形像面一致的曲面型阵列。

所述高分辨宽视场显微物镜采用十组十三片球面透镜，十个透镜组分别为第一透镜组为负、第二透镜组、第三透镜组、第四透镜组、第五透镜组、第六透镜组、第七透镜组、第八透镜组、第九透镜组和第十透镜组。所述的第一透镜组至第五透镜组采用正透镜和双胶合透镜组合的结构形式，使系统主面前移获得长焦距和短工作距离。所述的第一透镜组光焦度为负，第二透镜组为双胶合透镜，第一片透镜光焦度为正，第二片光焦度为负。第三透镜组光焦度为正。第四、五透镜组为双胶合透镜，每一组的第一片透镜光焦度为负，第二片透镜光焦度为正。所述的第六透镜组至第十透镜组采用双胶合组及高阿贝系数玻璃矫正宽波段色差，延长了系统的后工作距离。所述的第六透镜组光焦度为正，第七透镜组光焦度为负，第八透镜组光焦度为负，第九透镜组光焦度为正，第十透镜组光焦度为正。

所述第一透镜组采用的材料是H-ZF52A，前表面的半径为-17.039mm，后表面的半径为-21.8mm，厚度为6.3mm。第二透镜组有两片透镜胶合而成，采用的材料分别是H-ZF52A和H-LAK3，第一片透镜的前表面半径为-114.485mm，后表面半径为-26.89mm，厚度为10.5mm；第二片透镜的后表面半径为-52.986mm，厚度为3.1mm。第三透镜组采用的材料是H-ZF52A，前表面的半径为55.534mm，后表面的半径为-122mm，厚度为29.9mm。第四透镜组和第五透镜组都是双胶合透镜组，所采用的材料都是H-ZF7LA和H-ZBAF3，第四透镜组的第一片透镜前表面半径为-89.2mm，后表面半径为24.21mm，厚度为25mm；第二片透镜后表面半径为-36.85mm，厚度为10.4mm。第五透镜组第一片透镜前表面半径为-32.214mm，后表面半径为30.2mm，厚度为2.5mm；第二片透镜后表面半径为-89.77mm，厚度为7.3mm。第六透镜组采用的材料是H-ZBAF5，前表面半径为44.253mm，后表面半径为-50.35mm，透镜的厚度为19.8mm。第七透镜组采用的材料是H-F2，前表面半径为-38.68mm，后表面半径为336.84mm，厚度为25mm。第八透镜组采用的材料是H-LAK3，前表面半径为-26.42mm，后表面半径为-222.59mm，厚度为4mm。第九透镜组采用的材料是ZF5，前表面半径为-150.714mm，后表面半径为-69.98mm，厚度为15.6mm。第十透镜组采用的材料是H-ZBAF5，前表面半径为3200mm，后表面半径为-174.5mm，厚度为13.25mm。

所述的显微物镜还包括位于孔径光阑，其位置在第六组透镜前0.5mm处。

本发明中，两步成像方法中都存在与之相关的透镜组。第一步显微成像方法包括样品被光源照射后，光经过成像物镜一次成像，形成一个弯曲像面。显微成像物镜由10组13片球面透镜来校正像差和实现宽视场范围。第二步显微成像方法包括用采集镜阵列和相机阵列采集显微成像物镜形成的中间弯曲像面。采集镜由5组7片球面透镜组成来对显微物镜形成的中间弯曲像面进行对应地分视场采集。中间弯曲像面对应于采集镜中场镜的位置，这里的场镜解决了显微成像物镜系统和采集镜系统中主光线匹配问题。相机将采集图像信息传送到工作站内进行相邻重叠视场区域的拼接。结合上述两步成像方法就可以得到多尺度下宽视场和高分辨率的显微图像。

现有的CCD成像技术虽然能够观察到宽视场范围内的样本但是在体现细胞显微结构细节上面的能力还很欠缺。另一方面，多数共焦显微镜在牺牲宽视场的前提下来保证分辨率。而且，越来越多的病理学家需要用显微镜得到亚细胞、组织到器官的多尺度观测，所以用所述的成像系统和方法来实现宽视场同时获得多尺度高分辨率的图像具有重大价值。

显微成像物镜由10组13片球面透镜构成，具有结构复杂排布精巧，相比于非球面镜易于加工实现等特点。显微成像物镜中有3组双胶合透镜和4片高折射率材料的透镜来校正系统的色差等，最终获得了1cm×1cm的厘米级宽视场。成像显微物镜所成的像面是弯曲的，因为与传统的平面像面相比，这里所述的弯曲像面能够有效地降低系统的场曲，从而很好地控制了系统整体的像差。除此之外，所述的弯曲像面作为二次成像的中间像面，打破现有光电成像系统物理边界的约束，有效减少宽视场边缘的场曲像差。同时降低了采集系统中分视场采集镜校正场曲像差的难度，从而提升了整个系统的成像质量。

在所述成像物镜系统和采集系统之间有两个用于分光和反光的镜组，其中所述用于分光的第一个镜组又由一个半反半透的分光镜和一个二向色镜组成。这两块镜子可通过机械装置进行横向移动来选择用其中一块玻璃来进行实验观察。所述的半反半透分光镜将光源发出的光一部分反射掉，一部分进入到显微系统中，为标本提供观察适宜的照明亮度。所述的二向色镜用于观察荧光标本时使用，承担色光分流的作用。所述的二向色镜对激发光波长的光有很高的反射率，而对由标本发出的荧光波长区的光有很高的透过率，即二向色镜起着反射激发光和透过荧光的重要作用。这里选择通过的是波长为555nm的绿光。所述的第二个镜组是一块平面反射镜，所述的平板反射镜不会带来任何的像差，保证显微物镜系统的清晰成像。

所述的采集系统包括采集镜阵列和相机阵列。所述的采集镜包括一片较厚的场镜和若干透镜组，场镜用来解决成像物镜系统的主光线和采集镜中主光线的匹配问题同时还减小了渐晕，后面若干的小透镜组用来对所述的弯曲像面进行分视场采集以及校正各自分视场下的像差，这样使每个小透镜组在进行分视场像差校正时具有更大的灵活度。所述的相机阵列将采集到图像信息传输至工作站进行图像拼接处理。这里所述的采集镜阵列和相机阵列是一个7×5的曲面型阵列，弯曲程度与显微成像物镜所成的曲面像一致，场镜位于采集镜的最前面，若干小透镜组位于采集镜后部，最终通过拼接技术获得的多尺度下宽视场高分辨率图像的像素代表了阵列中所有相机的像素之和，在有效观测大视场的同时大大提高了图像的分辨率。

附图说明

图1为本发明的宽视场多尺度高分辨显微成像系统整体的结构示意图。

图2为本发明的第一步宽视场显微成像方法包含的结构示意图。

图3为成像物镜的光学系统图；

图4为显微物镜的场曲和畸变曲线图。

图5为本发明的分光镜组内部结构示意图。

图6为本发明的宽视场多尺度高分辨显微成像方法的整体流程图。

图7A为本发明的采集系统阵列排布示意图。

图7B为本发明的第二步多尺度高分辨率显微成像方法包含的采集系统的示意图；

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明进一步说明。

图1为本发明的宽视场多尺度高分辨显微成像系统100的整体结构示意图，包括可调节光源200，样本300，样本移动台310，宽视场显微成像物镜400以及高分辨率采集系统700。其中显微成像物镜400包括分光镜组500和反射镜组600。高分辨成像系统700包括采集镜阵列800和相机阵列900得到分视场的图像信息以此来进行后续的数字图像处理。

如图1所示，可调节光源200用来给样本300提供照明。高分辨采集系统700是由35个采集镜和35台相机组成的一个7×5的曲面型阵列，采集系统中采集镜阵列800用来采集分视场图像并校正分视场的像差。相机阵列900将采集到的图像信息提供给工作站1000，所得到的图像信息将在工作站1000中进行图像拼接处理。

图2为本发明的第一步宽视场显微成像方法所包含的结构示意图。如图2所示，弯曲像面410是光经过宽视场显微成像物镜400，分光镜组500和反射镜组600所成的像面。弯曲像面410相比传统光学像平面能够更有效地降低系统的场曲像差，尤其是边缘视场的场曲，从而整个系统的像差都得到了很好地控制。此外，弯曲像面410作为系统的中间像面也是分视场采集系统700的物面，弯曲像面对系统像差的校正也降低了分视场采集系统700校正像差的难度，从而提升了成像系统的整体性能。

如图3所示，显微成像物镜400主要由第一透镜组201、第二透镜组202、第三透镜组203、第四透镜组204、第五透镜组205、第六透镜组206、第七透镜组207、第八透镜组208、第九透镜组209、第十透镜组210组成。这些透镜组合在一起对显微物镜系统的像差进行了校正，使显微系统的性能得到了提高。所述的第二透镜组202，第四组透镜204，第五组透镜205为双胶合透镜，第二透镜组为正负型，第四透镜组和第五透镜组为负正型，有利于获得长焦距和短工作距离。此外第三透镜组、第六透镜组、第九透镜组和第十透镜组光焦度为正，而第一透镜组、第七透镜组和第八透镜组光焦度为负。光阑位于第六透镜组的前方0.5mm处，第八组透镜用了高阿贝色散系数材料来矫正宽波段色差，这样使所述的显微物镜系统在460-650nm全波段清晰成像。

表1给出了显微物镜200的设计结果，包括各透镜的具体参数。

表1

图4是本发明的显微物镜光学系统的场曲和畸变，从图上可以看出，整个系统的最大光学畸变＜0.4％。

图5为本发明的分光镜组内部结构示意图。如图5所示，分光镜组500由一个半反半透镜510和一个分光镜520。在一般标本观察下，半反半透镜510可以用来降低光源200发出光的强度来达到最适宜的观察效果。在荧光标本观察下，分光镜520用来反射激发光和透过荧光，这里选择通过的是波长为555nm的绿光。半反半透镜510和分光镜520与光轴的夹角均为45°，二者可通过机械导轨装置530进行移动。

图6为本发明的宽视场高分辨显微成像方法的整体流程图。图像获取的方法包括如下步骤：

1)用可调节光源200为在样本移动台310上的样本300提供照明；

2)光经过显微成像物镜400一次成像，形成曲形弯曲像面410；

3)采集系统700对弯曲像面410进行分视场采集，完成二次成像；

4)将相机900获取的样本图像信息传给工作站1000进行图像存储和拼接处理，最终得到宽视场高分辨显微图像。

本实施例中，在步骤1)中，样本300既可以是普通材料也可以是荧光样本，荧光样本可以通过光源200和分光镜520激发荧光。

在步骤2)中，宽视场图像可以通过成像物镜400得到，反射镜组600与光轴的夹角为45°，用来分光改变出射光的方法，使反射后的光路与反射前的光路垂直。

在步骤3)中，采集系统700包括采集镜阵列800和相机阵列900，采集镜阵列800分视场完成分视场采集工作之后，相机阵列900将相应分视场的图像信息传给工作站1000。这样在工作站1000中就可以对图像进行分析和拼接处理。

图7A为本发明的采集系统700的阵列排布示意图。图7B为本发明的第二步高分辨率显微成像方法包含的采集系统的示意图。高分辨采集系统700由35个采集镜和35个相机组成的一个7×5曲面型阵列。曲面型阵列的曲率与显微成像物镜400所成的中间像面410的曲率相等，同时也和35个采集镜组成阵列410的排布一致。所述的采集镜包括中继透镜810和像感器透镜组820,。中继透镜810是一个采集镜的前组镜头，每一个沿着显微成像物镜400所成的中间像面410的曲率进行放置，其作用是降低了边缘光线的高度，从而解决了系统中光瞳和主光线的匹配问题。而且中继透镜810对整个成像系统光焦度是没有贡献的，所以不会影响轴上点的光束以及系统的放大倍率。

如图7所示，在采集系统700中，采集镜阵列800和相机阵列900在各自负责一部分成像以及像差的校正，增加了自由度。而相邻的像感器透镜组820之间的视场有重叠的区域，用于后续再工作站1000中的图像拼接处理工作。这样通过35个像感器透镜组820完成两步成像之后，整个一副图像代表了相机阵列900中所有相机的像素之和，将整个系统100的分辨率提高到了微米的级别。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。