在激光扫描显微镜中扫描激发辐射和/或操纵辐射的光学组件以及激光扫描显微镜的制作方法

在第一方面，本发明涉及根据权利要求1的前序部分的在激光扫描显微镜中扫描激发辐射和/或操纵辐射的光学布置。在其他方面，本发明涉及根据权利要求21的前序部分的激光扫描显微镜。

例如在de102014017001a1中描述了在激光扫描显微镜、特别是激光扫描荧光显微镜中扫描激发辐射和/或操纵辐射的通用的光学布置，并且该光学布置包括以下部件：扫描光学单元，作为第一聚焦装置以提供第一光瞳平面；第一束偏转装置，其由在第一光瞳平面中布置的第一扫描仪形成，用于在第一坐标方向上扫描激发辐射和/或操纵辐射；第二聚焦装置，用于生成与第一光瞳平面光学共轭的第二光瞳平面；以及第二束偏转装置，用于偏转激发辐射和/或操纵辐射，该第二束偏转装置布置在第二光瞳平面中。

de102014017001a1同样公开了通用的激光扫描显微镜，特别是共聚焦激光扫描荧光显微镜，并且该激光扫描显微镜包括以下部件：至少一个激光光源，用于发射激光辐射以激发和/或操纵样品；至少一个主分色器，用于将一方面激发辐射和/或操纵辐射与另一方面从样品发出的波长偏移的检测光分开；以及至少一个显微镜物镜，用于将激发辐射和/或操纵辐射引导和聚焦到样品上，且用于引导和准直从样品发出的检测光以返回到主分色器的方向上；以及检测模块，用于检测该检测光。

激光扫描显微镜已成为生物医学研究中必不可少的工具。除了纯粹成像以外，样品的光学操纵也变得越来越重要。

在此，通常的技术问题在于，在尽可能紧凑的结构空间中以尽可能低的花费且以尽可能低的透射损耗来生成各自相互成像的多个光学光瞳。在此可用光瞳的数目旨在大于或等于三个。目的是能够在可用光瞳中的至少两个之间进行切换。

已知的解决方案首先基于支架上不同端口的使用。这是不利的，因为显微镜支架因此变得复杂且昂贵。此外，在某些情况下，则不可能在同一支架上实施其他方法，例如高分辨率显微术。此外，通常必须实行复杂的调整，以便使相应的像场彼此一致。

通过仅一个扫描物镜进行操纵的已知解决方案通常是机械式，并且因此通常相对较慢。通常，相对较大的质量(例如由反射镜构成)几乎不可能比10ms更快地切换。通过振镜式扫描仪可以实现相对较短的切换时间。但是，在这种情况下，必须努力将质量惯性矩保持在较低水平。

us-7,715,078公开了在多个扫描仪之间的切换。在此，除了实际扫描样品所需的扫描仪以外，还需要至少两个其他扫描仪，这些扫描仪用于切换光束路径。此外，在所述文档中解释的实施例还公开了表示为简单透镜的折射式光学单元。然而，在此不可能在第四光瞳中容纳z扫描的反射镜。然而，特别是对于三维光学操纵，需要所述反射镜。在此，光学元件的复杂程度在于，扫描物镜是复杂的且光效率不高。

ep2042905b1公开了两个扫描仪对的组合。在此可以分别选择一个扫描仪对或另一个扫描仪对。然而，因为要移动的质量相对较大，因此无法非常快速地切换单独轴线。

de10050529b4公开了多个束偏转单元的组合，该多个束偏转单元各由两个束偏转模块构成。在示例性实施例中还描述了束偏转装置之间的成像光学单元。但是，不可以在不同的扫描模式之间进行切换。也没有描述用于影响波前的构件。

可以认为，由本发明解决的一个问题在于创建提供其他光瞳平面的光学布置，其中旨在于仅占用很少的附加结构空间。此外，本发明的目的是能够尽可能快速地在光瞳平面之间来回切换。最后，目的是创建一种具有附加光瞳平面的激光扫描显微镜，其中可以尽可能快速地在不同光瞳平面之间来回切换。

该问题通过具有权利要求1的特征的光学布置解决。关于显微镜，该问题通过具有权利要求21的特征的激光扫描显微镜解决。

根据本发明，上述指定类型的光学布置是借助于以下事实而开发：存在第三聚焦装置，用于生成关于第一光瞳平面光学共轭的第三光瞳平面；在该第三光瞳平面中布置第三光束偏转装置，用于偏转激发辐射和/或操纵辐射；并且存在可变光束偏转构件，用于在第一光束路径和第二光束路径之间切换光束路线。

特别优选地，第一光束路径可以至少从可变光束偏转构件、经由第三光束偏转装置、同时绕过第二光束偏转装置到第一扫描仪延伸。特别优选地，第二光束路径可以至少从可变光束偏转构件、同时绕过第三光束偏转装置、经由第二光束偏转装置到第一扫描仪延伸。

借助于存在根据本发明的扫描激发辐射和/或操纵辐射的光学布置的事实，根据本发明开发了上述指定类型的激光扫描显微镜。

从属权利要求涉及根据本发明的光学布置和根据本发明的激光扫描显微镜的有利变型，并且下面特别是结合附图附加地描述所述变型。

在本说明书的上下文中的光学布置表示一布置，该布置特别是包括光束成形部件(例如透镜和凹面反射镜)和光束偏转部件(例如反射镜)，该光束偏转部件特别是可移动的。

对于第二光束偏转装置和第三光束偏转装置，重要的是将辐射以限定的方式偏转。特别优选的变型的区别在于：在第二光瞳平面中的第二光束偏转装置是第二扫描仪，该第二扫描仪特别是在与第一坐标方向不同的第二坐标方向上扫描激发辐射和/或操纵辐射；和/或在第三光瞳平面中的第三光束偏转装置是第三扫描仪，该第三扫描仪特别是在与第一坐标方向不同的第二坐标方向上扫描激发辐射和/或操纵辐射。

术语扫描被理解为是意味着将激发辐射或操纵辐射的光束在样品上受控制地引导。该扫描可以以有规律的模式进行，例如逐行地进行，但是特别地还沿着预先定义的轨迹进行。

在本说明书的上下文中，术语扫描仪，例如第一扫描仪、第二扫描仪和第三扫描仪，表示可以至少在一个坐标方向上更改光束的方向的装置。可枢转的反射镜特别优选地用作扫描仪。

就本说明而言，激发辐射被理解为意味着通常用于成像的电磁辐射(特别是可见光、以及红外和紫外辐射)。所述激发辐射更一般地由激光器提供。在这种情况下，可以使用各种对比方法。特别优选的是用于从染料激发荧光的辐射，用该染料制备待检查的样品。激光扫描荧光显微镜用于测量该荧光。然而，原理上还可以涉及用于光学显微镜的照明光。

操纵辐射表示电磁辐射，特别是在可见光范围内，以及在红外和紫外线范围内，该电磁辐射可用于实现对待检查的样品有目标地更改，特别是在以有目标的方式选择的空间区域内或者以有目标的方式选择的和待预先定义的轨迹中。

在本说明书中，同义使用以下术语：一方面是激发辐射和激发光，以及另一方面是操纵辐射和操纵光。

术语检测光被理解为意味着这样的光：其由于激发而由样品发射，并且旨在于通过整个光学布置进行检测。特别地，检测光可以是荧光。

就本说明而言，术语光瞳平面被理解为意味着一光学平面，该光学平面在激光扫描显微镜中的光学布置的操作状态下，关于在各个情况下使用的显微镜物镜的后物镜光瞳是光学共轭的。作为示例，在根据本发明的扫描的装置的操作状态下，第一光瞳平面、第二光瞳平面、第三光瞳平面和第四光瞳平面关于显微镜物镜的后光瞳是光学共轭的。因为后物镜光瞳的位置变化，因此通常仅对于一个物镜，光瞳平面关于后物镜光瞳恰好是光学共轭的。对于其他物镜，光瞳平面关于后物镜光瞳近似光学共轭。在本说明书中，术语光瞳和光瞳平面同义使用。

原则上，根据本发明的布置可以生成所期望的许多个光瞳。然而，重要的应用已经受益于相互成像的四个光瞳，该四个光瞳具有可管控的调整复杂度和低光学损耗。

扫描光学单元(也就是说第一聚焦装置)通常由镜头的布置构成，通过该镜头的布置生成与后物镜光瞳等同的第一光瞳平面。

当在本说明书的上下文中提及坐标方向时，在此特别是指笛卡尔坐标。作为示例，第一坐标方向可以是y方向，第二坐标方向可以是x方向。通常坐标系选择为使得系统的光轴与z轴重合。

原则上，任何聚焦部件(特别是镜头或镜头组)都可以用作第二聚焦装置和第三聚焦装置，以生成光瞳平面。特别优选地，使用凹面反射镜、特别是复曲面凹面反射镜或球面凹面反射镜作为第一聚焦装置和/或第二聚焦装置。

在这种情况下，如果经由第一凹面反射镜的光学路径设计为使得实现放大(|v|＞1)或缩小(|v|＜1)，则可是特别有利的。如果旨在于将不同的扫描仪相互组合，则是特别有利的。作为示例，已知的是，如果给出共振频率和动态反射镜形变，则共振mems扫描仪仅可以实现特定直径。另一方面，准静态振镜式扫描仪存在最优尺寸，该最佳尺寸与共振mems扫描仪的尺寸不一致。为了两个扫描仪系统的最优光学组合，通过放大平台来调整光瞳直径可以是非常有利的。在某些范围内，在此可以允许偏离1∶1成像，因此，不同尺寸的可选扫描仪可以位于相应的位置中。

根据本发明的光学布置的特征在于高灵活性。作为示例，第二光束偏转装置和/或第三光束偏转装置还可以是固定的反射镜、其表面可以主动地弯曲的反射镜、或一些其他更改波前的元件。作为示例，通过其表面可以主动地弯曲的反射镜，或通过一些其他更改波前的元件，可以沿光轴(例如在z方向上)更改聚焦，并且在这个意义上可以实行z扫描。此外，通过这样的更改波前的元件，在样品中的穿透深度增加时，可以补偿由于折射率不匹配而引起的像差。其表面可以主动地弯曲的反射镜通常最初是平坦的，然后可以变形，例如形成凹面反射镜。

术语可变光束偏转构件表示一部件，该部件允许进行任何类型的调整或设定，并且因此取决于所述调整或设定使入射光或入射辐射不同程度地偏转。特别地，在此是指可变调整的反射镜。

在第一光束路径和第二光束路径之间切换光束路线意味着取决于切换状态，光或辐射穿过第一光束路径或第二光束路径通行。第一光束路径和第二光束路径在此是不同的，也就是说，存在不作为第二光束路径的部分第一光束路径的部分，反之亦然。但是，原则上也可以基于电磁辐射的特定性质，也就是说激发辐射或操纵辐射的性质来实现区分。特别地，可变光束偏转构件可以取决于入射的激发辐射或操纵辐射的偏振和/或波长对入射的激发辐射或操纵辐射进行反射或透射。

为了实现本发明，关于第一光束路径和第二光束路径，原则上重要的是：在第一光束路径的情况下，经由第一扫描仪和第二光束偏转装置(特别是第二扫描仪)引导激发辐射和/或操纵辐射；以及在第二光束路径的情况下，经由第一扫描仪和第三光束偏转装置(特别是第三扫描仪)引导激发辐射和/或操纵辐射。在根据本发明的光学布置的一种有利的配置中，第一光束路径通过第三聚焦装置，和/或第二光束路径通过第二聚焦装置。

原则上，为了实现本发明，关于光瞳平面相互之间的相对位置，重要的是：光瞳平面在各个情况下关于彼此是光学共轭的。在根据本发明的光学布置的特别优选的变型中，相对于激发辐射和操纵辐射，第二光瞳平面位于第一光瞳平面的光束上游，并且第三光瞳平面位于第一光瞳平面和/或第二光瞳平面的光束上游。

在第一光束路径的情况下绕过第二光束偏转装置、特别是第二扫描仪的特征旨在于表达以下事实：特别是采用第一光束路径的操纵辐射不会与第二扫描仪接触。因此，所述第二扫描仪的可能运动特别是不会影响操纵辐射。

对应地，在第二光束路径的情况下绕过第三光束偏转装置、特别是第三扫描仪的特征旨在于表示以下事实：特别是采用第二光束路径的激发辐射不会与第三台扫描仪接触。

本发明特别适用于共聚焦激光扫描荧光显微镜。在这种情况下，显微镜物镜用于将激发辐射和/或操纵辐射引导和聚焦在样品上或到样品的区域中，并且还用于引导和准直检测光，该检测光源自样品中被激发辐射和/或操纵辐射照明的区域。

在本说明书的上下文中，术语检测模块表示最终检测由被照明的样品发射的检测光的部件。取决于使用的目的，这样的检测模块特别地包括至少一个辐射检测器，并且特别地可以包括滤色器和共聚焦光阑。

可以认为本发明的主要构思是：使用适当的聚焦构件、特别是凹面反射镜，创造其他光瞳平面，其中特别是可以布置其他扫描仪。因此，本发明的一种变型的其他基本构思在于：借助于可变光束偏转构件，经由包括第三光束偏转装置、特别是第三扫描仪的第一光束路径，且绕过第二光束偏转装置、特别是第二扫描仪来引导激发辐射和/或操纵辐射的光束；或者替代地由包括第二光束偏转装置、特别是第二扫描仪的第二光束路径，且绕过第三光束偏转装置、特别是第三扫描仪来引导激发辐射和/或操纵辐射的光束。如果用于特定坐标方向的第二扫描仪和用于所述坐标方向的第三扫描仪在性质上是不同的，特别是如果第二扫描仪是共振扫描仪且第三扫描仪是准静态扫描仪，则可以实现特定的优点。因此，借助于根据本发明的可变光束偏转构件，可以在快速扫描仪和慢速扫描仪之间来回切换。由于原理上可以极度快速地(数量级为1ms或更小)来实现光束路径的这样的切换，所以还可以在两个光束路径之间切换并且因此在操纵模式和成像模式之间非常快速地切换。

此外，根据本发明的布置功能强大且可以用于解决不同的问题。

根据本发明的光学布置特别适用于共聚焦激光扫描荧光显微镜。因此，根据本发明的激光扫描显微镜可以特别优选地是(特别是共聚焦的)激光扫描荧光显微镜。

根据本发明的光学布置和根据本发明的激光扫描显微镜可以优选地用于操纵生物样品，特别是在三维上。然而，在材料显微术中的应用也是可以想到的。特别地，借助于激光光栅扫描在不同模式之间、特别是在光学操纵和成像之间的快速切换也是可能的。根据本发明的光学布置特别是还可以对于多个波长组合进行操作，而不必重新设计。

根据本发明的布置还能够用于光学操纵、光片显微术、以及其中通过激光束扫描样品的其他方法。

本发明的一个主要优点在于：在激光扫描显微镜中，可以一方面使用准静态扫描仪实行成像或光学操纵，另一方面可以使用共振扫描仪实行快速成像。

术语准静态扫描仪表示不是共振地操作，而是相对较慢地、准静态地操作的扫描仪。特别地，可以将驱动曲线施加在准静态扫描仪上。所述驱动曲线可以被线性化，例如，使得可以将相同的驻留持续时间分配给每个像素。共振扫描仪仅允许类似正弦的运动，然而该运动频率可以非常高。共振扫描仪或共振式扫描仪将以机械共振方式操作，通常与准静态扫描仪相比要快得多。准静态扫描仪和共振操作的扫描仪二者都可以由振镜式扫描仪(还称为振镜扫描仪或mems扫描仪)来实现。

原则上，声光装置、特别是声光扫描仪还可以用于光束偏转装置，特别是扫描仪。

特别地，本发明使得能够在操纵模式和成像之间非常快速地实现切换。在此，非常快速地意味着可以比大约10ms更快地或比1毫秒(ms)更快地实现切换。

这种快速切换是可能的，特别是不需要在光束路径中切换用于光束路径切换的附加移动部件。因此可以避免不稳定性和与其关联的其他技术问题。

此外，还可以进行三维光学操纵，例如有目标的空间漂白(关键字：frap，解开)或离子通道的光遗传学切换等，并且然后进行可能非常快速的成像切换。对于三维光学操纵，需要影响三个空间自由度的可能性；特别地，三个光学元件是必需的。第三维度可以经由例如动态波前弯曲的反射镜解决。可以用来更改轴向焦点位置的这样的部件还被称为z扫描或自适应散焦元件。这些元件由于它们的几何尺寸很好地由光学反射镜扫描仪来增强。因此，焦点位置在z坐标的方向上的轴向运动通过影响给定光束方向的波前来实现，并且因此与横向扫描运动(在x方向和y方向上)基本上不同，其中光束方向经由可偏转反射镜进行调整。

还可以关于旨在于通过相同扫描镜头实行成像和操纵的边界条件，有利地使用本发明。在这种情况下，在显微镜支架上仅占用一个端口。此外，根据本发明的布置的一个特别优点在于，其可以以一方面激发辐射的波长与另一方面操纵辐射的波长的多个组合进行操作。

如果用于操纵和成像的波长旨在于是相同的，则对于上文所描述的任务提出了特别的挑战。对于两个波长都不同——其也具有实际关联——的情况，可以使用分色器。

除了光学操纵以外，xy/z扫描系统(特别是具有自适应散焦)也非常适合以成像方式扫描三维样品中的任意轨迹和平面。如果希望特别是用多光子激发对体积内的限定的结构进行快速成像，则这是特别有利的。作为示例，可以对在三维体积中遵循不规则路线的神经元进行成像。如果所述神经元旨在于非常快速地成像，或者沿着所述神经元的信号转导(例如ca(2+)波)旨在于被光学测量，则根据本发明的光学布置能够跟踪体积中运动的这种结构。

本发明还可以有益地用于所谓的光片显微术。这是zsigmondy和siedentopf于1902/1903在卡尔蔡司进行胶体研究所开发的一项旧技术。在很长时间内几乎被遗忘，这种方法由e.stelzer的新工作而经历了复兴。在数字数据的处理中的巨大进展特别刺激了这项技术。

在光片显微术中，至少在不是基于用柱状镜头的照明的实施例中，任务同样涉及使用激光束扫描样品。此处，多个光瞳也是特别有利的，因为除了二维的光束扫描以外，还旨在于实行动态光束形成；例如，参见dean等人于2015年在《生物物理期刊》的第108卷中第2807-2815页发表：具有轴向扫描的光片显微术的不合去卷积的亚细胞成像(deconvolution-freesubcellularimagingwithaxiallysweptlightsheetmicroscopy)。在此，还可以有利地使用根据本发明的光学布置和根据本发明的激光扫描显微镜。

附加地，根据本发明的光学布置可以用于线性荧光激发且用于非线性荧光激发(例如用于多光子显微术)二者。所有常规的和已知的方法可以具有布置(双光子、三光子或多光子荧光；cars；srs等)。如今，主要是双光子显微术是检查活体样品的标准方法。特别是在所谓的神经成像中，样品的三维操纵对于理解活体动物大脑中的神经生物学过程起着重要的作用。

原则上，对于所使用的扫描仪，重要的是：以期望的速度和准确度实行在相应坐标方向上的光束偏转。特别优选地，第二扫描仪是共振扫描仪，第三扫描仪是振镜式扫描仪。对于第二扫描仪(也就是说快速共振扫描仪)证实特别有利的是：在第二光束路径的情况下被绕过，也就是说不再起作用。这意味着快速第二扫描仪可以被非常快速地切换。原则上，第二扫描仪和第三扫描仪是可互换的，也就是说，如果第三扫描仪是共振扫描仪并且第二扫描仪是准静态扫描仪，则这也是有利的。两种变型在特定情况下都是有利的。

两种变型使得在使用快速扫描仪的成像模式和通过慢准静态振镜式扫描仪实行的激发模式之间非常快速地来回切换成为可能。

因为对于成像模式，如果快速扫描仪可用于一个坐标方向通常就足够了，所以在另一个有利变型中，第一扫描仪可以同样是相对较慢的扫描仪且特别是振镜式扫描仪。

原则上，二维扫描仪(例如具有单个枢转点的二维mems扫描仪)还可以布置在空间上最靠近扫描光学单元的第一光瞳平面中。

在那种情况下，还可以将共振扫描仪定位在光瞳的每一个中，其中形成振荡轴线，使得样品中的扫描的线有利地但非必须地形成90°的角。因此，尽管不能连续旋转像场，但是还可以在某些范围内适配于样品的几何体。然而，该模式需要光学单元(特别是凹面反射镜)来透射足够大的场。

对于用于在第一光束路径和第二光束路径之间切换的可变光束偏转构件，重要的是，原理上可以足够快速地进行期望的切换。在特别优选的变型中，可变光束偏转构件包括至少一个定位可变的反射镜。特别有利的是，在此使用非常轻的反射镜，以便使要移动的质量并且因此发生的和必要的力保持较小。特别是，可变光束偏转构件可以由定位可变的反射镜构成。

反射镜的定位可变性原则上可以在技术上以各种方式实现。在相对简单地实现的实施例中，存在用于将反射镜移入和移出光束路线或用于将反射镜枢转入和枢转出光束路线的构件。

在其他相对简单的变型中，该变型附加地具有机械上有利的性质，该反射镜是具有(特别是振镜式)旋转装置的旋转反射镜。由于相对较低的质量惯性矩，振镜式扫描仪特别适合在不同的光束路径之间快速切换。

对于反射镜本身，重要的是，原则上激发辐射和/或操纵辐射被充分有效地反射。如果要对于不同的波长旨在于实现不同的性质，则可变光束偏转构件包括电介质和/或二向色反射镜可以是有利的。

根据本发明的光学布置的一种特别优选的实施例变型的特征在于以下事实：可变光束偏转构件包括波长相关和与偏振相关的电介质和/或二向色反射镜，其中所述反射镜将具有第一波长和第一偏振态的激发辐射和/或操纵辐射透射，将具有第一波长和第二偏振态(与第一偏振态不同)的激发辐射和/或操纵辐射反射，并且将由样品发射的、具有与波长的偏振态无关的红移波长的荧光透射。

作为示例，在这种情况下，相对于电介质和/或二向色反射镜的第一偏振态可以是s偏振，而相对于电介质和/或二向色反射镜的第二偏振态可以是p偏振。然而，原则上，相对于电介质和/或二向色反射镜，相反的分配也是可能的，也就是说，第一偏振态可以是p偏振，并且对应地，第二偏振态可以是s偏振。

这样的电介质和/或二向色反射镜在光束路线中的布置有利地使得通过在s偏振和p偏振之间切换能够实现在激发辐射和/或操纵辐射的第一光束路径和第二光束路径之间进行切换。

特别有利的是，将具有第一偏振的激发辐射和具有第二偏振的操纵光辐照入射。这意味着，例如，经由第一光束路径、特别是经由第三扫描仪将操纵辐射引导到扫描光学单元、且因此进而到达显微镜物镜，并且对应地，经由第二光束路径、特别是经由第二扫描仪将激发辐射引导到扫描光学单元、且进而到达显微镜物镜。

出于适当地使用上文所描述的波长相关和偏振相关的电介质和/或二向色反射镜的目的，在根据本发明的光学布置的优选变型中，在波长相关和偏振相关的反射镜的光束上游处、在该光束路线中布置可变偏振旋转装置。

所述可变偏振旋转装置可以包括例如电光调制器(eom)和/或可移入和移出光束路线的半波板。

特别是如果使用如上所描述的类型的波长相关和偏振相关的电介质和/或二向色反射镜，则可变光束偏转构件可以包括至少一个固定定位的反射镜。

在根据本发明的激光扫描显微镜的特别优选的配置中，存在用于具有多个照明通道的多点照明的装置。在这种情况下，本发明使得例如将一个照明通道的光(例如操纵辐射)引导在第一光束路径上，以及将其他照明通道的光(特别是激发辐射)引导在第二光束路径上成为可能。在这种情况下，其他照明通道可以用于成像。

在一个优选的变型中，多点照明的装置包括用于控制单独照明通道的多通道的aotf。在这种情况下，可以单独且分别设定光在单独的照明通道中的光谱成分和强度。

有利地，对于照明通道中的至少一个，可以存在可变偏振旋转装置，特别是半波板和/或电光调制器。通过例如为操纵辐射适当地设定偏振，因此可以实现的是，经由特定的期望光束路径在相关的照明通道中引导操纵辐射。然后可以在相应的另一光束路径上引导激发辐射。

然而，其他光瞳平面还使得在激发辐射和/或操纵辐射的波前中实现干预。根据这个观点，如果其他光束偏转部件是可调整的反射镜(其表面可以是主动地弯曲的)、或分段式反射镜、或操纵波前的一些其他装置，则可以是有利的。

作为示例，波前可以通过在2016年10月12日在《生物医学光学期刊(j.biomed.opt.)》第21卷，第12期，第121507页中所描述的类型的元件来操纵，文中特别是参见图2，使得在样品中以高速实现重新聚焦。

这种类型的更改波前的元件通常通过相对复杂的中继光学单元被引入到光束路线中。特别是对于还旨在于实行共聚焦测量的系统，所述中继光学单元导致相当大的且通常不可接受的光损耗，并且该中继光学单元价格昂贵且难以调整。除此以外，通过中继光学单元几乎不可能以如上所描述的方式在操纵和成像之间快速切换光束路径。

根据本发明的光学布置在这方面还提供了相当大的改进。通过特别是将快速波前成形的元件引入到光瞳平面中的一个中，通过本发明的布置可以使得其他模式可用，该模式特别支持诸如在光遗传学中使用的三维操纵。这样的元件例如由revibro光学(波兹曼(bozeman)，mt59717)提供。当然，在此还可以使用替代部件，该替代部件可以使得期望的功能可用，但是为此需要光瞳。通过可快速调整的z扫描元件或自适应散焦元件与准静态扫描仪的结合，可以在三维体积中实行光学操纵。

根据本发明的布置的一个主要优点还在于以下事实：总是可以在根据本发明的布置的外部的光瞳中或中间像中执行波前影响，因为在根据本发明的布置的情况下进行扫描过程期间光瞳保持固定。

在根据本发明的光学布置的其他特别优选的实施例变型中，存在控制单元，用于以相互协调的方式驱动第一扫描仪、第二光束偏转装置、第三光束偏转装置和/或可变光束偏转构件。所述控制单元不仅可以特别优选地是pc，而且原则上可以是其他(特别是可编程的)部件，诸如微控制器。

特别有利地，控制单元可以被配置为以相互协调的方式驱动第一扫描仪，第二光束偏转装置，第三光束偏转装置和/或可变光束偏转构件，使得与是横穿第一光束路径还是第二光束路径无关，将激发辐射或操纵辐射施加到相同的样品位置。特别地，实施例变型是优选的，其中取决于可变第二光束偏转构件的位置，第一扫描仪被跟踪为使得与是横穿第一光束路径还是第二光束路径无关，将激发光或操纵光施加到样品上的相同位置。

此外，控制单元可以用于驱动根据本发明的光学布置的其他部件，例如可变光束偏转装置、可变偏振旋转装置和/或操纵波前的装置，例如分段式反射镜或者其表面可以主动地弯曲的反射镜。

为此，根据本发明的激光扫描显微镜的变型是特别优选的，其中对于照明通道中的至少一个，存在用于操纵偏振的装置，该装置还可以被称为偏振旋转装置(特别是半波板)。通过用于操纵偏振的所述装置，也就是说用于切换偏振的装置，可以在第一光束路径和第二光束路径之间来回切换至少一个照明通道的光束路线。

此外，本发明的一个特别优点在于，其原则上可以用于不同的显微镜技术。

作为示例，根据本发明的激光扫描显微镜可以被配置为基于至少一个非线性对比原理来生成对比度。特别地，非线性对比原理可以是多光子荧光、例如双光子荧光或三光子荧光，cars(相干反斯托克斯拉曼散射)或srs(受激拉曼散射)。特别优选地，根据本发明的显微镜是双光子激光扫描显微镜。

特别优选地，根据本发明的显微镜还可以是共聚焦显微镜，特别是共聚焦激光扫描荧光显微镜。如果在关于像平面共轭的平面中存在针孔，则该显微镜被称为共聚焦显微镜。

由于多光子荧光的非线性导致激发体积的集中，因此这样的共聚焦光阑在多光子扫描显微镜或多光子荧光扫描显微镜中并非绝对必要的。

下面参考示意图解释本发明的其他优点和特征，附图中：

图1示出了根据本发明的光学布置的第一示例性实施例；

图2示出了其中对于特定的电介质和二向色反射镜，根据偏振来绘制反射系数与波长的关系图；

图3示出了根据本发明的激光扫描显微镜的示意图；以及

图4示出了根据本发明的光学布置的第二示例性实施例。

在所有附图中，相同且作用相同的部件总体上由相同的附图标记标识。

作为示例，下面考虑通过准静态扫描仪执行样品中的空间目标操纵的情况。然后旨在于非常快速地实现切换到成像。在此作为基础的是，期望以所谓的视频速率来记录特定尺寸的图像。在激光扫描显微镜的情况下，例如可以使用所谓的共振扫描仪。对于来自图1的以下示例，还假设用488nm处的激光线来实现光学操纵和用于成像的荧光的激发，因为这是经常发生的应用情况。

该问题通过根据本发明的光学布置sm来解决，该光学布置sm用于在激光扫描显微镜、特别是激光扫描荧光显微镜中扫描激发辐射和/或操纵辐射，如图1所示。在这种情况下，三个扫描仪s1、s2和s3一个接另一个地接连地布置，其中所有扫描仪相互的成像实现了所有扫描仪都位于光瞳平面中的效果。这是关键点，因为这确保了光瞳平面保持固定且均匀地记录像场，也就是说所谓的边缘光衰减非常低。

光学布置sm首先包括提供第一光瞳平面p1的扫描光学单元so，以作为基本部件。在操纵状态下，也就是说在光学布置sm与激光扫描显微镜相互作用或并入到所述显微镜中的状态下，所述第一光瞳平面p1关于显微镜物镜的后物镜光瞳是光学共轭的。作为第一光束偏转装置的第一扫描仪s1布置在所述第一光瞳平面p1中，所述第一扫描仪用于在第一坐标方向y上扫描激发辐射和/或操纵辐射10。扫描仪s1例如可以是准静态(特别是振镜式)扫描仪。在操纵期间，示意性示出的扫描仪反射镜s1绕着图1中垂直取向的轴线来回枢转，即，该轴线垂直于附图平面且平行于x方向延伸。

然后存在第一聚焦装置，其在所示示例中是第一凹面反射镜h1。所述第一凹面反射镜h1用于提供关于第一光瞳平面p1光学共轭的第二光瞳平面p2。作为第二光束偏转装置的第二扫描仪s2布置在第二光瞳平面p2中，所述第二扫描仪用于在与第一坐标方向y不同的第二坐标方向x上扫描激发辐射和/或操纵辐射。图1中示意性示出的xyz坐标系是笛卡尔坐标系，即，第一坐标方向y垂直于第二坐标方向x。在中间像平面zb和扫描光学单元so之间的区域中，光轴12的方向平行于z轴延伸。第二扫描仪s2例如可以是共振扫描仪。在操作期间，如图1示意性所示，扫描仪反射镜s2绕着平行于z方向取向的轴线来回枢转。

此外，存在第二聚焦装置，其在所示示例中是第二凹面反射镜h2。第二凹面反射镜h2用于生成关于第一光瞳平面p1光学共轭的第三光瞳平面p3。作为第三光束偏转装置的第三扫描仪s3布置在所述第三光瞳平面p3中，所述第三扫描仪用于同样在第二坐标方向x上扫描激发辐射和/或操纵辐射10。类似于第一扫描仪s1，第三扫描仪s3可以是准静态(特别是振镜式)扫描仪。

在第二扫描仪s2和第三扫描仪s3的光束上游，根据本发明存在可变光束偏转构件20，用于在第一光束路径和第二光束路径之间切换光束路线。在图1所图示的示例中，可变光束偏转构件20由波长相关和偏振相关的电介质和/或二向色反射镜24和固定的反射镜30形成。相对于在电介质和/或二向色反射镜24的光束上游的激发辐射16和操纵辐射10，此外，示意图示出了根据本发明的显微镜的主分色器hft，以及在其光束上游的偏振旋转装置50。如图1示意性所示，主分色器hft在原理上以已知的方式将入射的操纵辐射10和激发辐射16反射。与之相比，来自相反方向(也就是说来自扫描光学单元so)的检测光14被允许穿过主分色器hft或由主分色器hft透射，所述检测光与激发光相比发生红移，即具有较长的波长。偏振旋转装置50可以是例如半波板或电光调制器，该半波板机械地移入或移出光束路线，或者以保留在光束路线中的方式绕光轴旋转，通过该电光调制器可以用本身已知的方式设定操纵辐射10或激发辐射16的偏振方向。

根据本发明，在这种情况下，第一光束路径从可变光束偏转构件20、24、30，经由第三扫描仪s3，同时绕过第二扫描仪s2行进到第一扫描仪s1，第二光束路径从可变光束偏转构件20、24、30，同时绕过第三扫描仪s3，经由第二扫描仪s2行进到第一扫描仪s1延伸。

在图1所图示的示例中，第一光束路径附加地行进通过第二凹面反射镜h2，第二光束路径行进通过第一凹面反射镜h1。

重要的是，通过致动偏振旋转装置50，使经由第二扫描仪s2的光束路径以及因此所述第二扫描仪s2的作用被停用或关闭。因此实现了在具有共振扫描仪的二维扫描和不具有共振扫描仪的二维扫描之间的切换。

参考图3解释根据本发明的激光扫描显微镜的构造。其中示意性图示的激光扫描显微镜100包括作为基本部件的激光器模块lm、主分色器hft、根据本发明的扫描激发和操纵光10的光学布置sm、显微镜物镜mo、以及检测模块dm。激光器模块lm用作激发光16和操纵光10的辐射源。在图3示意性图示的示例中，由激光器模块lm发射的激发光16或操纵光10入射在多点模块40上，它将入射光束分成多个光束集，最后所述光束集被聚焦到样品s上或样品s中的不同聚焦体积中。可以例如通过多通道aotf分别为单独的部分光束设定光谱成分和强度。激光器模块lm、多点模块40、根据本发明的用于扫描的光学布置sm、物镜转台(未示出)和检测模块dm经由连接线71至75连接至控制和评估单元pc，其可以是市售的计算机。

在通过多点模块40之后，激发光16或操纵光10经由主分色器hft通行到根据本发明的扫描激发光16和/或操纵光10的光学布置sm。光学布置sm的扫描光学单元so将激发光16或操纵光10聚焦到中间平面zb中。经由其他部件、例如图3中未示出的反射镜，激发光16或操纵光10经由后物镜光瞳p通行到显微镜物镜mo中，该显微镜物镜mo将光聚焦到位于样品平面sp中的样品s上或中的多个聚焦体积中。分开的聚焦体积的数目对应于在多点模块40中生成的分开的光束集的数目。如果省略了多点模块40，则激发光或操纵光10、16会聚焦到焦点上。通过根据本发明的用于扫描的光学布置sm，在中间像平面zb中且因此在关于中间像平面zb光学共轭的样品平面sp中扫描激发光或操纵光10、16的聚焦体积。

首先，参考图1，现在将给出对操纵光10的光束路线的解释，例如该操纵光10的光束路线实现了在样品s中进行限定操纵，例如沿着特定轨迹进行限定漂白。一旦如下文解释的实行了所述漂白，就可以快速地切换根据本发明的光学布置sm，并且可以借助于激发光16在成像模式下观测样品。

为此，首先将解释波长相关和偏振相关的电介质和/或二向色反射镜24的功能。反射镜24的反射与波长相关，使得在较短的波长处实现偏振相关的分束，而在较长的波长处很好透射发射的两个偏振分量。

这将结合图1和2更加详细地进行解释。在图1的实施例变型中，通过针对一方面激发光16，另一方面操纵光10有目标地设定偏振来实现第一光束路径和第二光束路径之间的切换。电介质和/或二向色反射镜24关于激发光16、操纵光10和检测光14的所使用波长以有目标的方式设计成通常所期望的，并且电介质和/或二向色反射镜24具有以下结合图2考虑而解释的二向色性质。

图2示出了其中绘制了电介质和/或二向色反射镜24的反射系数与入射光的波长的关系图。该数据与光在反射镜24上的45°的入射角有关。虚曲线与s偏振有关，实曲线与p偏振有关。从图2可以明显看出，在由附图标记61所标识的波长值的情况下，s偏振情况下的反射系数几乎为1，同时p偏振情况下的反射系数几乎为0。

光谱反射轮廓内的位置确保：对于操纵/激发波长，实现高反射率(s偏振分量)或高透射率(p偏振分量)。

在所述波长61处，因此s偏振光几乎完全被反射，而p偏振光几乎完全被透射。这意味着切换偏振使得可以在反射和透射之间切换。荧光发射例如由区域62标识。在此，将两个偏振分量高效地透射。这些性质在图1的示例性实施例中得以利用。

借助于偏振旋转装置50，对于入射在第三扫描仪s3上的光，可以在两个相互垂直的位置之间调整偏振。在这种情况下，偏振旋转装置50布置为使得相对于电介质和/或二向色反射镜24可以设定s偏振或p偏振。

对于旨在于采用操纵模式，也就是说旨在于将操纵光10施加到样品上的情况，通过偏振旋转装置50有利地设定为s偏振。

来自主分色器hft的s偏振的操纵光10入射到电介质和/或二向色反射镜24上。由于s偏振设定，操纵光10在反射镜24上被反射，并且在第三光瞳平面p3中的第三扫描仪s3的方向上被引导。在图1所图示的示例性实施例中，第三扫描仪s3是准静态的(特别是振镜式)扫描仪，其在x方向上相对较慢地扫描操纵光10。

然后，来自第三扫描仪s3的操纵光10经由第二凹面反射镜h2而前进到第一扫描仪s1上。第一扫描仪s1同样是准静态的(特别是振镜式)扫描仪，其在y方向上相对较慢地扫描操纵光10。因此，在在第一光束路径中使用操纵光10的情况下，第二快速扫描仪s2被停用。

第一扫描仪s1和第三扫描仪s3的适当驱动使得可以实现在样品中进行期望操纵，例如沿着特定轨迹进行漂白。

用于快速重聚焦的光学元件(诸如由revibro光学(波兹曼、mt59717)在商业上提供)还可以布置在图1中未示出的其他光瞳平面中。使用其表面可以主动地弯曲的这样的可变反射镜、或者是波前调制元件，在z方向上的聚焦的非常快速的变化是可能的。在这方面，原则上还可以通过操纵光10操纵样品中的三维轨迹或自由选择的体积。

在完成操纵后，可以希望尽可能快速地将光学布置sm切换到成像模式中。为此，借助于偏振旋转装置50将激发光16的偏振设定为p偏振。

来自主分色器hft的p偏振的激发光16然后同样入射在电介质和/或二向色反射镜24上，但是由于p偏振通行穿过电介质和/或二向色反射镜24，且然后入射到固定的反射镜30上。将激发光从固定的反射镜30反射到位于第二光瞳平面p2中的第二扫描仪s2的方向上，该第二扫描仪s2在x方向上扫描激发光16。在图1所示的示例中，第二扫描仪s2是共振扫描仪，也就是说，与第一扫描仪s2和第三扫描仪s3相比要快得多的扫描仪。激发光16然后从第二扫描仪s2通行到第一凹面反射镜h1上，并且从第一凹面反射镜h1通行到第一扫描仪s1上。从第一扫描仪s1开始，光束路线则与如上所描述的操纵光10的光束路线相同。

对于由样品s发射且在相反方向上通行穿过光束路线的检测光14，由于波长红移，上述考虑不适用。从图2显而易见的是，在由附图标记62标识的波长区间中，对于s偏振且对于p偏振，反射系数都非常低。这意味着，与光的偏振无关，由电介质和/或二向色反射镜24很好地透射了该波长范围62中的光。反射镜24以有目标的方式制造为使得检测光14的典型波长精确地处于区间62中。图1所示的示例性实施例的结果是，可以通过分别适当地设定激发光16和操纵光10的偏振，在第一光束路径和第二光束路径之间来回切换，该第一光束路径经由第三扫描仪s3同时绕过第二扫描仪s2通行，并且该第二光束路径经由第二扫描仪s2同时绕过第三扫描仪s3通行。

在根据本发明的装置的一个特别优选的配置中，特别是在从第一光束路径改变到第二光束路径时或反之亦然，特别是以自动化的方式跟踪第一扫描仪s1，特别使得第一光束路径和第二光束路径的光束路线再次与第一扫描仪s1的光束下游重合。在这方面，与是选择第一光束路径还是第二光束路径无关，都各自将光施加到样品上的相同位置。例如可以通过适当编程的控制单元来实行光束偏转构件20、第一扫描仪s1、第二扫描仪s2和/或第三扫描仪s3的相互协调的致动。如果如图1示意性地图示和描述的，在从第一光束路径切换到第二光束路径时切换第一扫描仪s1的偏转角，则可以实现在操纵过程中扫描的区域和快速成像模式下扫描的区域之间的图像一致性。因此，除了扫描仪功能以外，第一扫描仪s1还具有在第一光束路径和第二光束路径之间的转换开关的功能。

在这方面，作为本发明的特别优点可以实现的是，在激光扫描显微镜中，一方面可以使用准静态扫描仪实行光学操纵和成像二者，并且另一方面可以通过共振扫描仪来实行快速成像。

在图1所图示的示例性实施例的情况下，为此还必须以可替换的方式配置分束器24。与之相比，如果分束器24以具有结合图2描述的光谱性质的固定方式布置，则因为荧光通行穿过分束器24，所以仅可以在使用p3中的准静态扫描仪s3进行操纵和使用p2中的共振扫描仪s2进行成像之间进行切换。

偏振以非常快的速度旋转是可能的。电光调制器允许偏振旋转恰好在mhz范围内。因此，在微秒范围内实现了在光瞳之间切换的实例。来自样品的发射的荧光具有特征性的斯托克斯位移，其幅值取决于所考虑的荧光团。因此，该辐射具有较长的波长，其在考虑到光谱反射特点的情况下，具有使元件在该范围内高效透射两个偏振分量的效果。在此的技术问题是这些层的行为很大程度上与角度相关。但是，这样的层可以制造为有大约10°的角度变化。作为示例，具有光谱反射性质的层仅可以被实施为窄带。替代地，可以制造和集成具有分别适合于特定角度范围的特点的多个带，或者类似分级滤光器的元件。

在微秒范围内毫无问题地可以通过电光调制器使偏振旋转。然而，还可以使用其他有源元件，例如液晶调制器或空间光调制器(slm)，只要它们导致偏振的旋转，或者甚至更一般地导致在期望方向上的偏振分量。例如还可能仅生成所谓四分之一波长的偏移(四分之一波长的偏移)，然后导致例如圆形或椭圆形的偏振。在此，s部分和p部分将分别在不同路径上通行。

该切换机构非常有利地与有源多点照明相组合，诸如在例如de102016102286.1中所描述的。特别地，这可以涉及共聚焦多点扫描显微术的系统。在此，例如，多个光束中的一个的偏振可以旋转了90°。那么，这就是操纵光束，该光束总体上还具有较高的强度。所有剩余的光束都用于成像。那么，例如通过声光可调滤波器(aotf)的切换导致了照明光束路径的期望的切换，以经由光瞳p3进行操纵或者经由光瞳p2中的扫描仪s2进行检测。

在由激发光10激发样品s后，样品s以基本已知的方式发射检测光14，所述检测光在基本上相同的光束路线上通行以返回到主分色器hft。检测光14典型地是荧光，其波长由于斯托克斯位移而与激发光10的波长相比发生红移。该红移使得检测光14能够在主分色器hft中分开，并且检测光14在适当时经由诸如反射镜或滤光器的其他部件(未图示)通行到检测模块dm，且在检测模块dm中被定量检测。检测模块dm的测量数据被馈送到控制和评估单元pc。

光瞳p2和p3可以配备有不同的光学有源或无源元件。在最简单的情况下，相应地就是反射镜，只要旨在于被绕过的有源元件坐落于相应的另一个光瞳中。作为示例，如上所述，共振扫描仪可以位于p2中。如果不需要所述扫描仪，则也不该经由其来引导光，以便避免由于多余运动而引起对光束的干扰。此外，共振扫描仪具有某一瞬态响应。如果希望通过共振扫描仪在操纵模式和快速成像模式之间实现非常快速的切换，则扫描仪必须连续地振荡，且在对应的时刻在光学上做出对这运动的连接。

在第二凹面反射镜h2处、在入射光束和反射光束之间的角度优选地等于第一凹面反射镜h1处的对应的角度，并且第二扫描仪s2和第三扫描仪s3的旋转轴线优选地彼此平行。由此实现的是，与是使用第二扫描仪s2还是使用第三扫描仪s3实现扫描无关，在样品平面中进行扫描期间都不会发生非对称的扫描畸变(在这方面，参见de102014017001a1)。

如图1所图示，根据本发明的光学布置可以在各个方面进行改变。

图4所图示的示例性实施例很大程度上对应于图1所图示的实施例。差异体现在可变光束偏转构件20中。在图4所示的示例性实施例中，所述可变光束偏转构件20是具有机械旋转装置(图4中未示出)的旋转反射镜22。旋转装置可以例如通过振镜式扫描仪来实现。这是有利的，因为质量惯性矩可以保持得相对较小。

图4中的旋转反射镜22至少可以在第一位置22a和第二位置22b之间来回旋转。在优选用于操纵光10的第一位置22a中，来自主分色器hft的操纵光10被反射到第三扫描仪s3的方向上。从第三扫描仪s3向前，在图4所示的示例性实施例中的第一光束路径对应于图1所示的情况。在优选用于激发辐射16的第二位置22b中，来自主分色器hft的激发辐射16被反射导第二扫描仪s2的方向上。从第二扫描仪s2向前，在图4所示的示例性实施例中的第二光束路径对应于图1所示的情况。同样的适用于在相反方向上通行穿过光束路线的检测光14。在图4的实施例变型中不需要调整偏振的装置。

如在结合图1所描述的变型中一样，在此同样可以有利地以自动方式通过调整旋转反射镜22来跟踪第一扫描仪s1，以便实现以下效果：与是选择第一光束路径还是第二光束路径无关，都将激发辐射16或操纵辐射10施加到样品上的相同位置。在来自图4的示例性实施例中，如果如上所述地跟踪第一扫描仪，则在操纵模式(即使用准静态扫描仪s1和s3)下同样可以进行成像，因为来自样品的荧光在旋转反射镜22处被反射到主分色器hft的方向上。

来自图4的布置使得通过准静态扫描仪s3能够进行成像，该准静态扫描仪s3的优点在于其在图像上的运动可以是线性的。另一方面，还可以通过共振扫描仪s2实现成像，其优点在于，在此可以进行非常快的成像(例如用512×512像素时每秒30个图像)。然而，使用旋转反射镜22进行切换总体上不是很快，因为在这种情况下旋转反射镜22的质量必须在相对较大的范围内移动。

因此，根据本发明的光学布置的一个主要优点是：可以在所谓的操纵模式和快速成像模式之间非常快速地切换。这可以通过各种方式来完成。

如果激发光和操纵光在光谱上不同，则首先可以使用滤色器，例如二向色反射镜。这样的反射镜是可变光束偏转构件，因为它们的反射和透射性质取决于辐射的波长。在此应该考虑到，二向色反射镜的性质取决于辐射在其上入射的角度，这在某些情况下可能导致视场的限制。

在简单的情况下，考虑到操纵辐射和荧光激发辐射的波长相同，如图4所示，反射元件(旋转反射镜22)在光束路线中枢转，并且因此可以在几毫秒内在p3和p2之间切换。然而，在这种情况下，必须移动具有某一质量的反射镜。通过这样的布置，通常难以变得比10ms更快，或者甚至更好地比1ms更快。如果需要更快的切换时间，则必须使用替代的切换机构，特别是非机械式切换元件。

如果旨在于将相同的波长用于操纵和快速成像，则可以特别采用偏振相关的元件，诸如上文所描述的电介质和/或二向色反射镜24。因此，如上所述，在光瞳p2和p3之间进行非机械式切换是可能的。

附图标记列表

x第二坐标方向

y第一坐标方向

z光轴的方向

dm检测模块

hft主分色器

h1第二聚焦装置、第一凹面反射镜

h2第三聚焦装置、第二凹面反射镜

lm激光器模块/光源

mo显微镜物镜

p显微镜物镜mo的光瞳平面

pc控制和评估单元

p1第一光瞳平面

p2第二光瞳平面

p3第三光瞳平面

s样品

sm扫描模块、根据本发明的光学布置

so扫描光学单元、第一聚焦装置

sp样品平面

s1第一扫描仪、第一光束偏转装置

s2第二扫描仪、第二光束偏转装置

s3第三扫描仪、第三光束偏转装置

zb中间像平面

10操纵辐射，操纵光

12光轴

14检测光

16激发辐射、激发光

20可变光束偏转构件

22旋转反射镜

24电介质和/或二向色反射镜

30固定的反射镜

40多点模块

50偏振旋转装置

61反射系数最大程度取决于偏振的波长

62反射系数实质上与偏振无关的波长范围

71-75从显微镜部件到pc的线

100激光扫描显微镜