一种结构光照明显微镜的成像方法及装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光学显微镜技术领域，尤其涉及一种结构光照明显微镜的成像方法及 装置。
【背景技术】
[0002] 现代的生命科学研究中，显微镜是必不可少的研究工具。然而由于光的衍射，传统 的光学显微镜存在分辨率的极限，这个分辨率的极限可以由瑞利判据（Rayleigh criterion)给出：R = 0.6U/NA，其中λ是光的波长，ΝΑ是显微物镜的数值孔径。近年来，出现 了各种用于提高光学显微镜分辨率的方法，结构光照明显微镜(Structured 11 lumination Microscope，SIM)就是其中之一。与其他的方法相比，如：随机光学重构显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，ST0RM)，光激活定位显微镜（Photo Activated Localization Microscopy，PALM)，受激发射损耗显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED)，SIM的图像重构过程中所需的原始图像数量最少，合成每帧 超分辨图像所需采集数据的时间最短，此外SIM的原始图像采集是宽场成像，成像速度受视 场大小影响不大。故SIM是各种超分辨成像方法中最适合观察活细胞或宽视场中快速成像 的方法。
[0003] 现有的结构光照明显微镜的基本结构如图1所示，采用相干或非相干的准直宽光 束作为光源1，入射光经过光线调制器件2,被调制后经过由透镜3、二向色分束器8及物镜9 组成的成像系统，然后调制出的图案投影在照明样品10上，并在照明样品10所在的平面上 形成周期性的光强分布。在使用相干光源的情况下，也可以选择性的加入由透镜4、空间滤 波器5及透镜6组成的空间滤波系统，以滤除零级衍射分量，滤波后的光继续通过由二向色 分束器8及物镜9组成的成像系统，在照明样品10所在的平面处干涉生成结构光照明图案。 被照明的样品的光通过由物镜9、镜筒透镜11组成的显微系统后被探测器13采集。
[0004] 现有技术中，通过结构光照明显微镜随时间推移生成SIM序列（time-lapse SIM)， 其成像过程如下：
[0005] 在一组结构光照明图案下，每张结构光照明图案都拍摄一张原始图像，对这一组 原始图像进行图像重构得到一张 S頂超分辨图像。下一张 S頂超分辨图像使用下一组结构光 照明下的原始图像重构得到。重复上述过程，获得多个S頂超分辨图像，构成S頂超分辨图像 的时间序列。
[0006] 最早的SIM中，用于调制结构光分布的器件为光栅。不同结构光照明图案的调制与 切换是通过平移或旋转光栅实现的。由于系统中存在机械运动的部分，其成像速度相对较 慢。之后的S頂普遍采用空间光调制器(Spatial Light Modulator，SLM)以及数字微镜器件 (Digital Micro-mirror Device，DMD)这两种光电器件调制结构光照明图案。由于SLM和 DMD响应速度快，再加上高灵敏度的探测器如电子倍增CCD(EMCCD)、科学级CMOS(sCMOS)能 够大幅的缩短曝光时间，这些都为S頂的高速成像提供了有利条件。
[0007] 若要再进一步提升SM的成像速度，需要通过增大照明光强缩短曝光时间，从而提 高成像的时间分辨率。然而在荧光成像中，照明光强的增强会加速荧光分子的光漂白效应， 缩短总体的观察时间，这在活细胞成像中是很不利的，需要折中考虑。故在现有光电器件响 应速度和探测器灵敏度的条件下，SIM的时间分辨率很难有大幅的提升。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种结构光照明显微镜的成像方法及装置，以解决现有技术中结构光 照明显微镜成像的时间分辨率难以进一步提升的技术问题。
[0009] 为此目的，第一方面，本发明提供一种结构光照明显微镜的成像方法，包括：
[0010] 按照预设顺序循环切换预设的N张结构光照明图案，N为预设常数；
[0011]获取待成像样品在每张结构光照明图案下的原始图像，得到所述待成像样品的原 始图像序列；
[0012] 将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像进行图像重 构，得到所述待成像样品的超分辨图像序列。
[0013] 可选地，所述将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像 进行图像重构，得到所述待成像样品的超分辨图像序列，具体包括：
[0014] 计算所述原始图像序列中每N张原始图像中混叠的各空间频谱分量，得到多个空 间频谱分量组，所述N张原始图像由所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张 原始图像组成；
[0015] 根据所述预设的N张结构光照明图案的空间频率，将每个空间频谱分量组中空间 频率改变的各空间频谱分量的空间频率还原，得到空间频率还原的各空间频谱分量；
[0016] 将每个空间频谱分量组中空间频率还原的各空间频谱分量与空间频率未改变的 各空间频谱分量进行加权叠加，得到所述待成像样品的超分辨图像序列。
[0017] 可选地，所述根据所述预设的N张结构光照明图案的空间频率，将每个空间频谱分 量组中空间频率改变的各空间频谱分量的空间频率还原，得到空间频率还原的各空间频谱 分量，具体包括：
[0018] 根据所述预设的N张结构光照明图案的空间频率，确定每个空间频谱分量组中空 间频率改变的各空间频谱分量的空间频率改变量；
[0019] 根据所述空间频率改变量，确定各空间频谱分量组中每个空间频率改变量在空间 域内对应的指数函数；
[0020] 在空间域内，将每个空间频谱分量组中空间频率改变的各空间频谱分量与自身的 空间频率改变量对应的指数函数相乘，得到空间频率还原的各空间频谱分量。
[0021] 可选地，所述拍摄待成像样品在每张结构光照明图案下的原始图像，具体包括：
[0022] 间隔预设时间拍摄待成像样品在每张结构光照明图案下的原始图像。
[0023] 可选地，在计算所述原始图像序列中N张原始图像中混叠的各空间频谱分量，得到 多个空间频谱分量组之后，所述方法还包括：
[0024] 对每个空间频谱分量组中的各空间频谱分量进行反卷积，得到反卷积后的各空间 频谱分量组；
[0025] 相应地，所述根据所述预设的N张结构光照明图案的空间频率，将每个空间频谱分 量组中空间频率改变的各空间频谱分量的空间频率还原，具体包括：
[0026] 根据所述预设的N张结构光照明图案的空间频率，将每个反卷积后的空间频谱分 量组中空间频率改变的各空间频率谱分量的空间频率还原。
[0027] 可选地，在所述周期性循环预设的N张结构光照明图案之前，所述方法还包括：
[0028] 采用光线调制器件调制所述结构光照明显微镜的入射光；
[0029] 对调制后的入射光进行投影，得到所述预设的N张结构光照明图案。
[0030] 可选地，在所述将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图 像进行图像重构之前，所述方法还包括：
[0031] 对所述待成像样品在每张结构光照明图案下的原始图像进行降噪处理，得到降噪 后的原始图像序列；
[0032] 相应地，所述将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像 进行图像重构，具体包括：
[0033] 将所述降噪后的原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像进行 图像重构;或
[0034] 在所述得到所述待成像样品的超分辨图像序列之后，所述方法还包括：
[0035]对所述超分辨图像序列中的每张超分辨图像进行降噪，得到降噪后的超分辨图像 序列。
[0036] 可选地，在所述将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图 像进行图像重构之前，所述方法还包括：
[0037] 对所述原始图像序列中的每张原始图像进行图像内插处理，得到像素扩展的各原 始图像；
[0038] 相应地，所述将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像 进行图像重构，具体包括：
[0039] 将所述原始图像序列中的每张像素扩展的原始图像与其之后的N-1张像素扩展的 原始图像进行图像重构。
[0040] 可选地，按照预设顺