高分辨率扫描显微术的制作方法
【专利说明】高分辨率扫描显微术
[0001]本发明涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有用于照亮样本的照明装置，具有成像装置，用于在样本上扫描至少一个点光斑或线光斑并且用于按成像比例在探测平面内将点光斑或线光斑成像为衍射受限的静止的帧，具有探测器装置，用于针对不同的扫描位置以位置分辨率检测探测平面内的帧，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的帧的半值宽度的两倍，具有分析装置，用于由探测器装置的数据针对扫描位置分析帧的衍射结构并且用于产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。本发明还涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的方法，其中，照亮样本，将至少一个在样本上扫描地导引的点光斑或线光斑成像为帧，其中，点光斑或线光斑衍射受限地按成像比例成像为帧并且帧静止地处于探测平面内，针对不同的扫描位置以位置分辨率检测帧，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的帧的半值宽度的两倍，从而检测帧的衍射结构，针对每个扫描位置分析帧的衍射结构并且产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。
[0002]这种显微镜或显微术方法例如由C.Miiller und J.Ender I ein的公开出版物Physical Review Letters，104，198101 (2010)，或者由专利文献EP 2317362A1 已知，其也提及了关于现有技术的其它说明。
[0003]这种方式实现了分辨率的提高，方法是将光光斑衍射受限地成像在探测平面上。衍射受限的成像将点光斑成像为艾里斑。在探测平面内这样检测衍射斑，使得能够分辨出其结构。因此，在显微镜的成像效率方面，探测器进行超采样。在成像点光斑时，分辨出艾里斑的形状。通过适当的衍射结构分析，得到了超过衍射极限2倍的分辨率提高，这种分析在所述文献中进行了描述并且其与之相关的公开内容在此完全包含在本发明中。
[0004]然而在此在探测方面不可避免的是，对于每个在样本上以这种方式被扫描的点来说，与传统的激光扫描显微镜(以下也称为LSM)相比，必须通过大量的图像信息拍摄一个帧。如果例如以16像素检测一个光斑的帧的结构，则每个光斑不只包含16倍的数据量，单个像素平均也只包含在通常的针孔探测中照射到LSM探测器上的射线强度的1/16。因为射线强度必然不均匀地分布在帧的结构、例如艾里斑上，所以在结构边缘上的射线强度实际上甚至还明显小于在η个像素时为I/η的平均值。
[0005]所要解决的问题是，能够在探测器侧以高分辨率检测射线量。通常在显微镜中使用的传统的CCD阵列不能实现足够的信噪比，因此即使延长图像拍摄时长也无济于事，而延长图像拍摄时长本身在应用中已经被视为是不利的。Aro阵列也与过高的暗噪声相关，因此即使延长测量时长所得到的信噪比也不够。对于CMOS探测器同理，其还在探测器元件的尺寸方面是不利的，因为光斑的衍射受限的帧可能落在过少的像素上。PMT阵列带来了类似的结构空间问题;在该处的像素同样过大。因此，结构空间问题尤其在于，用于高分辨率的显微镜在诸如准备设备的研发开销方面只能在能集成到现有的LSM结构中的情况下实现。然而在此，预设帧的确定尺寸。只在附加地设置再次将图像显著地、也就是以多个量级扩展的光学器件时，才能安装面积较大的探测器。这种光学器件使得想在没有其它成像误差的情况下得到衍射受限的结构是非常耗费的。
[0006]在现有技术中已知其它方法，它们避免在高分辨率时在所述探测方面的问题。例如在EP 1157297 BI中提到一种方法，其中借助结构化的照明充分利用非线性过程。结构化的照明在多个旋转和地点位置中推移经过样本并且在这些不同的状态下将样本成像在广视场探测器上，对于这些探测器不存在所述的限制。
[0007]在没有所述探测器限制的情况下同样达到高分辨率(也就是超过衍射极限的样本图像分辨率)的方法由WO 2006127692和DE 102006021317已知。简称为PALM的方法使用标记物质，其可以借助光学激活信号被激活。标记物质只能在激活状态下被激励射线激励以发出某种荧光射线;未激活的分子即使在有激励射线入射的情况下也不会发出荧光射线。激活射线使激活物质进入一种状态，在该状态下其能够被激励以发光。因此其通常称为变换信号。这样施加所述变换信号，使得至少一定比例的被激活的标记分子与相邻的同样被激活的标记分子相间隔，使得被激活的标记分子在显微术的光学分辨率方面是分隔开的或者可事后分隔开。这称为激活的分子的隔离。对于这些被隔离的分子，能够简单地确定其由于分辨率受限所得到的射线分布的中心并且因此通过计算以比光学成像真正允许的精度更高的精度确定分子的位置。为了使整个样本成像，PALM方法利用了这个事实，即标记分子在给定的变化信号强度下通过变换信号被激活的概率对于所有标记分子来说是相同的。这样施加变换信号的强度，从而实现期望的隔离。一直重复这些方法步骤，直至尽可能所有的标记分子一次包含在已经被激励以发光的子集中。
[0008]在本发明中，在样本上被扫描的光斑静止地成像到探测平面内。来自探测平面的射线不成像地被再分配并且被引到探测器阵列上。在此，术语“不成像地”是相对于探测平面内现有的帧而言的。帧的单个面区域当然仍可以按照成像定理成像。因此在探测器阵列与再分配元件之间均为成像的光学器件。然而，处于探测平面内的帧在再分配时不是保持不变的。
[0009]术语“衍射受限”不局限于按照阿贝原理的衍射极限，而是也包括这些情况，其中理论最大值由于真实的不可接近性或限制缺少了 20%。帧在这时也具有在此称为衍射结构的结构。它被超采样。
[0010]这种原理实现了应用一种尺寸不与帧匹配的探测器阵列。探测器阵列优选在至少一个延伸上大于或小于待检测的帧。不同几何设计的概念既包括探测器阵列的不同延伸也包括涉及帧在探测平面内的延伸的高度和宽度的不同比例。探测器阵列的像素还可以对于所需要的分辨率是过大的。这也允许了，探测器阵列的像素布局的轮廓从根本上与帧在探测平面内的轮廓是不同的。最后，探测器阵列按照本发明具有与帧在探测平面中不同的尺寸。所述方法中的再分配或显微镜中的再分配元件实现了选择探测器阵列，而不需要考虑由于帧和其尺寸形成的尺寸限制和像素尺寸限制。尤其是可以将探测器排用作探测器阵列。
[0011]在LSM中样本的图像通常通过以光斑扫描样本的方式由大量的帧形成，所述帧分别配属于不同的扫描位置。
[0012]按照本发明的方案也能以并行化的形式针对多个光斑同时进行，如对于激光扫描显微镜已知的那样。由此扫描样本上的多个光斑，并且多个光斑的帧静止地并排处于探测平面内。它们随即由大小与面积相应的共同的再分配元件或者由多个单独的再分配元件进行再分配并且随即被引到相应更大的单独的或者多个单独的探测器阵列上。
[0013]以下示例性地重点描述以一个单独点光斑进行的扫描。然而这不应理解为限制，并且所阐述的特征和原理实质上也适用于多个点光斑的并行扫描并且也适用于应用线光斑的情况。后者当然只是横向于线延伸地受到衍射限制，因此本说明书的与之相关的特征只适用于一个方向(横向于线延伸)。
[0014]通过按照本发明的方式，可以在令人满意的速度下并且以可忍受的设备耗费实施ISM方法。本发明为高分辨率显微术原理开启了广阔的、迄今未形成的应用领域。
[0015]实现再分配或再分配元件的可能性在于，使用由光导纤维组成的束。所述光导纤维优选可以设计为多模式的光导纤维。所述束具有入口，其布置在探测平面内并且在其轮廓中满足衍射受限的帧在探测平面内的延伸。而光导纤维在出口处以通过探测器阵列预设的几何布局布置，并且这种布局与入口的布局不同。在此，光导纤维的出口侧端部可以直接导引到探测器阵列的像素上。特别有利的是，将束的出口整合在插头中，所述插头可以方便地插在探测器排、例如Aro或PMT排上。
[0016]对于理解本发明重要的是，区分探测器阵列的像素和帧在探测平面内被分辨出的图像像素。每个图像像素通常正好配属于一个探测器阵列像素，但是两者在其布局方面是不同的。本发明的主要特征在于，在探测平面内拍摄在其尺寸和布局方面造成帧的超采样的图像像素的射线。以此方式分辨帧的结构，其由于帧的衍射受限的产生而是衍射结构。再分配元件具有入口侧，该图像像素设置在入口侧。入口侧处于探测平面内。再分配元件将每个图像像素上的射线导引至探测器阵列的像素。将图像像素配置给探测器阵列的像素的过程没有保持图像结构，因此再分配元件相对于帧是不成像的。本发明的特征也可以在于，在按照本发明所述类型的显微镜中，探测器装置具有不成像的再分配元件，其具有处于探测平面内的入口侧，在所述入口侧拍摄具有图像像素的射线。再分配元件还有出口侧，在出口侧将在图像像素处拍摄的射线输入探测器阵列的像素，其中，射线从入口侧向出口侧相对于帧不成像地再分配。类似地，按照本发明的方法的特征可以在于，在按照本发明所述类型的方法中，在具有图像像素的探测平面内拍摄射线，它们相对于帧不成像地再分配到探测器阵列的像素上。探测器阵列在其像素的布局和/或尺寸方面与探测平面内的图像像素的布局和/或尺寸不同。此外，探测平面内的图像像素由再分配元件这样提供，使得相对于衍射极限，帧的衍射结构被超采样或过采样。
[0017]对于高度敏感的探测器阵列已知的是，相邻的像素在射线强度差较大的情况下显示出由于串音的干扰。为了避免这种情况，优选采用一种扩展设计，其中光导纤维这样从入口导引至出口，使得在出口处相邻的光导纤维也在入口处相邻。因为衍射受限的帧不显示跳跃状的射线强度变化，所以再分配元件的这种设计方案自动地确保了探测器阵列的并排像素具有尽可能小的射线强度差，这使串音或者说串扰最小化。
[0018]取代基于光导纤维的再分配，也可行的是，为再分配元件配设镜子，其具有倾斜程度不同的镜元件。这种镜子例如可以设计为分段镜、DMD或者自适应镜，其中，对于后两种变型方案，相应的调节或控制确保了镜元件的斜率。镜元件将来自探测平面的射线导引至探测器