含有巨大芽孢杆菌菌剂和腐植酸的水溶肥的生产方法与流程

本发明涉及一种含有巨大芽孢杆菌和腐植酸的水溶肥的生产方法。
背景技术：
：海藻肥料以天然海藻为原料，经过特殊生化工艺处理，提取并保留海藻天然活性成分，精炼浓缩而形成的一种新型有机肥料。海藻肥料具有提高作物产量和品质，抵抗病虫害及不良环境以及改良土壤保持水土的功效，其应用于农业生产有巨大的市场需求和良好的发展前景。但是，要保障海藻肥料的质量，就必须把握好海藻原料和提取工艺两个关键环节。首先，海藻肥料质量的优劣取决于所用的原料。目前，海藻肥生产企业所用的原料主要以褐藻为主，包括泡叶藻、昆布、海带、马尾藻等。其他藻类如墨角藻、浒苔、石莼、卡帕藻等也有少数企业在用。国外海藻肥企业绝大多数使用褐藻为原料，其中尤以泡叶藻应用最为广泛如Seasol、Maxicrop等知名品牌，实际作用效果也表明泡叶藻是优质的海藻原料。但是，我国沿海没有泡叶藻分布，国内企业采用的原料种类繁杂，品质参差不一，造成海藻肥产品质量良莠不齐，甚至有些厂家打着“海藻肥”的幌子，直接勾兑褐藻酸，黄腐酸、氮磷钾等冒充海藻肥，影响了海藻肥质量，扰乱了海藻肥市场。其次，决定海藻肥质量的第二个因素是提取工艺。不同的提取工艺对海藻肥活性成分的种类和含量影响巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，产物多元化，整个生产过程安全环保无污染，是理想的海藻肥生产方法。利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用多种微生物对海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一，稳定，可控的标准，产品的质量难以保障。针对农业用微生物的评价指标主要包括菌剂的纯度和单位质量中的菌剂数量。因此，作为现有技术的菌剂制备方法一般是：在微生物适宜生存的温度和pH条件下进行一次发酵工艺，相当于温室培养。由于目前土壤板结酸化严重，外界气温变化无常，温室培养的微生物菌剂直接投放到土壤中，因不能适应恶劣的土壤环境造成大量死亡，即使有少量存活因无法形成种群效应，也无法发挥微生物菌剂的效果。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，提供一种含有巨大芽孢杆菌菌剂和腐植酸的水溶肥的生产方法，第一、采用性能优良的产纤维素酶的巨大芽孢杆菌降解海藻，并模拟土壤自然生态环境，使发酵后的巨大芽孢杆菌在投入土壤后，能很快适应环境，确保存活率；第二、提供利用所述巨大芽孢杆菌制备巨大芽孢杆菌和含有巨大芽孢杆菌的含腐植酸水溶肥的方法，该方法发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种含有巨大芽孢杆菌菌剂和腐植酸的水溶肥的生产方法，其特征在于按照以下步骤进行：将氮肥、磷肥、钾肥、含腐植酸有机物和巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比5～75:5～75:5～75:5～75:1～60混匀后，得到含有巨大芽孢杆菌菌剂和腐植酸的水溶肥；其中含腐植酸有机物是腐植酸钾、腐植酸钠和黄腐酸钾中的一种或任意比例的两种以上；其中巨大芽孢杆菌菌剂按照以下步骤制备而成：1)、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；2)、制备产品A：海藻粉末与水按照质量比1～10:100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；并制备种子液：将巨大芽孢杆菌接种至液体培养基，在25℃～40℃培养20～30小时；巨大芽孢杆菌与培养基之间的体积比为1～10:100；3)、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10:100；4)、制备产品C：在温度为25℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天，得到产品C；5)、制备产品D：调整产品C的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品D；6)、制备产品E:调整产品D的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品E；7)、制备产品F：调整产品E的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品F；8)、制备产品G：调整产品F的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品G；9)、制备巨大芽孢杆菌菌剂：将产品G风干后得到巨大芽孢杆菌菌剂。所述液体培养基按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份、琼脂20份和蒸馏水1000份。步骤2)所述海藻粉末和水的质量比为4:100；灭菌温度115℃，灭菌时间25min；制备种子液时，巨大芽孢杆菌接种至液体培养基中，培养22小时，得到种子液，巨大芽孢杆菌和培养基的体积比例为5:100；步骤5)和步骤7)中，温度为5℃，保存时间为12h。步骤4)、步骤6)和步骤8)中，温度为25℃，pH为6.5～7.0；步骤4)发酵时间为8天；步骤6)和步骤8)保存时间为12h；步骤6)中补充的发酵种子液与产品D的质量比以及步骤8)中补充的发酵种子液与产品F的质量比均为5:100。步骤5)、步骤6)步骤7)和步骤8)中，调整温度均为每小时调整3℃。所述海藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌YIC～BM1，保藏号为：CGMCCNo.12156。发明具有以下有益技术效果：本发明采用的巨大芽孢杆菌具有产纤维素酶的能力，一方面能够降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的营养成分；另一方面破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放。利用该菌株发酵处理铜藻、鼠尾藻等马尾藻属海藻原料，发酵一定天数后以此发酵液风干制成粉剂，直接或者复配N、P、K，微量元素，腐植酸，有机质等有效成分用于农作物生长。肥效实验表明，利用该方法获得发酵液能够明显促进植物根系生长，改良土壤微环境，提高作物产量。本发明还具有以下特点：1、采用本发明得到的海洋来源的巨大芽孢杆菌YIC～BM1对海藻发酵，能够破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放，发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。2、本发明将氨基酸与海藻中有效成分结合，可明显提高作物抗逆、抗病性。易于植物吸收利用，同时作为一种重要的信号分子，能够参与植物的生长调节和诱导抗病过程促进植物的生长，提高植物对不良环境及病虫害的抵抗力。3、本发明通过调节发酵条件使发酵出的菌具备适应恶劣的土壤环境的能力，有利于菌功能的发挥。4、本发明通过缓慢的温度调节，使产纤维素酶的巨大芽孢杆菌适应温度的变化，避免温度变化过快，产纤维素酶的巨大芽孢杆菌不能适应而大量死亡。附图说明图1是显微观察YIC～BM1菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。图2基于16SrDNA序列构建的YIC～BM1菌株系统发育树示意图。图3是不同温度对YIC～BM1菌株产酶的影响的示意图。图4是不同pH对YIC～BM1菌株产酶的影响示意图。具体实施方式下面结合具体实例进一步说明本发明。实施例1将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比4:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，在30℃培养24小时；所述产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156；产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为10:100，得到产品B；在温度为30℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至30℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为5:100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品F；以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至30℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为5:100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到巨大芽孢杆菌菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、含腐植酸有机物和巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比45:10:10:30:5混匀后，得到含有巨大芽孢杆菌和腐植酸的水溶肥。实施例2将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1:1复配，磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比6:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，在35℃培养24小时；所述产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156；产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为10:100，得到产品B；在温度为35℃，pH6.0～6.5的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.5～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至35℃，pH至6.0～6.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为6:100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.5～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品F；以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至35℃，pH至6.0～6.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为6:100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到巨大芽孢杆菌YIC～BM1菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、含腐植酸有机物和巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比45:10:10:30:5混匀后，得到含有巨大芽孢杆菌和腐植酸的水溶肥。实施例3将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比8:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，在30℃培养24小时；所述产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156；产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为10:100，得到产品B；在温度为30℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至30℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为5:100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品F；以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至30℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为8:100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到巨大芽孢杆菌YIC～BM1菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、含腐植酸有机物和巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比45:10:10:30:5混匀后，得到含有巨大芽孢杆菌和腐植酸的水溶肥。实施例4将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比10:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，在30℃培养24小时；所述产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156；产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为10:100，得到产品B；在温度为30℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至30℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为6:100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品F；以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至30℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为8:100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到巨大芽孢杆菌YIC～BM1菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、含腐植酸有机物和巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比45:10:10:30:5混匀后，得到含有巨大芽孢杆菌和腐植酸的水溶肥。实施例1至4中，所述氮肥是硫酸铵，磷肥是工业级磷酸二氢铵，钾肥是硫酸钾,含腐植酸有机物是腐植酸钾。对比例1不调节发酵过程中的温度和pH值，保持环境原有的温度和物料本身的pH值，其他的条件及物料配比与实施例2一致，操作步骤同实施例2。对比例2不通过发酵，不添加菌剂，以海藻提取物替代微生物菌剂，将氮肥、磷肥、钾肥、含腐植酸有机物和海藻提取物按照质量比45:10:10:30:5混匀后，得到含有腐植酸的水溶肥。所述的海藻提取物为不通过发酵工艺，通过浸泡溶解的方式从海藻中提取的可溶性有机成分。表1：本发明实施例及对比例的质量检测结果注：有效活菌指的是本发明采用的巨大芽孢杆菌。以上结果表明，本发明生产的微生物肥料各项指标均明显高于国家标准，而且经过发酵处理，肥料中重金属的含量明显降低，杂菌率明显降低，本发明采用的发酵工艺可以大幅提高产品中的有效活菌数，在同类产品中优势明显。将本发明的实施例和对比例相关肥料施于黄瓜种植地块，亩用量为40kg。种植期为1年，土壤性状具体性能指标见表2。表2：土壤改良后的各项性能指标注：有效活菌指的是本发明采用的巨大芽孢杆菌。结果表明：本发明采用的菌种在土壤中存活且生长，土壤性能得到明显改善，通气孔隙度为14.2％-15.5％，土壤pH6.3-6.6,土壤容重1.40-1.45g/cm3，重金属含量有效降低。施用本发明中实施例和对比例产品对黄瓜作物的影响情况，与施用市场购买的菌肥类产品对比，肥效结果见表4。表4：肥效对比结果项目产量提高畸形果率降低商品果率提高冻害率降低虫害率降低病害率降低实施例19.9％7.9％11.3％11.9％16.9％16.8％实施例212.2％8.8％12.8％13.8％18.4％18.2％实施例311.8％8.3％12.4％13.0％18.1％17.3％实施例410.9％8.1％11.9％12.7％17.5％17.2％对比例16.3％3.2％6.0％6.3％7.1％8.0％对比例26.0％2.7％4.6％5.1％5.4％6.7％结果表明：在施肥量相当的情况下，使用本发明的微生物复混肥产品，明显提升作物品质，大大降低了作用病虫害，有效增强作物的抗性，能提高作用产量9.9％-12.2％。所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillusmegaterium。所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：纤维素培养基：羟甲基纤维素钠15g，硝酸铵1g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。液体发酵培养基：羟甲基纤维素钠10g，蛋白胨3g，酵母粉0.5g，硝酸铵2g，硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2g，氯化钙0.3g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.4。YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium。图1看出，YIC～BM1菌株为革兰氏阳性菌；图2看出，YIC～BM1菌株的亲缘关系与巨大芽孢杆菌最近；图3看出，YIC～BM1菌株的最适产酶温度为35℃；图4看出，YIC～BM1菌株的最佳产酶pH为6.0。当前第1页1 2 3