本发明涉及一种使用色谱技术分离海藻糖和麦芽糖的方法，属于生化分离技术领域。
背景技术：
海藻糖由两个葡萄糖分子以α,α-1,1糖苷键构成的非还原性糖。由于海藻糖存在非还原末端，具有保护生物细胞和生物活性物质在不良环境下免受破坏的功能而引人注目，广泛地应用于食品、医药、化妆品、农业等行业。它在食品行业中可用作食品添加剂和甜味剂，同时保持食品贮藏寿命；在医药行业中替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗等生物活性物质的稳定剂；在化妆品中作为超级防晒保湿因子，用于护肤品和唇膏等；在农作物育种中用于种子保存。
海藻糖广泛存在于微生物、海藻类、蘑菇类、豆类、虾类等，但是含量甚微。其传统的工业生产方法为从酵母中提取，但提取过程复杂，生产成本极高。为了降低生产成本，目前工业上制取海藻糖采用的方法是以淀粉为原料制备海藻糖，其步骤为：先将淀粉转化为麦芽糖，然后用麦芽糖/海藻糖酶将麦芽糖转化为海藻糖，再利用结晶分离的方式制备。该方法的优点是成本低廉、工艺简单、转化率高，但由于受酶转化平衡关系影响，海藻糖溶液中常常含20％～30％的麦芽糖，而麦芽糖和海藻糖是同分异构体，用结晶方法很难把二者彻底分离，母液中含有大量的海藻糖，使得海藻糖生产成本偏高，影响其生产和应用。为此，必须进一步提高海藻糖的纯度和收率，以降低生产成本、提高生产量。
申请号为CN200710013078.7，公开号为CN101230407A的中国专利申请一种提高海藻糖提取收率的方法，公开的技术主要采用氢化技术，把麦芽糖转化为麦芽糖醇，再利用色谱分离技术，把麦芽糖醇和海藻糖分离，此法操作较复杂，需要使用昂贵的催化剂和高温高压条件，对设备要求高，能源消耗大。目前国内外仍然没有采用色谱技术直接高效分离海藻糖和麦芽糖的报道，其主要原因是因为色谱柱内装填的对海藻糖和麦芽糖吸附力差异显著的专用色谱介质的构建非常困难。
海藻糖和麦芽糖均为葡萄糖单体聚合的双糖，但是两个葡萄糖单体连接的糖苷键不同，海藻糖为α构型的1，1糖苷键，麦芽糖为α构型的1，4糖苷键，具有不同的空间结构，本发明基于这一技术原理，构建和筛选具有空间选择性的高性能特种色谱树脂，装填的介质对海藻糖和麦芽糖吸附力差异显著，从而解决上述问题，技术可以实现产业化应用。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种海藻糖和麦芽糖的色谱分离方法。
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、成本低廉、分离度高、绿色环保的海藻糖和麦芽糖的色谱分离方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种海藻糖和麦芽糖的色谱分离方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
将含有通过麦芽糖酶转化生产的海藻糖料液经膜过滤、离心澄清或者板框过滤后，通过热浓缩或者膜浓缩制成1％～71％(w/w)浓度的水溶液(即海藻糖和麦芽糖混合液)；
在20～90℃条件下，将海藻糖和麦芽糖混合液注入装填专用色谱介质的色谱柱，以水作洗提剂洗提，分别收集洗提液和残留液，获得纯海藻糖和麦芽糖两种产物，实现海藻糖和麦芽糖的高效分离，并进一步降低了生产成本。
所述的色谱柱的温度为20～90℃，柱径高比为1:0.5～1:10，进料流量为0.01BV/h—1BV/h，进料质量浓度为1％～71％，洗提流速为0.025BV/h—2.5BV/h，料水比1:(1-3)。
所述的色谱柱内装填的专用色谱介质为强酸型阳离子树脂、钙型阳离子树脂、镁型阳离子树脂、钠型阳离子树脂、钾型阳离子树脂或铵型阳离子树脂。
所述色谱树脂的粒径范围：100-400um。
所述色谱分离的形式包括真实移动床色谱、模拟移动床色谱、间歇式色谱的色谱柱；
所述的作为洗提剂的水包括去离子水、脱盐水或蒸馏水。
所述的色谱柱的温度条件在20～90℃范围内，包括恒温色谱方式或变温色谱方式。
所述得到的洗提液为海藻糖，残留液为麦芽糖。
上述分离方法中，色谱进样时海藻糖和麦芽糖混合液中麦芽糖和海藻糖的质量比例适宜范围为1：99-99：1。
所述通过麦芽糖酶转化生产的海藻糖料液的制备方法为：先将淀粉转化为麦芽糖，然后用麦芽糖/海藻糖酶将麦芽糖转化为海藻糖，从而获得海藻糖料液。
具体制备方法：1)淀粉：100g/L，温度：50℃，pH：5.0-5.5，α-淀粉酶：2U/g淀粉(以干物质计，即干淀粉)，β-淀粉酶：20U/g淀粉(以干物质计，即干淀粉)，异淀粉酶：20U/g淀粉(以干物质计，即干淀粉)，发酵周期24h，获得麦芽糖得率为80-92％；
2)把步骤1得到的麦芽糖溶液配制成50-100g/L的溶液，温度：27℃，pH：6.0-8.0，麦芽糖/海藻糖酶：0.75U/g淀粉(以干物质计，即干淀粉)，发酵周期：40h，获得海藻糖料液。
制备方法可参考文献：
1.杨亚威，色谱法分离海藻糖技术研究[D].齐鲁工业大学，2013。
2.张欣，生物酶法合成海藻糖工艺的改进研究[D].北京化工大学，2006。
3.胡宗利，夏玉先，陈国平等，海藻糖的生产制备及其应用前景，中国生物工程杂志[J].2004,24(4):44-48.
4.Hiroto Chaen,Toshio Miyake,Tomoyuki Nishimoto et al.Trehalose and its production and use.EP0693558 B1,2002.
所述膜过滤的过滤条件为：微滤膜(CA膜)，温度：25-30℃，操作压力：0.01-0.2MPa；离心澄清的过滤条件为：3000-6000rpm，15-20min；板框过滤的过滤条件为：温度：25-30℃，过滤压力：0.2-0.5MPa
所述热浓缩条件为：温度55-75℃，常压；膜浓缩条件为：纳滤膜(NF-1-D-4040)，温度25-30℃，压力0.5-1MPa。
有益效果
与现有技术相比，本发明提供使用以色谱分离为核心的分离方法，本发明提供使用以构建和筛选的专用色谱树脂为介质的色谱分离方法，可直接进行麦芽糖和海藻糖的高效分离，产品纯度高，而且过程无需其他预处理，色谱树脂无需再生，树脂可多次使用；该法用色谱技术直接分离麦芽糖和海藻糖具有操作简单，成本低廉，分离度高，绿色环保的特点。
具体实施方式
为了更好的阐述本发明所提出的麦芽糖和海藻糖的色谱分离方法，下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将麦芽糖和海藻糖(质量百分比1％麦芽糖，99％海藻糖)的进料水溶液(麦芽糖和海藻糖总含量的质量百分浓度为1％)，注入径高比为1:1填充钙型阳离子色谱树脂色谱柱，控制柱温在90℃，进料流量为0.01BV/h；用去离子水作为洗提剂，料水比1:2.5,控制柱温在90℃(柱温在整个分离过程中保持不变)和流速为0.025BV/h条件下进行洗提；分别收集洗提液和残留液，分别获得麦芽糖和海藻糖两种产品的水溶液，两种物质分离率98.0％。
以上分离率的计算方法为：
分离率：K＝(H-h)/H×100％，K—峰高分离率，H—小峰的峰高，h—峰谷的高度。该处所指的“峰”是指色谱流出曲线图中的色谱峰。
实施例2-13如下表1所示。
以下表1和2中海藻糖纯度的测定参见GB/T 23529—2009；麦芽糖纯度的测定参见GB/T 20883—2007。
以下表1和2中色谱树脂的粒径范围：100-400um。表中的各个类型色谱树脂购自漂莱特公司。
实施例14
将含有通过麦芽糖酶转化生产的海藻糖料液经膜过滤(膜过滤的过滤条件为：微滤膜(CA膜)，温度：25-30℃，操作压力：0.01-0.2MPa)，通过膜浓缩(膜浓缩条件为：纳滤膜(NF-1-D-4040)，温度25-30℃，压力0.5-1MPa)制成1％(w/w)浓度的水溶液，注入径高比为1:1填充钙型阳离子色谱树脂色谱柱，控制柱温在90℃，进料流量为0.01BV/h；用去离子水作为洗提剂，料水比1:2.5,控制柱温在90℃(柱温在整个分离过程中保持不变)和流速为0.025BV/h条件下进行洗提；分别收集洗提液和残留液，分别获得麦芽糖和海藻糖两种产品的水溶液。
其中通过麦芽糖酶转化生产的海藻糖料液的制备方法为：先将淀粉转化为麦芽糖，然后用麦芽糖/海藻糖酶将麦芽糖转化为海藻糖，从而获得海藻糖料液。
具体制备方法：1)淀粉：100g/L，温度：50℃，pH：5.0-5.5，α-淀粉酶：2U/g淀粉(以干物质计，即干淀粉)，β-淀粉酶：20U/g(以干物质计，即干淀粉)，异淀粉酶：20U/g(以干物质计，即干淀粉)，发酵周期24h，获得麦芽糖得率为80-92％；
2)把步骤1得到的麦芽糖溶液配制成50-100g/L的溶液，温度：27℃，pH：6.0-8.0，麦芽糖/海藻糖酶：0.75U/g(以干物质计，即干淀粉)，发酵周期：40h，获得海藻糖料液。
对比例
对比例1-12及其试验结果请见表2.
对比例13海藻糖提取现有技术(参见高惠玲，生物法合成海藻糖的工艺研究[D].北京化工大学，2004)
(1)用糖化酶和消化酶分解麦芽糖；
(2)超滤膜组件去除蛋白，活性炭柱分离纯化；
(3)10％乙醇洗脱，流速1mL/min，收集区间：1-3倍柱体积；
(4)浓缩结晶，60％海藻糖溶液用3倍体积乙醇结晶。
海藻糖纯度95.4％，收率91.5％。
上述方案的缺点：操作复杂；用到化学试剂乙醇，不利于环境保护；不能同时获得麦芽糖。
由实施例及对比例的对比结果可知：
对比实施例中的海藻糖纯度与对比例中的海藻糖纯度相比，前者普遍较高。说明在对比实施例的条件下，包括进料质量浓度、径高比、色谱树脂类型、温度等条件，海藻糖的纯度较高，其分离效果更优，而不在这些条件下时，所得海藻糖的纯度较低。
本发明提供使用以构建和筛选的专用色谱树脂为介质的色谱分离方法，可直接进行麦芽糖和海藻糖的高效分离，产品纯度高，而且过程无需其他预处理，色谱树脂无需再生，树脂可多次使用，生产成本低，是真正意义的低碳环保、零污染、操作简单、成本低廉的分离方法。
下面采用含有具体实验数据以及反应参数的实例对本申请进行进一步的描述，但这只是对本申请的描述，并不会限制本申请的保护范围，本领域的技术人员应该知道，凡是涉及到本申请所公开的技术内容的任何其它形式的技术方案，都是本申请所保护的范围。