植物种子粒重相关蛋白GmGA20ox2及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种植物种子粒重相关蛋白GmGA20ox2及其编码基因与应用。
背景技术：
：大豆蕴含丰富营养价值，是提供粮油和饲料的重要经济作物。在工业生产中大豆油也有很多用途，例如生物燃料、表面活性剂、软化剂等。中国曾是世界最大的大豆生产国，然而近年来，我国大豆生产只占需求的三分之一，致使中国成为全球最大的大豆进口国，进口总额为全球大豆总出口量的一半。近50年来，我国大豆生产仅增长了62％，而其他粮食作物已增长了5倍以上，大豆生产远远落后于我国国内其他粮食作物发展的步伐，不能满足国民需要。因此提高大豆单产已成为目前亟待解决的问题。种子的重量(粒重)在作物生产中的一个重要指标，是影响作物产量的重要农艺性状之一。植物可以通过增加种子粒重来达到增产的目的。一般认为，种子粒重是数量性状，由多个基因决定。千粒重是以克表示的一千粒种子的重量，百粒重是以克表示的一百粒种子的重量，它们是体现种子大小与饱满程度的一项指标，是检验种子质量和作物考种的内容，也是田间预测产量时的重要依据。测定小粒种子千粒重的常规方法为：随机数出三个一千粒种子，分别称重，求其平均值。测定大粒种子百粒重的常规方法为：取三个一百粒分别称重，取其平均值，称百粒重。大豆产量由株型、结荚率、荚粒数、种子百粒重等因素组成,其中粒重是遗传力最高的因素。粒重对产量的影响不限于豆科植物，也存在于其它单、双子叶植物，因此成为作物品种选育过程中要考虑的重要选择性状。已有的研究表明，种子粒重受栽培环境和遗传的影响，在正常的栽培条件下，遗传(也即相关基因)起重要作用，因此与粒重相关的分子机制的研究成为热点。技术实现要素：本发明的目的是提供一种植物种子粒重相关蛋白GmGA20ox2及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，来源于大豆，命名为GmGA20ox2蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子粒重相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述GmGA20ox2蛋白的基因(命名为GmGA20ox2基因)也属于本发明的保护范围。所述GmGA20ox2基因具体可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：(1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物种子粒重相关蛋白的DNA分子；(3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物种子粒重相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。含有所述GmGA20ox2基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录 起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组载体具体可为重组表达载体。所述重组表达载体具体可为将所述GmGA20ox2基因导入表达载体pGWB411得到的重组质粒pGWB411-GmGA20ox2。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述GmGA20ox2基因导入目的植物中，得到种子粒重和/或种子百粒重和/或种子千粒重高于所述目的植物的转基因植物。所述GmGA20ox2基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述GmGA20ox2基因具体可通过所述重组质粒pGWB411-GmGA20ox2导入所述目的植物中。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。本发明还保护所述GmGA20ox2蛋白在调节植物种子重量中的应用。所述调节种子重量具体可为提高种子粒重和/或种子百粒重和/或种子千粒重。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。本发明对于提高作物产量，培育高产品种具有重要的理论和现实意义。附图说明图1为大豆Williams82的7个阶段的种子照片。图2为实施例1中，GmGA20ox2基因的相对表达量。图3为质粒的结构元件示意图。图4为实施例2中，GmGA20ox2基因的相对表达量。图5为千粒重的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大豆材料：大豆Williams82记载在如下文献中：ScottAJackson等，Genomesequenceofthepalaeopolyploidsoybean,Nature,2010,Vol.463,178-183；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；该大豆材料为美国栽培品种，由PurdueUniversity,DepartmentofAgronomy,ScottJackson教授赠送。克隆载体8/GW/TOPO(结构示意图见图3A，具有重组位点attL1和attL2)：invitrogen公司。表达载体pGWB411(具有重组位点attR1和attR2)记载在如下文献中：DepartmentofMolecularandFunctionalGenomics,ShimaneUniversity,Aatsue,Shimane690-8504,Japan,E.mail:tnakagaw@life.shimane-u.ac.jpIsuyoshiNakagawa,etal.,GatwayVectorsforPlantTransformation,PlantBiotechnology,2009,26,275-284。由TsuyoshiNakagawa博士提供，公众得到TsuyoshiNakagawa博士同意后可从中科院遗传与发育生物学研究所获得。农杆菌GV3101，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载在如下文献中：LeeCW等，AgrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinArabidopsisthaliana,PlantCell,2009,21(9),2948-62。哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)：ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)。实施例1、GmGA20ox2蛋白及其编码基因的发现以大豆种子重量为标准，将大豆发育过程分成7个阶段。具体标准为发育中种子占饱满但尚没脱水种子的重量百分比。阶段1至阶段7对应的重量百分比依次为4％、8％、12％、16％、24％、48％、96％。大豆Williams82的7个阶段的种子照片见图1。对阶段3和阶段5的转录组进行测序比对,获得了在阶段6高表达的转录因子,其中包括一个开放阅读框，其对应的DNA序列如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GmGA20ox2蛋白，将编码GmGA20ox2蛋白的DNA分子命名为GmGA20ox2基因。对GmGA20ox2基因在大豆种子发育过程中的表达特征进行验证。分别提取大豆Williams82的苗、叶、荚以及阶段1至阶段6的种子的总RNA并反转录为cDNA，进行RealTime-PCR分析。用于检测GmGA20ox2基因引物的为：TAGGAACTGGACCTCATTGTGACC和AGGAGCGACAGAGTACCATCTTC。将大豆Tublin基因为内标，用于检测Tublin基因的引物为：Primer-TF：AACCTCCTCCTCATCGTACT和Primer-TR：GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。GmGA20ox2基因的相对表达量见图2。在苗、叶和荚中均难以检测到GmGA20ox2基因的表达。在种子发育过程中，阶段1、阶段2、阶段3、阶段4的表达水平虽有起伏，但总体上变化不太大，至阶段5明显上升，而至阶段6开始下降。种子处于阶段1、阶段2、阶段3、阶段4、阶段5和阶段6时，GmGA20ox2基因相对表达量依次为100、150、120、140、360和235。实施例2、GmGA20ox2蛋白的功能鉴定一、重组质粒的构建1、提取大豆Williams82的幼苗的总RNA并反转录为cDNA。2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用GmGA20ox2-up和GmGA20ox2-dp组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。GmGA20ox2-up：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCTAGTTCCTCATCCTTC-3’(序列3)；GmGA20ox2-dp：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTTTATAGATTTTGTTGGCCATGG-3’(序列4)。3、将步骤2得到的PCR扩增产物与克隆载体8/GW/TOPO连接，得到重组质粒。4、步骤3得到的重组质粒与表达载体pGWB411发生LR重组，得到重组质粒pGWB411-GmGA20ox2。根据测序结果，对重组质粒pGWB411-GmGA20ox2进行结构描述如下：LR重组产生attB1和attB2位点，两个位点之间为GmGA20ox2基因。重组质粒pGWB411-GmGA20ox2的元件示意图见图3B。二、转基因植物的制备1、将重组质粒pGWB411-GmGA20ox2导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。2、将步骤1得到的重组农杆菌通过抽真空法转化哥伦比生态型拟南芥(Clough-SJ,Bent-AF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743)，然后培养植株并收获种子。3、将步骤2得到的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS筛选培养基平板上，存活的植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，即为T1代植株，培养T1代植株，并单株收获种子。4、将T1代植株的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS筛选培养基平板上，存活的植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，即为T2代植株，培养T2代植株，并单株收获种子。5、将T2代植株的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS筛选培养基平板上，存活的植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，即为T3代植株，培养T3代植株，并单株收获种子。6、将T3代植株的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS筛选培养基平板上，所有植株均可存活，植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，即为T4代植株(纯合的转GmGA20ox2基因植株)，培养T4代植株，并单株收获种子。7、将T4代植株的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS筛选培养基平板上，所有植株均可存活，植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，即为T5代植株(纯合的转GmGA20ox2基因植株)。三、转基因植物的分子鉴定步骤二获得了17个遗传稳定的转GmGA20ox2基因纯合株系，随机取其中三个株系(OE-9、OE-12和OE-16)进行如下鉴定：每个株系取15株T5代植株幼苗，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行RealTime-PCR(引物对：TAGGAACTGGACCTCATTGTGACC和AGGAGCGACAGAGTACCATCTTC)。以哥伦比亚生态型拟南芥作为对照植株。以AtActin2基因为内标，用于鉴定内标的引物对为：ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC和TGCTCATACGGTCAGCGATA。结果见图4。OE-9株系、OE-12株系和OE-16株系中GmGA20ox2基因的相对表达量约为1.0、1.3和2.1，哥伦比亚生态型拟南芥中未能检测出GmGA20ox2基因的表达。四、转空载体植株的获得用表达载体pGWB411代替重组质粒pGWB411-GmGA20ox2进行步骤二，得到转空载体拟南芥。五、千粒重测定将转空载体拟南芥、OE-9株系、OE-12株系和OE-16株系分别进行如下鉴定：每个株系取24株T5代植株，在相同条件下培养并收获籽粒，称取千粒重。在相同条件下培养24株哥伦比亚生态型拟南芥并收获籽粒，称取千粒重。进行三次重复实验，千粒重结果取平均值。哥伦比亚生态型拟南芥、转空载体拟南芥、OE-9株系、OE-12株系和OE-16株系的植株表型(如莲座、株高等)均未见明显差异。千粒重结果见图5。哥伦比亚生态型拟南芥、OE-6株系、OE-12株系和OE-16株系的籽粒千粒重分别为15.3±4.0、25.2±3.8、26.3±2.5和34.2±2.4。转空载体拟南芥的籽粒千粒重与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。结果表明，GmGA20ox2蛋白与种子重量相关，GmGA20ox2基因的过量表达提高了种子千粒重，并且其在提高转基因植株种子重量的同时，不影响植株的正常生长。因此，GmGA20ox2基因可作为提高植物种子产量的目的基因。当前第1页1 2 3