基于陆地棉转录组序列开发的EST‑SSR标记引物与应用的制作方法与工艺

基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用本案为申请号201410284580.1的分案申请技术领域本发明涉及基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用，特别涉及基于陆地棉Coker312茎尖转录组序列开发的EST-SSR引物及其应用，属于分子标记技术领域。

背景技术：
棉花是重要的经济作物之一，也是最重要的纺织纤维作物。其栽培种有4个,包括2个二倍体棉种,即草棉(Gossypium.herbaceum)和亚洲棉(G.arboreum)以及2个四倍体棉种,即陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)。由于陆地棉的产量高,适应性的特点，使之成为栽培种中的重要品种。但目前育成的陆地棉品种多样性水平降低，遗传基础狭窄，导致在生产上难以区分和识别，从而制约着产量和品质的进一步提高。随着基因组学的发展，分子标记成为改善这一问题的首选方法。简单重复序列(SSR)是一种高度多态和共显性标记，因而被广泛用于分子标记遗传分析。随着高通量测序技术的发展,许多物种中已开发出大量的转录组数据,这些数据在新标记的开发和应用过程中具有重要意义。萝卜(RaphanussativusL.),辣椒(CapsicumannuumL.),芝麻(SesamumindicumL.)等作物中转录组数据的挖掘，为其识别和开发新的EST-SSR标记提供可靠性。目前利用转录组序列开发新的分子标记在棉花中已有应用，来德勇等利用陆地棉花发育相关的转录组数据发掘了670个新的EST-SSR标记；陈浩东等从达尔文氏棉转录组序列中开发了780对EST-SSR引物，并详细分析了EST-SSR位点的特征，引物的多态性及可转移性；吕远大等基于海岛棉纤维发育EST序列开发出380对SSR引物；Jena等在草棉转录组99780个Unigene中，查找出12471个SSR位点，分布于8900条EST中。目前，棉花中开发的EST-SSR主要与纤维发育基因相关，与棉花早期形态建成相关的基因SSR标记开发尚未见报道。茎端组织与植物叶原基、芽原基的发生以及植物顶端生长优势密切相关，开发与此相关的EST-SSR既能增加棉花EST-SSR标记的数量，又能深入探究EST-SSR标记基因的功能。

技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用。基于陆地棉茎尖转录组序列开发出的EST-SSR引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富等优点，可有效用于棉花种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定、分子标记辅助育种等研究领域。本发明的技术方案如下：一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC056的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。上述EST-SSR标记SCRC056的引物在遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM处，位于chr.16(D7)上15.4cM的标记BNL2734与chr.16(D7)上24.4cM的标记CGR6280之间，与标记BNL2734相距5cM，与标记CGR6280相距4cM。一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC371的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。上述EST-SSR标记SCRC371的引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM处，位于chr.18(D13)上52.7cM的标记SHIN1403与chr.18(D13)上78.4cM的标记CGR5021之间，与标记SHIN1403相距10.5cM。一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC878的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。上述EST-SSR标记SCRC878的引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM处，位于连锁群末端,与位于chr.2(A2)上35.5cM的标记HAU880距离最近，相距7.0cM。一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC1022的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。上述EST-SSR标记SCRC1022的引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM处，位于chr.23(D9)上16.6cM的标记CGR5392与chr.23(D9)上24.4cM的标记HAU2017之间，与标记CGR5392相距2.9cM，与标记HAU2017相距4.9cM。上述的EST-SSR标记的引物进行棉花遗传多样性分析的方法，步骤如下：(1)DNA提取利用改良的CTAB法提取待测样品总DNA(2)引物扩增及电泳检测以步骤(1)提取的待测样品为模板，利用上述引物进行PCR扩增；扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。PCR体系(10μL)包括1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μL(20～50ng)DNA模板，加无菌蒸馏水至10μL。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃45s，(Tm)℃45s,72℃45s,共32个循环；72℃延伸7min；25℃保存。PCR产物加入2.0μL溴酚蓝后点样，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸电泳系统中进行。取1.2μL样品，以Takara20bpDNALadderMarker为DNA分子量标准，300W恒功率电泳40min，银染显色。(3)数据统计。采用两种数据统计的方法：①记录多态性位点。根据DNA分子量标准和引物扩增结果统计数据。同一等位点出现清晰条带记录为“1”，无条带记录为“0”；②差异性条带记录。以引物在亲本中扩增出的条带为标准，亲本1的带型记录为“1”，亲本2的带型记录为“2”，出现于亲本带型不一样的第一种带型记录为“3”，以此类推。所述遗传多样性分析为：采用上述(3)中①方法统计的数据，利用PopGene32计算引物的多态性信息含量(PIC)。所述高密度遗传图谱的构建是采用上述步骤(3)中②记录的数据采用Jion-Map4.0软件构建分子遗传连锁图谱(LOD值＝6.5)，以Kosambi函数作图；采用MapChart2.2绘图软件绘制遗传图谱。有益效果本发明所述的EST-SSR引物均来自陆地棉茎尖转录组序列，与以往的陆地棉纤维相关的转录组中开发出的SSR引物存在功能差别，所述的引物在陆地棉茎尖转录组中分布均匀、多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，并且成功连锁到高密度遗传图谱上，丰富了陆地棉基于转录组发掘SSR引物的数量，可有效用于棉花种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定。附图说明图1为SSRLocator软件搜索结果示意图；图2为引物SCRC056在13份试验材料中检测到的多态性的电泳结果图；图中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12号，5、中棉所10号，6、鲁棉研22号，7、鲁原343，8、3-79，9、海7124，10、阿须莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亚1号；图3为引物SCRC371在13份试验材料中检测到的多态性的电泳结果图；图中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12号，5、中棉所10号，6、鲁棉研22号，7、鲁原343，8、3-79，9、海7124，10、阿须莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亚1号；图4为引物SCRC878在13份试验材料中检测到的多态性的电泳结果图；图中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12号，5、中棉所10号，6、鲁棉研22号，7、鲁原343，8、3-79，9、海7124，10、阿须莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亚1号；图5为引物SCRC1022在13份试验材料中检测到的多态性的电泳结果图；图中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12号，5、中棉所10号，6、鲁棉研22号，7、鲁原343，8、3-79，9、海7124，10、阿须莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亚1号；图6为5对引物在重组自交系亲本中扩增后的电泳结果图；图中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，5对引物：SCRC056(Ⅰ)、SCRC371(Ⅱ)、SCRC584(Ⅲ)、SCRC878(Ⅳ)、SCR1022C(Ⅴ)；1、亲本1，2、亲本2；图7为4对引物在遗传图谱上的定位示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例陆地棉Coker312转录组EST-SSR在棉属种间及种内多态性分析中的应用1.棉花基因组DNA的提取(1)材料从棉花种质材料中选取5个棉种共13份材料(见表1)，用于新开发引物的评价，包括扩增效果和多态性分析。表1本发明中用于引物多态性分析的材料信息(2)CTAB法提取基因组DNA采用改良的CTAB法提取棉花DNA，具体步骤如下：1)取棉花供试材料的新鲜叶片0.2g，洗净，擦干，撕碎后放入2mLA离心管中，加入液氮，使用Retsch(MM400)组织研磨仪进行研磨。2)向离心管中加入700μL提取缓冲液(4℃保存，成分如表2所示)，涡旋均匀，冰浴10min，7200转/min离心10min，弃去上清液。表2提取缓冲液配方(500mL)3)向沉淀中加入700μL裂解缓冲液(65℃预热，成分如表3所示)，用枪头轻轻搅匀，65℃水浴40min，过程中轻轻翻转几次。表3裂解缓冲液配方(500mL)4)水浴后，加入氯仿：异戊醇(体积比24:1)700μL，翻转30次以上，15℃10000转/min离心10min。5)将上清液转入1.5mL离心管中，加入0.6倍上清液体积的异丙醇(-20℃预冷)，翻转直到出现絮状沉淀，静置10min，10000转/min离心8min，弃去上清液。6)在沉淀中加入700μL70％乙醇洗涤(此步可以过夜)，10000转/min离心5min，弃上清，置通风处干燥无酒精气味为止。7)加入700μLTE缓冲液，65℃水浴30min。8)DNA溶解后，加入700μL氯仿：异戊醇(体积比24:1)，缓慢翻转30次以上，静置5min后10000转/min离心10min。9)取上清液转入新的1.5mL离心管中，加入0.1倍上清液体积的醋酸钠，加入等上清液体积的异丙醇(-20℃)翻转30次以上，静置30min，10000转/min离心5min，弃去上清液。10)加入700μL70％乙醇洗涤DNA小团，10000转/min离心5min，弃去上清液，晾干DNA小团。11)加入200μLTE缓冲液，4℃保存。12)利用DNA浓度检测仪检测DNA浓度，1％(质量比体积)的琼脂糖凝胶电泳和EppendorfBiophotometerDNA浓度仪检测DNA质量。2.陆地棉Coker312茎尖转录组EST-SSR标记的开发(1)陆地棉茎尖转录组序列SSR位点的查找基于陆地棉茎尖转录组测序得到的73518条unigene序列，利用软件MISA和SSRLocator查找2～10bp的SSR位点，查找条件分别≥6、5、4、4、4、3、3、3。(2)陆地棉茎尖转录组SSR引物的设计根据步骤(1)中所获得的SSR序列为中心，提取SSR上下游各200bp序列，如果上游或下游序列不足200bp则提取上游或下游的全部序列设计引物。以新设计的SSR引物为引物，以CMD(http：//www.cottonmarker.org/)的EST序列为模板运行ePCR，获得了无重复的新EST-SSR引物，命名为SCRCXXX(ShanDongCottonResearchCenter)。设计的主要参数为：引物长度18～21bp，最适长度20bp，PCR产物长度100～395；最适Tm值58℃。引物设计成功后由上海生物工程有限公司合成。(3)陆地棉茎尖转录组SSR引物的扩增和筛选选择4份棉花材料，用于检测陆地棉转录组EST-SSR标记的扩增情况。采用步骤(2)中合成的引物，以4份材料的DNA为模板进行扩增，根据扩增效果筛选可稳定扩增、带型清晰的引物650对。上述650对扩增稳定的引物，在本发明所使用的13份棉花材料中进行扩增，其中有83对引物在13份材料中能扩出多态性条带，选取其中23对条带清晰，多态性信息丰富的条带，在不同种间及种内进行多态性分析。表4基于陆地棉茎尖转录组序列开发的23对EST-SSR引物信息PCR体系(10μL)包括：1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μl(20～50ng)DNA模板，加无菌蒸馏水至10μL。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，(Tm)℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸7min；25℃保存。PCR产物加入2.0μL溴酚蓝后点样，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸电泳系统中进行。取1.2μL样品，以Takara20bpDNALadderMarker为DNA分子量标准，300W恒功率电泳40min，银染显色。(4)数据分析1)记录多态性位点。根据DNA分子量标准和引物扩增结果统计数据。同一等位点出现清晰条带记录为“1”，无条带记录为“0”；建立供试材料SSR多态性信息数据库。利用PopGene32软件计算，供试材料不同种内及种间多态性信息(PIC)。在13份供试材料中，在总材料之间的PIC变幅：0.121～0.648，平均PIC为0.422，其中五个棉种间(Tm-1，3-79，阿非利加棉，雷蒙德氏棉，石系亚1号)的平均PIC＝0.424，明显高于陆地棉与海岛棉种间详情见表5。表523对陆地棉EST-SSR引物在棉属种间及种内的多态性分析在上述引物中选择在本实验室重组自交系亲本中有差异性条带的引物(见图6)，分别为：SCRC056，SCRC371，SCRC584，SCRC878，SCRC1022。使用这5对引物在重组自交系359个群体中记性扩增。上述本实验室重组自交系的构建为采用鲁棉研22号(父本)与鲁原343(母本)杂交后，从F2代开始连续自交至F8代获得，操作方法均为本领域常规手段。2)差异性条带记录。以引物在亲本中扩增出的条带为标准，亲本1的带型记录为“1”，亲本2的带型记录为“2”，出现于亲本带型不一样的第一种带型记录为“3”，以此类推。构建遗传图谱数据库。利用Jion-Map4.0软件构建分子遗传连锁图谱(LOD值＝6.5)，以Kosambi函数作图；采用MapChart2.2绘图软件绘制遗传图谱。上述5对引物中有4对成功连锁到前期构建的遗传图谱上(见图7)，分别为SCRC056、SCRC371、SCRC878、SCRC1022。其中，标记SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM处，位于chr.16(D7)上15.4cM的标记BNL2734与chr.16(D7)上24.4cM的标记CGR6280之间，与标记BNL2734相距5cM，与标记CGR6280相距4cM；标记SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM处，位于chr.18(D13)上52.7cM的标记SHIN1403与chr.18(D13)上78.4cM的标记CGR5021之间，与标记SHIN1403相距10.5cM；标记SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM处，位于连锁群末端,与位于chr.2(A2)上35.5cM的标记HAU880距离最近，相距7.0cM；标记SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM处，位于chr.23(D9)上16.6cM的标记CGR5392与chr.23(D9)上24.4cM的标记HAU2017之间，与标记CGR5392相距2.9cM，与标记HAU2017相距4.9cM。