一种多肽提取纯化方法和试剂盒与流程

文档序号:11803235阅读:来源:国知局

技术特征:

1. 一种多肽提取纯化方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

多肽提取:将待提取样本与含有蛋白质多肽变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液混合,反应后分离上清液;

还原烷基化处理:取所述上清液与还原剂混合进行还原反应,然后加入烷基化试剂进行烷基化反应;

多肽富集纯化:

a)使所述还原烷基化处理后的样品通过能够结合多肽的萃取器,所述萃取器预先用洗脱缓冲液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡;任选地,重复该步骤至少一次;

b)使清洗液通过所述萃取器以去除不结合的非多肽物质;任选地,重复该步骤至少一次;

c)依次使洗脱缓冲液和清洗液通过所述萃取器并收集穿透液;任选地,重复该步骤至少一次,并混合所述穿透液;

任选地,将所述穿透液离心抽干得到纯化后的多肽。

2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:

多肽进一步纯化:

d)用超滤器超滤所述穿透液或所述纯化后的多肽溶解后得到的溶液,所述超滤器预先用清洗液清洗并平衡、能够截留分子量大于待纯化多肽的蛋白成分;

e)用洗脱液洗脱所述超滤器并收集滤过液;任选地,重复该步骤至少一次,并混合所述滤过液;

任选地,将所述滤过液离心抽干得到进一步纯化后的多肽。

3. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述待提取样本选自组织类样本、体液类样本或细胞类样本;

优选地,所述组织类样本是提前匀浆或液氮研磨的,所述组织类样本与所述缓冲液按质量体积比(g/ml)或体积比(ml/ml)为1:1~1:10混合,混合后涡旋震荡或冰浴超声处理,然后离心取上清液;

优选地,所述体液类样本包括血清、血浆、脑脊液、精浆、唾液或尿液,所述体液类样本与所述缓冲液按体积比(ml/ml)为1:1~1:10混合,优选混合稀释至样品蛋白浓度为1~10mg/ml,混合后涡旋震荡,然后离心取上清液;

优选地,所述细胞类样本与所述缓冲液按体积比(ml/ml)为1:3~1:10混合,优选混合稀释至样品蛋白浓度为1~10mg/ml,混合后涡旋震荡或冰浴超声处理,然后离心取上清液;

优选地,所述蛋白质多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲;

优选地,所述蛋白质多肽变性剂在所述缓冲液中的浓度为6~10mol/L,所述蛋白酶抑制剂在所述缓冲液中的浓度为0.2~1mg/ml,所述缓冲液的pH缓冲范围为7~10。

4. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巯基乙醇;

优选地,所述还原剂的母液浓度为0.1~1.5mol/L,工作浓度为5~50mmol/L,所述还原反应的温度为50~65℃,时间为30~70min;

优选地,所述烷基化试剂为碘代乙酰胺;

优选地,所述烷基化试剂的母液浓度为0.1~1mol/L,工作浓度为20~100mmol/L,所述烷基化反应的温度为15~30℃,时间为30~60min。

5. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述萃取器为萃取柱,优选为C18固相萃取柱;

优选地,采用配置的推气筒推动所述样品、洗脱缓冲液和清洗液通过所述萃取器;

优选地,所述清洗液为可挥发性酸性水溶液,更优选为甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液;进一步优选地,所述可挥发性酸性水溶液中酸的含量为0.05~1wt%,pH值范围为2~4;

优选地,所述洗脱缓冲液选自可挥发可溶于水的有机溶液,更优选为80~100体积%的乙腈水溶液或80~100体积%的甲醇水溶液。

6. 根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述超滤器为超滤管;

优选地,所述洗脱液为可挥发可溶于水的有机溶剂水溶液,更优选为甲醇水溶液或乙腈水溶液;

优选地,所述甲醇水溶液或乙腈水溶液的浓度为5~20%(体积)。

7. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

多肽提取:将选自组织类样本、体液类样本或细胞类样本的待提取样本与含有蛋白质多肽变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液按体积比(ml/ml)为1:1~1:10混合,混合后涡旋震荡或冰浴超声处理,然后离心取上清液;

还原烷基化处理:取所述上清液与选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巯基乙醇的还原剂混合进行还原反应,然后加入碘代乙酰胺进行烷基化反应;

多肽富集纯化:

a)使所述还原烷基化处理后的样品通过能够结合多肽的萃取柱,所述萃取柱预先用洗脱缓冲液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡,所述清洗液为甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液,所述洗脱缓冲液为80~100体积%的乙腈水溶液或80~100体积%的甲醇水溶液;任选地,重复该步骤至少一次;

b)使清洗液通过所述萃取柱以去除不结合的非多肽物质;任选地,重复该步骤至少一次;

c)依次使洗脱缓冲液和清洗液通过所述萃取柱并收集穿透液;任选地,重复该步骤至少一次,并混合所述穿透液;

d)将所述穿透液离心抽干得到纯化后的多肽;

多肽进一步纯化:

e)用超滤管超滤所述纯化后的多肽溶解后得到的溶液,所述超滤管预先用清洗液清洗并平衡、能够截留分子量大于待纯化多肽的蛋白成分;

f)用洗脱液洗脱所述超滤器并收集滤过液,所述洗脱液为甲醇水溶液或乙腈水溶液;任选地,重复该步骤至少一次,并混合所述滤过液;

g)将所述滤过液离心抽干得到进一步纯化后的多肽。

8. 一种多肽提取纯化试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括以下组成部分:

多肽提取缓冲液:含有蛋白质多肽变性剂和蛋白酶抑制剂,用于从待提取样本中提取多肽,以得到分离的上清液;

还原烷基化试剂:包含还原剂和烷基化试剂,所述还原剂用于与所述上清液进行还原反应,所述烷基化试剂用于与所述还原反应之后的样品进行烷基化反应;

萃取器:能够结合待纯化的多肽,用于富集纯化所述还原烷基化处理后的样品中的多肽,该萃取器使用前预先用洗脱缓冲液清洗并活化然后用清洗液清洗并平衡,使用时使所述还原烷基化处理后的样品通过该萃取器,然后使清洗液通过该萃取器以去除不结合的非多肽物质,再依次使洗脱缓冲液和清洗液通过该萃取器并收集穿透液。

9. 根据权利要求8所述的多肽提取纯化试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括以下组成部分:

超滤器:能够截留分子量大于待纯化多肽的蛋白成分,用于对所述萃取器富集纯化后的样品进行超滤,该超滤器使用前预先用清洗液清洗并平衡,使用时使所述萃取器富集纯化后的样品通过该超滤器,然后用洗脱液洗脱该超滤器并收集滤过液。

10. 根据权利要求8或9所述的多肽提取纯化试剂盒,其特征在于,所述蛋白质多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲,浓度为6~10mol/L;所述蛋白酶抑制剂在所述缓冲液中的浓度为0.2~1mg/ml,所述缓冲液的pH缓冲范围为7~10;

优选地,所述还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巯基乙醇,浓度为0.1~1.5mol/L;

优选地,所述烷基化试剂为碘代乙酰胺,浓度为0.1~1mol/L;

优选地,所述萃取器为萃取柱,优选为C18固相萃取柱;

优选地,所述超滤器为超滤管;

优选地,所述试剂盒还包括:洗脱缓冲液、清洗液和洗脱液;进一步优选地,所述清洗液为可挥发性酸性水溶液,更优选为甲酸水溶液、乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液,更进一步优选地,所述可挥发性酸性水溶液中酸的含量为0.05~1wt%,pH值范围为2~4;进一步优选地,所述洗脱缓冲液选自可挥发可溶于水的有机溶液,更优选为80~100体积%的乙腈水溶液或80~100体积%的甲醇水溶液;进一步优选地,所述洗脱液为可挥发可溶于水的有机溶剂水溶液,更优选为甲醇水溶液或乙腈水溶液,更进一步优选地,所述甲醇水溶液或乙腈水溶液的浓度为5~20%(体积)。

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