2-芳基硫代-5-卤代嘧啶酮类衍生物的制备方法及其作为抗乙肝病毒药物的应用与流程

本发明涉及药物化学领域，更具体的说，涉及一种具有抗乙肝病毒活性的2-芳基硫代-5-卤代嘧啶酮类衍生物的制备方法及其用于治疗乙型肝炎。

背景技术：

乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B Virus)是最常见的肝炎病毒，目前全世界有超过20亿人感染，其中3.6亿人为慢性感染。全球每年有近5000万人新增感染，且有约100万人死于与HBV感染相关的肝病，其中肝细胞癌占慢性感染者的15％-25％。乙肝感染呈世界性流行，不同地区乙肝感染流行的差异很大，其中亚太地区、非洲地区和阿拉伯半岛、北美洲北部和南美洲东部为流行区，且在儿童和青壮年人群中发病率较高。在中国，这种情况尤其严重，我国也是乙肝高发的国家之一。根据2006年的调查统计，在中国约有9300万为慢性乙肝感染者。在所有人群中，婴幼儿时期的感染占绝大多数，尤其在5岁左右，5岁以后儿童慢性化风险有所下降。据乙肝年报告的发病率数据显示，乙肝感染呈上升趋势，每年乙肝感染者用于支付医疗费用总计高达500亿人民币。因此，乙肝不仅严重影响了人们的身心健康，更给家庭和社会带来了沉重的经济负担。治疗乙肝、根治乙肝、研制高效低毒、不易诱导耐药变异的新型乙肝药物是我国乃至全世界医学药学科学家关注的重点。

尽管乙肝疫苗很大程度上降低了HBV的流行性，但针对慢性乙肝患者的治疗方案仍十分有限。一种策略是通过有限的治疗疗程获得持久应答，即干扰素类，包括干扰素-α和新型聚乙二醇干扰素，但其治疗常因耐受性差，且只对约30％具有良好应答预测因素的患者有明显效果受限；另一种策略是通过维持治疗获得持久应答，即核苷或核苷酸类似物，包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定和泰诺福韦等。为获得持久应答需长期服药，尽管这类药物口服耐受性较好，但治疗过程中HBV耐药变异相关的病情反跳限制其应用。因此，新型高效低毒的抗HBV药物的研究具有十分重大的意义。

依据已知的乙肝病毒复制周期及目前临床上使用的抗乙肝病毒所用核苷类药物使用周期长、易产生耐药等问题，我们设计并合成了一类具有新母核结构的非核苷类活性小分子。与已知上市的治 疗乙肝药物相比，此类化合物的作用机制与核苷类药物有所不同。非核苷类乙肝病毒抑制剂抗病毒效果明显，毒副作用小，部分抑制剂的效果甚至超过上市药物拉米夫定，有望缓解现阶段乙肝药物的耐药性问题。与此同时，非核苷类乙肝病毒抑制剂与抗乙肝病毒的天然活性药物相比合成容易，原料易得，适合大量制备和生产，因此其作为新一类高活性的乙肝病毒DNA复制的抑制剂为将来乙肝药物的开发提供了良好的借鉴。

技术实现要素：

本发明人经研究制备一系列2-芳基硫代-5-卤代嘧啶酮类衍生物，这些化合物具有抗乙肝病毒活性。

本发明的目的是提供新的2-芳基硫代-5-卤代嘧啶酮类衍生物。

本发明的第二个目的是提供上述衍生物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述衍生物的应用。

本发明的第四个目的是提供含有上述衍生物的药物组合及其应用。

针对核苷与核苷类似物在乙肝长期维持治疗过程中容易诱发耐药的问题，我们设计了新型非核苷类乙肝病毒的抑制剂。由于核苷类抑制剂大多数都是通过在细胞激酶的作用下发生三磷酸化，从而模拟天然底物掺入到病毒DNA的合成中，以底物竞争机制发挥抗病毒活性，因此长期使用会诱导HBV DNA聚合酶发生变异，进而对核苷类药物形成耐药以及交叉耐药。非核苷类乙肝病毒抑制剂的作用机制与核苷类有所不同，根据乙肝病毒的复制周期不同阶段可以分为进入抑制剂、cccDNA合成抑制剂、组装与包裹抑制剂、逆转录抑制剂、组装与分泌抑制剂等。非核苷类乙肝病毒药物作用机制的多样性和高效低毒的特点使得其在乙肝药物研究中越来越受到重视，因此本发明基于课题组前期的工作设计合成了一类新型非核苷类乙肝病毒抑制剂。

本发明设计合成了2-芳基硫代-5-卤代嘧啶酮类衍生物，如通式I所示，该类化合物在乙肝病毒抑制剂领域仍属首次报道。随后本发明对所有制备的目标化合物进行了抗乙肝病毒活性的筛选。我们选取了能够稳定表达乙肝病毒的HepAD38细胞系，以细胞外上清中的HBV DNA的拷贝数作为评价指标，利用荧光定量PCR的方法进行检测，得到目标化合物的EC₅₀值。同时我们利用MTT法测定了化合物的细胞毒性CC₅₀值，进一步计算出药物的治疗指数SI。

根据本发明的实施方案，本发明涉及通式I类衍生物如下：

其中，

X取代基为碘、溴、氯；

Y取代基为CH₂、C＝O；

R₁取代基为氢、氰基、硝基；

R₂取代基为哌啶、四氢吡咯、吗啉、噁唑烷、哌嗪、4-甲基哌嗪，4-乙基哌嗪、4-异丙基哌嗪、环己胺、环戊胺、环庚胺、N-甲基环己胺、N-甲基环戊胺、N-甲基环庚胺、N-乙基环己胺、N-异丙基环己胺、1，2，3，4-四氢异喹啉、1，2，3，4-四氢异喹啉、吲哚，吲哚啉，异吲哚啉、1，2-二氢喹啉、1，2-二氢异喹啉、苯胺、3，5-二甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、3，4，5-三甲基苯胺、2-甲基苯胺、3-甲基苯胺、4-甲基苯胺、3，5-二甲氧基苯胺、2，6-二甲氧基苯胺、3，4，5-三甲氧基苯胺、2-甲氧基苯胺、3-甲氧基苯胺、4-甲氧基苯胺、3，5-二氟苯胺、4-氯苯胺、4-硝基苯胺、苄胺、2-苯乙胺、2-(3，5-二甲基)苯乙胺、3-苯丙胺、3-(3，5-二甲基)苯丙胺、4-苯正丁胺、4-(3，5-二甲基)苯正丁胺、N-甲基苯胺、N-乙基苯胺、N-异丙基苯胺、N-甲基-3，5-二甲基苯胺、2-氨基吡啶、3-氨基-1，2，4-三氮唑。

本发明通式I类化合物可按照以下合成路线制备，通过下列反应式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

反应路线1以芳基溴苄为原料，经过与硫脲在丙酮溶剂中发生亲核取代反应，得到芳基取代硫脲2。接着与4-氯乙酰乙酸乙酯在碳酸钠水溶液中缩合，得到6位为苄基氯的2-芳基硫代嘧啶酮3。该中间体接着在冰浴条件下与N-卤代丁二酰亚胺发生亲电取代，在嘧啶环的5位引入了一个碘原子得到中间体4。最终4和不同种类的脂肪族胺发生S_N2亲核取代得到终产物5-9。

反应路线2从芳基取代硫脲2出发，与草酰乙酸二乙酯在氢氧化钠水溶液条件下发生缩合反应，合环后经水解得到乳清酸盐，经浓盐酸酸化后得到重要中间体2-硫代乳清酸衍生物10。接着与N-卤代丁二酰亚胺在DMF作溶剂，0℃下反应得到嘧啶环5位引入碘原子的中间体11。最后11在以二氯亚砜作溶剂回流条件下首先制成酰氯，接着不做提纯直接在二氯甲烷溶剂中与脂肪族胺进行亲核取代反应，最终通过减压柱色谱分离和甲醇洗涤除去有色物质得到终产物12a-i，其中中间体酰氯在和芳香族胺反应时需加入三乙胺，得到化合物12j-r。

另一方面，本发明还涉及药物组合物，其包括至少一种通式I类和II类化合物或其光学异构体或其药学上可接受的盐以及药用载体或赋形剂。

本发明化合物的药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室、胸骨内或静脉内给药方式。本发明的药物组合物可单独给药也可与其它抗病毒药物联合用药，主要应用范围为人或其他灵长类哺乳动物。

当本发明化合物作为口服用药时，可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体包括润滑剂、填充剂、崩解剂、粘合剂。润滑剂包括硬脂酸、硬脂酸钙、滑石粉、氧化植物油、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶、滑石粉。填充剂包括淀粉、预胶化淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、糖粉、微晶纤维素。粘合剂包括但不限于羟丙基纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精、糖粉、糖浆、胶浆、纤维素及其衍生物。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉及其衍生物、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、泡腾崩解剂。胶囊制剂使用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬乳液制剂是把本发明化合物与适宜的悬浮剂混合使用，悬浮剂包括润湿剂、絮凝剂、反絮凝剂。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水、油悬浮、无菌注射溶液。可使用的载体或溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，包括单甘油酯和二甘油酯。

另外，多种因素影响本发明化合物的使用剂量和方法，包括患者的年龄、体重、性别、化合物的活性强度、自然健康状况、代谢速度、服用时间、病症的严重程度，具体剂量和方法由医师根据患者的病情判断。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。如无特殊说明，下述实施例中“减压蒸除溶剂”指“水泵减压条件下用旋转蒸发仪蒸干溶剂”。

实施例1 2-(4-氰基苄基)硫代-5-碘代-6-(N-哌啶甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物5a)

将2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4a(0.24mmol)与哌啶(0.96mmol)混合，加入5mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，粗产物用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到19mg白色固体，产率17％，熔点182-183℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.43(m，2H，CH₂)，1.56(m，4H，CH₂)，2.87(m，4H，NCH₂)，3.84(s，2H，CH₂N)，4.41(s，2H，SCH₂)，7.63-7.75(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝48Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：145.27(aryl)，132.66(aryl)，130.29(aryl)，119.28(CN)，110.06(aryl)，54.08(aryl-CH₂N)，33.77(CH₂S-aryl)，24.29(CH₂)，22.82(CH₂)；m/z(ESI)：467[M+H]⁺.

实施例2 2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-(N-吗啉甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物6a)

将2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4a(0.05mmol)与吗啉(0.20mmol)混合，加入3mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，粗产物用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到63mg白色固体，产率100％，熔点180-182℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：2.48(m，4H，NCH₂)，3.54(m，4H，CH₂O)，3.55(s，2H，CH₂N)，4.47(s，2H，SCH₂)，7.70-7.78(dd，4H，J＝8Hz，J＝31.2Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：144.37(aryl)，132.70(aryl)，130.49(aryl)，119.21(CN)，110.34(aryl)，66.59(CH₂O)，65.95(NCH₂)，53.77(aryl-CH₂N)，33.67(CH₂S-aryl)；m/z(ESI)：467[M-H].

实施例3 2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-(N-甲基-N-环己胺基甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物7a)

将2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4a(0.18mmol)与N-甲基环己胺(0.72mmol)混合，加入3mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，粗产物用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到16mg白色固体，产率19％，熔点122-124℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.06-1.89(m，10H，cyclohexyl)，2.53(s，3H，NCH₃)，2.92(m，1H，NCH)，3.93(s，2H，CH₂N)，4.42(s，2H，SCH₂)，7.65-7.76(dd，4H，J＝8Hz，J＝46Hz，ArH)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：145.42(aryl)，132.68(aryl)，130.33(aryl)，119.30(CN)，110.07(aryl)，63.92(NCH₃)，38.07(NCH)，33.71(CH₂S-aryl)，27.42(cyclohexyl)，25.55(cyclohexyl)，25.30(cyclohexyl)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₀H₂₄N₄OSI[M+H]⁺495.0716，found 495.0723.

实施例4 2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-(N-环己胺基甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物8a)

将2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4a(0.24mmol)与环己胺(0.96mmol)混合，加入5mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，粗产物用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到21mg白色固体，产率19％，熔点185-186℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.02-1.29(m，6H，cyclohexyl)，1.56(m，1H，NH)，1.71(m，2H，cyclohexyl)，1.97(m，2H，cyclohexyl)，2.99(m，1H，NCH)，3.93(s，2H，CH₂N)，4.37(s，2H，SCH₂)，7.58-7.74(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝64Hz，ArH)，8.57(m，1H，NHCO)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：146.27(aryl)，132.64(aryl)，130.19(aryl)，119.37(CN)，109.77(aryl)，56.43(aryl-CH₂N)，50.37(NCH)，33.87(SCH₂-aryl)，29.03(cyclohexyl)，25.20(cyclohexyl)，24.43(cyclohexyl)；HRMS(m/z)：calcd for C₁₉H₂₂N₄OSI[M+H]⁺481.0559，found 481.0566.

实施例5 2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-(N-(1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物9a)

将2-(4-氰基苄基)-硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4a(0.04mmol)与1，2，3，4-四氢异喹啉(0.16mmol)混合，加入3mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，粗产物用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到16mg白色固体，产率77％，熔点185-186℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：2.82(m，2H，NCH₂)，2.85(m，2H，CH₂-aryl)，3.68(s，2H，NCH₂-aryl)，3.79(s，2H，CH₂N)，4.43(s，2H，SCH₂)，6.99(m，1H，ArH)，7.11-7.15(m，3H，ArH)，7.44-7.67(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝92Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：144.51(aryl)，134.20(aryl)，132.48(aryl)，130.61(aryl)，128.98(aryl)，126.91(aryl)，126.64(aryl)，126.04(aryl)，119.11(CN)，110.22(aryl)，65.36(NCH₂-aryl)，55.42(aryl-CH₂N)，51.06(NCH₂)，33.51(SCH₂-aryl)，28.92(CH₂-aryl)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₂H₂₀N₄OSI[M+H]⁺515.0403，found 515.0397.

实施例6 2-苄基硫代-5-碘代-6-(N-哌啶甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物5b)

将2-苄基硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4b(0.12mmol)与哌啶(0.48mmol)混合，加入3mL DMF溶剂在室温下反应4小时，TLC检测反应完全；后处理将混合物倒入15mL冷水中，抽滤，母液用二氯甲烷萃取(20mL×3)，二氯相用无水硫酸钠干燥合并，后用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到34mg白色固体，产率64％，熔点176-177℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.44(m，2H，CH₂)，1.57(m，4H，CH₂)，2.80(m，4H，NCH₂)，3.77(s，2H，CH₂N)，4.36(s，2H，SCH₂)，7.22-7.32(m，3H，ArH)，7.43-7.44(m，2H，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：138.57(aryl)，129.36(aryl)，128.80(aryl)，127.46(aryl)，54.23(aryl-CH₂N)，34.27(CH₂S-aryl)，24.66(CH₂)，23.08(CH₂)；m/z(ESI)：443[M+H]⁺.

实施例7 2-苄基硫代-5-碘代-6-(N-吗啉甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物6b)

将2-苄基硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4b(0.07mmol)与吗啉(0.28mmol)混合，加入3mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，粗产物用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到15mg白色针晶，产率46％，熔点172-173℃。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：2.68(m，4H，NCH₂)，3.68(s，2H，CH₂N)，3.72(m，4H，CH₂O)，4.46(s，SCH₂)，7.30-7.32(m，3H，ArH)，7.42-7.44(m，2H，ArH)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：135.94(aryl)，129.07(aryl)，128.68(aryl)，127.79(aryl)，66.78(CH₂O)，53.75(aryl-CH₂N)，35.12(CH₂S-aryl)，29.69(CH₂N)；m/z：445[M+H]⁺.

实施例8 2-苄基硫代-5-碘代-6-(N-甲基-N-环己胺基甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物7b)

将2-苄基硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4b(0.08mmol)与N-甲基环己胺(0.32mmol)混合，加入2mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到25mg白色固体，产率70％，熔点169-171℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.03-1.89(m，10H，cyclohexyl)，2.48(s，3H，NCH₃)，2.85(m，1H，NCH)，3.88(s，2H，CH₂N)，4.35(s，2H，SCH₂)，7.21-7.44(m，5H，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：138.82(aryl)，129.40(aryl)，128.82(aryl)，127.45(aryl)，63.54(NCH₃)，38.05 (NCH)，34.27(CH₂S-aryl)，27.75(cyclohexyl)，27.72(cyclohexyl)，25.72(cyclohexyl)，25.43(cyclohexyl)；HRMS(m/z)：calcd for C₁₉H₂₅N₃OSI[M+H]⁺470.0763，found 470.0757.

实施例9 2-苄基硫代-5-碘代-6-(N-环己胺基甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物8b)

将2-苄基硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4b(0.16mmol)与环己胺(0.64mmol)混合，加入3mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，采用甲醇重结晶法纯化，得到65mg白色固体，产率92％，熔点183-185℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.05-1.32(m，6H，cyclohexyl)，1.57(m，1H，NCH)，1.73(m，2H，cyclohexyl)，1.99(m，2H，cyclohexyl)，2.99(m，1H，NH)，3.92(s，2H，CH₂N)，4.30(s，2H，SCH₂)，7.20-7.30(m，3H，ArH)，7.37-7.38(m，2H，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：139.59(aryl)，129.21(aryl)，128.75(aryl)，127.17(aryl)，85.91(C5)，56.49(aryl-CH₂N)，50.37(NCH)，34.44(SCH₂-aryl)，30.83(cyclohexyl)，29.34(cyclohexyl)，25.28(cyclohexyl)，24.45(cyclohexyl)；m/z(ESI)：457[M+H]⁺.

实施例10 2-苄基硫代-5-碘代-6-(N-(1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基)-3(H)-4-嘧啶酮(化合物9b)

将2-苄基硫代-5-碘代-6-氯甲基-4(3H)-嘧啶酮4b(0.38mmol)与1，2，3，4-四氢异喹啉(0.38mmol)混合，加入2mL DMF溶剂在室温下反应10小时，TLC检测反应完全；减压整除溶剂，用减压硅胶柱色谱方法进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到153mg黄色固体，产率82％，熔点96-98℃。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：2.82(m，2H，NCH₂)，2.88(m，2H，CH₂-aryl)，3.75(s，2H，NCH₂-aryl)，3.79(s，2H，CH₂N)，4.40(s，2H，SCH₂)，7.02(m，1H，ArH)，7.09-7.17(m，6H，ArH)，7.43-7.45(m，2H，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：138.05(aryl)，134.24(aryl)，129.59(aryl)，128.95(aryl)，128.77(aryl)，127.64(aryl)，126.86(aryl)，126.57(aryl)，126.01(aryl)，55.59(aryl-CH₂N)，51.03(NCH₂)，34.10(SCH₂-aryl)；m/z(ESI)：491[M+H]⁺.

实施例11 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-吗啉基)酰胺(化合物12a)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.24mmol)与5mL二氯亚砜加热回流7小时，40℃下减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，滴加吗啉(0.96mmol)，0℃反应10小时，TLC检测反应完全。减压整除溶剂，粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得产物48mg，产率41％，白色固体，熔点131-134℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：3.19-3.21(m，2H，NCH₂)，3.51-3.53(m，2H，NCH₂)，3.59(m，2H，CH₂O)，3.63-3.66(m，2H，CH₂O)，4.43(s，2H，CH₂S-aryl)，7.58-7.79(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝82.4Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：143.86(aryl)，132.75(aryl)，130.43(aryl)，119.19(CN)，110.45(aryl)，66.75(CH₂O)，66.27(CH₂O)，46.52(NCH₂)，33.78(CH₂S-aryl)；HRMS(m/z)：calcd for C₁₇H₁₄N₄O3SI[M-H]⁺480.9831，found 480.9818.

实施例12 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(4-N甲基哌嗪基)-酰胺(化合物12b)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.36mmol)与5mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加N-甲基哌嗪(1.44mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得产物15mg，白色固体，产率8％，熔点221-222℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：2.31(s，3H，NCH₃)，2.40(m，2H，CH₂N)，2.52(m，2H，CH₂N)，3.21(m，2H，NCH₂)，3.60(m，2H，NCH₂)，4.38(s，2H，CH₂S-aryl)，7.58-7.76(dd，4H，J＝8Hz，J＝76Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：165.53(C＝O)，144.48(aryl)，132.70(aryl)，130.33(aryl)，119.24(CN)，110.27(aryl)，54.66(NCH₂)，54.00(NCH₂)，45.45(CH₂N)，33.78(CH₂S-aryl)；HRMS(m/z)：calcd for C₁₈H₁₇N₅O₂SI[M+H]⁺494.0148，found 494.0142.

实施例13 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-甲基-N-环己胺基)-酰胺(化合物12c)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.42mmol)与5mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加N-甲基环己胺(1.68mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得产物30mg，产率14％，白色固体，熔点235-237℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，298K)δ：1.23-1.83(m，10H，cyclohexyl)，2.57and 2.82(s，3H，NCH₃)，3.17and 4.26(m，1H，NCH)，4.39and 4.43(s，2H，SCH₂-aryl)，7.55-7.78(dd，4H，ArH)，13.32(s，1H，NHCO)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：166.36(C=O)，143.83(aryl)，132.70(aryl)，130.25(aryl)，119.16(CN)，110.40(aryl)，57.78(NCH₃)，52.12(NCH)，33.85(CH₂S-aryl)，29.82(cyclohexyl)，29.10(cyclohexyl)，26.64(cyclohexyl)，25.65(cyclohexyl)，25.41(cyclohexyl)，25.70(cyclohexyl)，25.02(cyclohexyl)；m/z：507[M-H]^-.

实施例14 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-环己胺基)酰胺(化合物12d)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.29mmol)与3mL二氯亚砜加热回流7小时；减压蒸除溶剂，向混合物中加入7mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加环己胺(1.16mmol)，冰浴搅拌 反应10小时，TLC检测反应完全。后处理抽滤，得产物146mg，产率64％，白色固体，熔点188-191℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.28-1.85(m，10H，cyclohexyl)，3.69(m，1H，NCH)，4.44(s，2H，SCH₂-aryl)，7.61-7.75(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝55.6Hz，ArH)8.34(d，1H，CONH，J＝8Hz)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：166.08(C＝O)，145.91(aryl)，132.57(aryl)，130.36(aryl)，119.33(CN)，109.91(aryl)，49.77(cyclohexyl)，48.02(cyclohexyl)，33.82(CH₂S-aryl)，32.52(cyclohexyl)，30.83(cyclohexyl)，25.66(cyclohexyl)，25.02(cyclohexyl)，24.22(cyclohexyl)；m/z(ESI)：493[M-H]^-.

实施例15 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(1，2，3，4-四氢异喹啉))-酰胺(化合物12e)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.37mmol)与5mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入6mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加1，2，3，4-四氢异喹啉(0.74mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。后处理进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物28mg，黄色固体，产率14％，熔点188-190℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，298K)δ：2.79and 2.92(t，2H，CH₂-aryl)，3.46and 3.85(t，2H，NCH₂)，4.35and 4.44(s，2H，SCH₂-aryl)，4.39and 4.76(s，2H，NCH₂-aryl)，7.08-7.28(m，4H，ArH)，7.49-7.54and 7.57-7.69(dd，4H，J＝8Hz，J＝66.4Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：143.80(aryl)，134.57(aryl)，134.43(aryl)，133.23(aryl)，132.88(aryl)，132.71(aryl)，132.49(aryl)，130.68(aryl)，130.40(aryl)，129.18(aryl)，129.02(aryl)，127.12(aryl)，127.05(aryl)，126.80(aryl)，126.73(aryl)，128.66(aryl)，119.17(CN)，110.44(aryl)，110.33(aryl)，43.65(NCH₂-aryl)，43.42(NCH₂-aryl)，33.79(SCH₂-aryl)，33.65(SCH₂-aryl)，29.32(CH₂-aryl)，28.12(CH₂-aryl)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₂H₁₆N₄O₂SI[M-H]⁺527.0044，found 527.0046.

实施例16 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(1，2，3，4-四氢喹啉))-酰胺(化合物12f)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.40mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入6mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加1，2，3，4-四氢喹啉(0.80mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到粗产物，用1mL二氯甲烷洗涤除去有色杂质，得到产物，白色固体20mg，产率11％，熔点136-137℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，298K)δ：1.86and 2.19(m，2H，CH₂)，2.82(t，2H，CH₂-aryl)，3.44，3.56and 4.09(m，2H，NCH₂)，4.41and 4.45(s，2H，SCH₂-aryl)，6.47and 8.02(d，1H，J＝8Hz，ArH)，6.84and 7.13(t，1H，ArH)，7.07and 7.18(t，1H，ArH)，7.21-7.25(m，1H，ArH)，7.57-7.74and 7.59-7.79(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝58Hz，ArH)¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：165.84(C＝O)，143.73(aryl)，137.26(aryl)，123.12-133.21(aryl)，119.13(CN)，110.48(aryl)，55.36(NCH₂)，46.26(CH₂-aryl)，43.01(CH₂-aryl)，33.82(SCH₂-aryl)，26.73(CH₂)，23.30(CH₂)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₂H₁₆N₄O₂SI[M-H]⁺527.0039，found 527.0040.

实施例17 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-苄胺基)-酰胺(化合物12g)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.22mmol)与3mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入6mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加苄胺(0.88mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。后处理抽滤，得白色固体为粗产物，接着进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物61mg，白色固体，产率55％，熔点224-226℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.45(d，2H，J＝6.4Hz，NCH₂-Ph)，4.49(s，2H，SCH₂-aryl)，7.27-7.39(m，5H，PhH)，7.56-7.65(dd，4H，J＝8Hz，J＝37.2Hz，ArH)，9.03(t，1H，NH)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：139.70(aryl)，132.56(aryl)，130.31(aryl)，129.30(aryl)，129.12 (aryl)，128.64(aryl)，127.79(aryl)，127.21(aryl)，119.42(CN)，109.82(aryl)，42.45(NCH₂-Ph)，33.80(SCH₂-aryl)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₀H₁₄N₄O₂SI[M-H]⁺500.9882，found 500.9876.

实施例18 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(2-苯乙胺基))-酰胺(化合物12h)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.24mmol)与3mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加苄胺(0.95mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。后处理抽滤，得白色固体为粗产物，接着进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物54mg，白色固体，产率44％，熔点240-242℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：2.849(t，2H，CH₂-Ph)，3.47(q，2H，NCH₂)，4.46(s，2H，SCH₂-aryl)，7.18-7.29(m，5H，PhH)，7.57-7.75(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝72Hz，ArH)，8.61(t，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：167.09(C＝O)，152.41(C＝O)，146.55(aryl)，139.89(aryl)，137.90(aryl)，132.57(aryl)，130.23(aryl)，129.12(aryl)，129.07(aryl)，128.80(aryl)，127.18(aryl)，126.53(aryl)，119.40(CN)，109.71(aryl)，35.38(NCH₂)，33.88(SCH₂-aryl)，33.73(CH₂-Ph)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₁H₁₆N₄O₂SI[M-H]⁺515.0039，found 515.0046.

实施例19 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(3-苯丙胺基))-酰胺(化合物12i)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.25mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入6mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加3-苯丙胺(1.00mmol)，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系， 得到产物35mg，白色固体，产率26％，熔点189-192℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：1.81(m，2H，CH₂)，2.66(t，2H，CH₂-Ph)，3.24(q，2H，NCH₂)，4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，7.16-7.30(m，5H，PhH)，7.60-7.73(dd，4H，J＝8Hz，J＝52Hz，ArH)，8.58(t，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：165.86(C＝O)，143.91(aryl)，142.13(aryl)，132.72(aryl)，130.56(aryl)，128.82(aryl)，128.77(aryl)，128.70(aryl)，126.24(aryl)，119.14(CN)，110.51(aryl)，38.68(NCH₂)，33.70(SCH₂-aryl)，32.98(CH₂-Ph)，31.25(CH₂)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₂H₁₈N₄O₂SI[M-H]⁺529.0195，found 529.0203.

实施例20 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-苯胺基)酰胺(化合物12j)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.36mmol)与5mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加苯胺(1.44mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物17mg，产率19％，白色固体，熔点235-236℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.49(s，2H，SCH₂-aryl)，7.13-7.17(m，1H，ArH)，7.37-7.41(m，2H，ArH)，7.68(m，2H，ArH)，7.61-7.73(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝48.8Hz，ArH)，10.55(s，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：164.45(C＝O)，143.75(aryl)，138.81(aryl)，132.73(aryl)，130.65(aryl)，129.43(aryl)，124.66(aryl)，120.15(aryl)，119.17(CN)，110.55(aryl)，33.85(SCH₂-aryl)；HRMS(m/z)：calcd for C₁₉H₁₂N₄O₂SI[M-H]⁺486.9726，found 486.9733.

实施例21 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-甲基-N-苯基)-酰胺(化合物12k)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.25mmol)与2.5mL二氯亚砜加热回流7h， 减压蒸除溶剂，向混合物中加入4mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加N-甲基苯胺(1.00mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得产物93mg，黄色固体，产率74％，熔点122-125℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：3.48(s，3H，NCH₃)，4.39(s，2H，SCH₂-aryl)，7.12-7.25(m，5H，ArH)，7.50-7.66(dd，4H，J＝8Hz，J＝62Hz，ArH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：166.01(C＝O)，163.80(C＝O)，161.63(C₂)，160.52(C₆)，141.41(aryl)，132.49(aryl)，129.87(aryl)，129.12(aryl)，128.23(aryl)，126.48(aryl)，118.41(CN)，111.83(aryl)，81.81(C5)，36.75(SCH₂-aryl)，34.57(NCH₃)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₀H₁₄N₄O₂SI[M-H]⁺500.9882，found 500.9876.

实施例22 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-3，5二甲基苯基)-酰胺(化合物12l)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.24mmol)与5mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加3，5-二甲基苯胺(0.96mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。后处理进行减压柱色谱分离，洗脱剂二氯甲烷/甲醇体系，得粗产物。将粗产物溶于0.1mol/L氢氧化钠溶液，抽滤除去不溶物，母液加入浓盐酸酸化，抽滤，得到白色固体，为产物50mg，产率40％，熔点231-233℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：2.27(s，6H，CH₃)，4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，6.78(s，1H，ArH)，7.29(s，2H，ArH)，7.60-7.73(dd，4H，J＝8Hz，J＝49.2Hz，ArH)，10.41(s，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：164.33(C＝O)，143.76(aryl)，138.68(aryl)，138.45(aryl)，132.71(aryl)，130.62(aryl)，126.15(aryl)，119.18(CN)，117.81(aryl)，110.51(aryl)，33.85(SCH₂-aryl)，21.56(CH₃)；HRMS(m/z)：calcd for C₂₁H₁₆N₄O₂SI[M-H]⁺515.0039，found 515.0046.

实施例23 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(3，5-二氟苯基))-酰胺(化合物12m)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.36mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加3，5-二氟苯胺(0.54mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物114mg，白色固体，产率60％，熔点231-233℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，7.02-7.07(m，1H，ArH)，7.41-7.44(m，2H，ArH)，7.60-7.74(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝57.2Hz，ArH)，10.99(s，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：164.59(C＝O)，161.70(C＝O)，143.80(aryl)，141.24(aryl)，132.71(aryl)，130.60(aryl)，119.14(CN)，110.51(aryl)，103.04(aryl)，33.92(SCH₂-aryl)；m/z(ESI)：523[M-H]^-.

实施例24 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(3，4，5-三甲氧基苯基))-酰胺(化合物12n)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.36mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加3，4，5-三甲氧基苯胺(0.54mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物153mg，黄色固体，产率74％，熔点261-262℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：3.65(s，3H，OCH₃)，3.78(s，6H，OCH₃)，4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，7.08(s，2H，ArH)，7.60-7.73(dd，4H，J＝8Hz，J＝52.4Hz，ArH)，10.42(s，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：164.29(C＝O)，153.36(aryl)，143.82(aryl)，135.06(aryl)，134.60(aryl)，132.70(aryl)，130.63(aryl)，119.17(CN)，110.50(aryl)，97.76(aryl)，60.62(OCH₃)，56.27(OCH₃)，33.87(SCH₂-aryl)；m/z(ESI)：577[M-H]^-.

实施例25 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(4-氯苯基))-酰胺(化合物12o)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.38mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加4-氯苯胺(0.57mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物136mg，白色固体，产率69％，熔点255-257℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，7.45-7.60(dd，4H，J＝8Hz，J＝59.6Hz，ArH)，7.70-7.75(m，4H，ArH)，10.71(s，1H，NH)，13.45(m，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：164.55(C＝O)，143.85(aryl)，137.81(aryl)，132.69(aryl)，130.60(aryl)，129.43(aryl)，128.27(aryl)，121.76(aryl)，119.20(CN)，110.59(aryl)，34.08(SCH₂-aryl)；m/z(ESI)：521[M-H]^-.

实施例26 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(4-硝基苯基))-酰胺(化合物12p)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.38mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入6mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加4-硝基苯胺(0.57mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。后处理抽滤，得到产物48mg，黄色固体，产率23％，熔点265-266℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.49(s，2H，SCH₂-aryl)，7.60-7.74(dd，4H，J＝8Hz，J＝56.8Hz，ArH)，7.94-8.31(dd，4H，J＝9.2Hz，J＝147.2Hz，ArH)，11.18(s，1H，NH)，13.50(m，1H，NH)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：165.07(C＝O)，144.84(aryl)，143.72(aryl)，143.49(aryl)，132.72(aryl)，130.63(aryl)，125.63(aryl)，120.01(aryl)，119.16(CN)，110.54(aryl)，33.89(SCH₂-aryl)；m/z(ESI)：532[M-H]^-.

实施例27 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-(2-吡啶基))-酰胺(化合物12q)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.24mmol)与4mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入6mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加2-氨基吡啶(0.96mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物19mg，白色固体，产率16％，熔点228-230℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，7.21(t，1H，ArH)，7.62-7.73(dd，4H，J＝8Hz，J＝46Hz，ArH)，7.88(t，1H，ArH)，8.15(d，1H，J＝7.6Hz，ArH)，8.40(m，1H，ArH)；¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)δ：151.70(aryl)，148.84(aryl)，143.67(aryl)，138.96(aryl)，132.76(aryl)，130.62(aryl)，120.81(aryl)，119.18(CN)，114.54(aryl)，110.54(aryl)，33.85(SCH₂-aryl)m/z(ESI)：488[M-H]^-.

实施例28 2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-(N-1-(3-氨基-1，2，4-三氮唑))-酰胺(化合物12r)

将2-(4-氰基苄硫基)-5-碘尿嘧啶-6-羧酸11(0.24mmol)与3mL二氯亚砜加热回流7小时，减压蒸除溶剂，向混合物中加入5mL重蒸过的二氯甲烷，0℃下滴加3-氨基-1，2，4-三氮唑(0.36mmol)和1mL三乙胺，冰浴搅拌反应约10小时，TLC检测反应完全。粗产物进行减压柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系，得到产物22mg，白色固体，产率19％，熔点231-233℃。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：4.48(s，2H，SCH₂-aryl)，7.02-7.07(m，1H，ArH)，7.41-7.44(m，2H，ArH)，7.60-7.74(dd，4H，J＝8.4Hz，J＝57.2Hz，ArH)，10.99(s，1H，NH)；¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)δ：164.59(C＝O)，161.70(C＝O)，143.80(aryl)，141.24(aryl)，132.71(aryl)，130.60 (aryl)，119.14(CN)，110.51(aryl)，103.04(aryl)，33.92(SCH₂-aryl)m/z(ESI)：478[M-H]^-.

实施例29对所合成2-芳基硫代-5-卤代嘧啶酮类衍生物进行体外抗乙肝病毒生物活性评价

1.实验原理：

目前乙肝药物的评价主要参考HBsAg和HBeAg等临床指标及DNA的拷贝数。但在病毒分泌到细胞外的颗粒中，仅Dane颗粒含有完整的病毒基因组，具有感染能力，约占10％，绝大多数为管状或小球形颗粒，不具有感染能力。鉴于设计的抑制剂针对病毒的复制环节，HBsAg和HBeAg等指标不能很好的反应病毒的复制水平，因而选择HBV DNA的拷贝数作为初步筛选评价参考。通过对阳性药拉米夫定的胞内外DNA抑制情况对比试验发现，拉米夫定对胞内外DNA均有明显抑制作用，且趋势一致，由于胞外DNA水平可以反映HBV的感染能力，故选择胞外DNA(即上清中DNA的含量)作为最终参考指标。

HepG2.2.15和HepAD38两种细胞系都是用于评价乙肝药物常用的细胞模型，其中HepG2.2.15细胞系为经典模型，HepAD38细胞模型与HepG2.2.15相比，HepAD38细胞系是由四环素敏感的CMV-IE启动子稳定表达HBV病毒，其表达HBV DNA的拷贝数大约是HepG2.2.15的11倍，HepAD38细胞系适合用更少的细胞进行更大规模的化合物活性评价，通常可以在96孔板中进行，因此在本发明中选择以HepAD38细胞系测定化合物的EC₅₀和CC₅₀值，实验结果表明化合物在两种细胞系中对乙肝病毒抑制趋势基本保持一致。

2.实验方法：

a.化合物抗乙肝病毒活性测试实验

(1)细胞铺板(第一天)。将HepAD38细胞分别铺至48孔板(1×10⁵细胞/孔)，分别设置阴性对照孔(只加溶剂不加药物)、阳性对照孔(已知的抗病毒药物如拉米夫定等)和实验孔(筛选药物0.1μM、1μM、5μM、10μM、25μM共5个浓度)，各设置3个复孔。置于37℃培养箱培养过夜。

(2)加药(第二天)。按照阴性对照孔、阳性对照孔和实验孔分别加入不同的试剂或药物。混匀，置于37℃培养箱培养48小时。

(3)换液(第四天)。弃掉培养基，用PBS洗1次，加入新鲜培养基同时按照第2步加药。混匀，置于37℃培养箱培养72小时。

(4)收集细胞培养上清(第七天)。收集细胞培养上清至1.5mL EP管中，-20℃保存。

(5)细胞培养上清中HBV DNA定量检测(荧光定量PCR)。

b.化合物细胞毒性试验

(1)细胞铺板(第1天)。将HepAD38细胞铺至96孔板中间的60孔内(1×10⁵cell/孔)，分别设置阴性对照孔(只加溶剂不加药物)、和实验孔(50μM，100μM，200μM)，各设置3个复孔。置于37℃培养箱培养。

(2)加药(第2天)。用含G418的培养基配制药物，按照阴性对照孔和实验孔分别加入不同的试剂或药物。混匀，置于37℃培养箱培养48小时。

(3)换液(第4天)。弃掉培养基，用PBS洗1-2次，加入与第2步相同的加药的新鲜培养基。混匀，置于37℃培养箱培养72小时。

(4)细胞毒MTT实验。弃去上清，向96孔板中加入MTT，培养4小时后，离心20分钟，去掉培养基，加入DMSO溶解形成的甲環颗粒，混匀后用酶标仪测OD_570/630吸收值。根据OD值计算出样品药物对HepAD38细胞的毒性作用以及影响细胞生长的状况，最后计算出导致半数细胞死亡量所需的浓度CC₅₀。

3.实验结果：

a.10μM浓度下化合物对胞外HBV DNA的抑制率；b.抑制率＜3％；c.未检测

a.半数细胞毒性浓度(采用HepAD38细胞)；b.半数有效浓度；c.治疗指数＝CC₅₀/EC₅₀；d.无法计算

4.结果分析

从实验结果中可以看出，通式I类化合物能对乙肝病毒产生良好的抑制作用，且绝大多数化合物的细胞毒性很低，从而使得合成的新化合物具有较高的治疗指数，表现出了良好的抗乙肝病毒活性。