1.一种实时荧光解旋酶依赖扩增方法,其特征在于:
解旋酶依赖扩增的一侧引物5’端锚定有一发卡结构,该发卡结构端部标记有在解旋酶依赖扩增反应过程中实时检测产物浓度的荧光物质。
2.如权利要求1所述的实时荧光解旋酶依赖扩增方法,其特征在于:所述的发卡结构的5’末端和3’末端互补配对;所述的发卡结构的5’末端和3’末端不与靶标序列互补配对;所述的发卡结构除5’末端和3’末端的序列与所锚定引物延伸后产生的新链互补配对。
3.如权利要求1所述的实时荧光解旋酶依赖扩增方法,其特征在于:所述发卡结构的5’末端标记了发光基团,3’末端标记了淬灭基团;或者,所述发卡结构的3’末端标记了发光基团,5’末端标记了淬灭基团。
4.如权利要求3所述的实时荧光解旋酶依赖扩增方法,其特征在于:发光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一种,所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种。
5.如权利要求1所述的实时荧光解旋酶依赖扩增方法,其特征在于:该解旋酶依赖扩增方法中所用解旋酶为耐热的解旋酶。
6.如权利要求1所述的实时荧光解旋酶依赖扩增方法,其特征在于,该解旋酶依赖扩增方法中所用的解旋酶和DNA聚合酶的选用包含如下选择中的至少一种:
(a)解旋酶为水生栖热菌来源的UvrD
(b)DNA聚合酶为Klentaq DNA聚合酶,或Bst DNA聚合酶大片段,或PyroPhage聚合酶,或DisplaceAce聚合酶,或Vent(exo-)聚合酶。
7.一种用于DNA模板扩增的实时荧光解旋酶依赖扩增体系,其包含:5’端锚定了发卡结构的单侧引物,和另一侧引物;该发卡结构端部标记有在解旋酶 依赖扩增反应过程中实时检测产物浓度的荧光物质。
8.如权利要求7所述的实时荧光解旋酶依赖扩增体系,还包含:
解旋酶,
ATP,
DNA聚合酶,
dATP,dTTP,dGTP,dCTP,
Tris,
硫酸镁和/或氯化镁,
氯化钠和/或氯化钾。
9.一种用于RNA模板扩增的实时荧光解旋酶依赖扩增体系,其包含:5’端锚定了发卡结构的单侧引物,和另一侧引物;该发卡结构端部标记有在解旋酶依赖扩增反应过程中实时检测产物浓度的荧光物质。
10.根据权利要求9,其中还包含:
解旋酶,
ATP,
DNA聚合酶,
逆转录酶,
dATP,dTTP,dGTP,dCTP,
Tris,
硫酸镁和/或氯化镁,
氯化钠和/或氯化钾。