一种驯化后的CHO-S细胞系及其培养方法与应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种驯化后的CHO-S细胞系及其培养方法与应用。

背景技术：

随着基因工程技术的不断发展，重组生物技术药物获得急剧发展，多种真核和原核蛋白质表达系统用于表达具有治疗价值的蛋白质。在这些表达系统中，哺乳动物细胞表达系统由于其表达蛋白在分子结构、翻译后修饰和生物学功能等方面与天然分子一致性较高，因而哺乳动物细胞已成为一些药用蛋白质重组表达的首选系统。

自CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢)细胞成功分离后，经过几十年大量基础研究工作后，目前已发展成为最重要的治疗蛋白质表达体系，当前70％以上的蛋白类药物为该系统所表达，这些产品成功的广泛应用，不仅提高了人们的生活质量，也给社会带来巨大的经济效益。

虽然经过多年发展，我国在蛋白重组表达方面技术水平有了显著的提高，但是仍然缺少自主的核心技术，大多数企业或科研机构等所用细胞株和培养基均为商业化产品，这些商业化产品不仅会显著的提高未来产品生产成本，也给规模化带来很大的风险。所以，开发出现有CHO细胞株的新细胞培养体系及其大规模驯化培养方法，将其成功应用于蛋白质表达，对提升上游技术水平具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种驯化后的CHO-S细胞系及其培养方法与应用。

术语说明：

完全培养基：指培养基含有各种营养成份，能满足动物细胞生长需要。各种营养抱括盐分，氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质，微量元素，脂类，或生长因子。

新鲜培养基：未经过细胞培养且在保质期内的完全培养基。

细胞对数生长期：指细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而快速生长的时期，此时期营养充足，细胞会以对数生长，N为细胞的分裂次数，细胞以2的N次方的速度生长(假如原来只有一个细胞，进入对数期以后就会变为两个，两个再变为四个)。

细胞活力％：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中 活细胞所占的百分比叫细胞活力。

技术方案：

本发明的目的之一是提供一种驯化后的CHO-S细胞系，技术方案如下：

一种驯化后的CHO-S细胞系，其特征在于，所述驯化后的CHO-S细胞系为CHO-S细胞经XH001培养基采用逐渐驯化的方法传代至少5代获得；

所述XH001培养基，由以下成分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)5-7g/L，葡萄糖3-8g/L，丙酮酸钠0.05-0.4g/L，氯化钠3-5g/L，氯化钾0.2-0.4g/L，亚硒酸钠0.0000005-0.000060g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，乙醇胺5-25μg/L，柠檬酸铁1-10mg/L，硫酸锌0.1-0.5g/L，硫酸铜0.02-0.15g/L，谷胱甘肽0.05-0.3g/L，氯化镁0.025-0.15g/L，磷酸二氢钠0.1-0.3g/L，碳酸氢钠1-5g/L，丙氨酸0.015-0.035g/L，天冬酰胺0.01-0.035g/L，精氨酸0.06-0.30g/L，天冬氨酸0.02-0.2g/L，胱氨酸0.3-0.5g/L，半胱氨酸0.05-0.2g/L，谷氨酸0.001-0.09g/L，甘氨酸0-0.04g/L，组氨酸0.03-0.2g/L，异亮氨酸0.05-0.25g/L，亮氨酸0.05-0.25g/L，赖氨酸0.02-0.25g/L，甲硫氨酸0.02-0.2g/L，苯丙氨酸0.055-0.075g/L，脯氨酸0.01-0.05g/L，丝氨酸0.03-0.25g/L，苏氨酸0.07-0.15g/L，色氨酸0.005-0.025g/L，酪氨酸0.05-0.2g/L，缬氨酸0.05-0.5g/L，生物素0.005-0.15mg/L，泛酸钙0.002-0.006g/L，氯化胆碱0.002-0.09g/L，叶酸0.002-0.006g/L，肌醇0.005-0.02g/L，烟酰胺0.002-0.006g/L，维生素B60.002-0.006g/L，维生素B20.0002-0.0006g/L，维生素B10.002-0.006g/L，维生素B120.000005-0.000025g/L，亚油酸0.001-0.1g/L，嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)0.2-5g/L。

本发明的目的之二是提供一种驯化CHO-S细胞系的方法，技术方案如下：

一种驯化CHO-S细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将CHO-S细胞在常规的基础培养基中进行摇瓶培养；

(2)将步骤(1)中生长稳定的CHO-S细胞接种至XH001培养基中悬浮生长；

(3)将步骤(2)中的CHO-S细胞采用逐渐驯化的方法，经过至少5代传代，得到驯化后的CHO-S细胞系；

优选地，还包括将步骤(3)驯化后的CHO-S细胞系在XH001培养基中扩培，待细胞长到处于对数生长期时，建立CHO-S细胞库的步骤。建立细胞库的方法可以采用现有技术中的常规方法。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的基础培养基为CD FortiCHO培养基。

根据本发明优选的，所述步骤(1)的具体操作方法为：将从液氮罐中取出的CHO-S细胞株，在37℃水浴中复融，待细胞融化后置于事先预热好的基础培养基中，控制接种密度在0.5～1.0×10⁶细胞/mL，于37℃、85％湿度、5％CO₂、110-150rpm摇床中进行摇瓶培养。

根据本发明优选的，所述步骤(2)的具体操作方法为：选取步骤(1)中处于对数生长期的CHO-S细胞株以0.5×10⁶细胞/mL密度接种于XH001培养基中，125mL培养瓶进行培养。

根据本发明优选的，所述步骤(3)的具体操作方法为：待步骤(2)中摇瓶培养的细胞密度>2×10⁶细胞/mL密度，再以0.5×10⁶细胞/mL密度接种于XH001培养基中，在125mL培养瓶进行培养，重复上述步骤，经过5次以上传代后，获得生长稳定的驯化后的CHO-S细胞系。

优选地，一种驯化CHO-S细胞系的方法，步骤如下：

(1)将从液氮罐中取出的CHO-S细胞株，在37℃水浴中复融，待细胞融化后置于37℃预热的基础培养基中，控制接种密度在0.5～1.0×10⁶细胞/mL，于37℃，85％湿度，5％CO₂，110-150rpm摇床中进行摇瓶培养，所述基础培养基为含有Anti-Clumping Agent和Glutamine的CD Forti CHO培养基；

(2)选取步骤(1)中处于对数生长期的CHO-S细胞株以0.5×10⁶细胞/mL密度接种于XH001培养基中，进行悬浮培养；

(3)待细胞密度>2×10⁶细胞/mL密度，再以0.5×10⁶细胞/mL密度接种于XH001培养基中，在125mL培养瓶进行培养，如此采用逐渐稀释的方法将适应CD FortiCHO培养基生长细胞驯化至XH001培养基中生长，经过5次传代后，获得生长稳定的驯化后的CHO-S细胞系；

(4)将步骤(3)生长稳定的驯化后的CHO-S细胞株扩培至150mL步骤(2)所述的XH001培养基中，于500mL细胞培养瓶中培养，通过CountStar细胞计数仪统计细胞数和存活率，待细胞数达到3～4×10⁶细胞/mL，活力>95％时，即细胞正处于对数生长期时，建立细胞库。

本发明的目的之三是提供上述驯化后的CHO-S细胞系在表达抗体中的应用，技术方案如下：

上述驯化后的CHO-S细胞系在抗体表达中的应用。

根据本发明优选的，所述的应用，步骤如下

(1)单克隆抗体重组表达质粒的构建；

(2)取驯化后的CHO-S细胞系在XH001培养基中进行摇瓶培养；

(3)转染前24小时，对细胞进行接种，接种密度为：0.5～0.8×10⁶细胞/mL，培养条件为37℃，5％CO₂，110～150rpm悬浮培养；

转染前由培养摇床中取出细胞，1000rpm，离心3min，收集细胞，弃上清，用37℃预热后的XH001培养基制备密度为1×10⁷细胞/mL的细胞悬液；取800μL细胞悬液至1.5mL离心管中，然后将40μg重组质粒加到800μL细胞悬液中，充分混合，将质粒-细胞混合物加到电转杯中，在电转仪上设置输出电压值，电击次数1次，时间17ms，电击杯4mm，启动电击；

(4)转染后的细胞，经过浓度为10到100nM MTX和0.5到1μM MTX两个阶段摇瓶加压筛选后，在两个阶段细胞恢复后，分别测定重组抗体表达量，并进行产抗体发酵培养。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的重组质粒的构建中，选用表达质粒pCHO 1.0作为载体质粒。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中产抗体发酵培养的培养基为XH001培养基，培养条件为37℃，5％CO₂，110-150rpm悬浮培养。

有益效果

本发明首次发现采用XH001培养基驯化培养CHO-S细胞后，驯化后的CHO-S细胞株具有生长速度快、倍增时间短、细胞形态良好、形状均一等特点，在用于重组抗体的表达时可以显著提高表达量，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1本发明实施例1培养的驯化后的CHO-S细胞的生长情况照片；

图2商业化CHO-S细胞的生长情况照片；

图3本发明实施例2培养的CHO-S细胞与商业化CHO-S细胞的生长曲线对比图；

图4本发明实施例4驯化后的CHO-S细胞与商业化CHO-S细胞在第一阶段加压筛选后细胞生长曲线对比图；

图5本发明实施例4驯化后的CHO-S细胞与商业化CHO-S细胞在第一阶段加压筛选后抗体表达量曲线对比图；

图6本发明实施例4驯化后的CHO-S细胞与商业化CHO-S细胞在第二阶段加压筛选后细胞生长曲线对比图；

图7本发明实施例4驯化后的CHO-S细胞与商业化CHO-S细胞在第二阶段加压筛选后抗体表达量曲线对比图。

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中所使用的基础培养基和CHO细胞可市购获得：

CHO-S细胞：购自Life Technology公司。

CD FortiCHO培养基：是一种商品化的基础培养基的名称，购自Life Technology公司。

Anti-Clumping Agent：抗结团剂，购自Gibco公司。

L-Glutamine：谷氨酸盐，购自Gibco公司。

MTX：甲氨蝶呤，购自Sigma公司。

培养基中其他组分均为本领域普通市售产品。

CountStar细胞计数仪：艾力特国际贸易有限公司。

电转仪：型号Gene Pulser Xcell^TM，Bio-Rad Laboratories。

实施例1本发明所述驯化后的CHO-S细胞系的制备：

(1)向CD FortiCHO培养基中加入Anti-Clumping Agent(体积比0.1～1％)，L-Glutamine(0.8～8mM)，并在37℃条件下预热约30min；将CHO-S细胞株从液氮中取出，迅速放入37℃水浴快速解冻，并于超净台中加入到事先预热好的CD FortiCHO培养基中，CountStar细胞计数仪进行计数，接种密度控制在0.5～1.0×10⁶细胞/mL，于37℃，85％湿度，5％CO₂，110-150rpm摇床中进行摇瓶培养；

(2)CHO-S细胞株在CD Forti CHO培养基中生长稳定后，选取在CD FortiCHO培养基中恢复较好的处于对数生长期的细胞株，以0.5×10⁶细胞/mL密度接种于XH001培养基中，125mL培养瓶进行培养；

(3)待细胞密度>2×10⁶细胞/mL密度，再以0.5×10⁶细胞/mL密度接种于XH001培养基中，在125mL培养瓶进行培养，如此采用逐渐稀释的方法将适应CD FortiCHO培养基生长细胞驯化至XH001培养基中生长，经过5次传代后，获得生长稳定的驯化后的CHO-S细胞系，生长稳定的细胞生长情况如图1所示；

所述XH001培养基的具体组成为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)5g/L，葡萄糖8g/L，丙酮酸钠0.2g/L，氯化钠3g/L，氯化钾0.4g/L，亚硒酸钠0.000005g/L，硫酸锰0.05g/L，乙醇胺10μg/L，柠檬酸铁5mg/L，硫酸锌0.1g/L，硫酸铜0.02g/L，谷胱甘肽0.05g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，碳酸氢钠2.1g/L，丙氨酸0.015g/L，天冬酰胺0.035g/L，精氨酸0.25g/L，天冬氨酸0.2g/L，胱氨酸0.41g/L，半胱氨酸0.11g/L，谷氨酸0.08g/L，甘氨酸0.01g/L，组氨酸0.15g/L，异亮氨酸0.25g/L，亮氨酸0.25g/L，赖氨酸0.2g/L，甲硫氨酸0.11g/L，苯丙氨酸0.065g/L，脯氨酸0.045g/L，丝氨酸0.2g/L，苏氨酸0.15g/L，色氨酸0.02g/L，酪氨酸0.2g/L，缬氨酸0.33g/L，生物素0.006mg/L，泛酸钙0.0023g/L，氯化胆碱0.061g/L， 叶酸0.003g/L，肌醇0.015g/L，烟酰胺0.003g/L，维生素B60.0023g/L，维生素B20.0002-0.0006g/L，维生素B10.002-0.006g/L，维生素B120.000009g/L，亚油酸0.001g/L，嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)1.02g/L。

(4)取驯化后的CHO-S细胞株扩培至150mL XH001培养基中，于500mL细胞培养瓶中培养，通过CountStar细胞计数仪统计细胞数和存活率，待细胞数达到3～4×10⁶细胞/mL，活力大于95％时，即细胞正处于对数生长期，开始准备建库；

将10mL DMSO加入到45mL新鲜培养基(XH001培养基)中，混匀后将培养基放在冰上或4℃冷冻制成冷冻培养基；于生物安全柜(或超净工作台)中取步骤(3)驯化后的CHO-S细胞系经离心，取45mL细胞离心后的上清液转移至55mL冷冻培养基的无菌容器内充分混匀。取上述处于对数生长期的细胞，以1000rpm，4℃离心10min；将由10％DMSO+45％新鲜培养基+45％细胞培养上清液配置成的冻存用培养基充分混匀加入离心管中，使细胞密度达到10～20×10⁶细胞/mL，轻轻用手指敲打(或用移液枪吹打)，以混匀细胞。取1mL分装于冻存管中密封保存，并做好标记，将冻存管转移至冻存盒内，待冻存盒装满后，转移至4℃冰箱放置2～3h，然后-20℃放置2～3h，-80℃过夜放置，最后在液氮罐中长期保存。

对照例1商业化CHO-S细胞系的制备

将实施例1步骤(2)-(4)中所述的XH001培养基换为CD FortiCHO培养基，其余步骤及条件均与实施例1相同。对照例1中的细胞生长情况如图2所示。

实施例2：本发明CHO-S细胞与商业化CHO-S细胞生长情况对比试验

将实施例1步骤(2)得到的驯化好的细胞在实施例1所述的XH001培养基中生长稳定后，以0.5×10⁶细胞/mL细胞密度分别接种于实施例1所述的XH001培养基中进行批次培养研究，同时以CD Fort iCHO培养基作为对照，每24h使用CountStar细胞计数仪进行细胞数和活率的统计，细胞生长曲线图如图3所示。

实施例3：本发明CHO-S细胞株在XH001培养基中的稳定性评估

CHO-S细胞株在实施例1所述的XH001培养基中，每24h使用CountStar细胞计数仪统计细胞数和存活率，每3天按照0.5×10⁶细胞/mL密度进行传代。经过约23代的生长稳定性评估，细胞的生长稳定，倍增时间约为15h，表明CHO-S细胞适应XH001培养基的营养环境，且生长良好。

实施例4重组抗VEGFR2抗体的表达方法

(1)单克隆抗体重组质粒的构建

由基因合成公司直接合成抗体全序列(参考文献：WO03075840A2，WHO Drug Information Vol 23,No.3,2009)，根据Life Technology公司Freedom CHO-S Kit试剂盒说明书，将重链、轻链基因克隆至表达质粒pCHO 1.0中，经过测序验证正确后，利用质粒中提试剂盒NucleoBond Xtra Midi(购自Macherey-Nagel公司，货号：740410.50)抽提质粒，利用Denovix DS-11微量紫外核酸检测仪进行定量，-80℃储存备用。

重组质粒具体构建过程如下：合成抗VEGFR2单抗重链和轻链DNA序列，5’和3’端分别含有EcoRV/PacI和AvrII/BstZ171酶切位点。利用限制性内切酶EcoRV/PacI双酶切抗VEGFR2单抗重链基因序列，进行回收。将重链基因克隆至经限制性内切酶EcoRV/PacI双酶切的真核表达载体pCHO 1.0上，构建含重链重组质粒，记为pCHO 1.0-H。利用限制性内切酶AvrII/BstZ171双酶切抗VEGFR2单抗轻链基因序列，进行回收，再克隆至经限制性内切酶AvrII/BstZ171双酶切的真核表达载体pCHO 1.0-H上，构建含重链、轻链重组质粒，记为pCHO 1.0-H-L。对构建的重组质粒进行测序验证，测序正确后进行中提、定量，备用。

(2)细胞复苏及摇瓶培养：

向XH001培养基中加入Anti-Clumping Agent(体积比0.1～1％)，L-Glutamine(0.8～8mM)，并在37℃条件下预热约30min；将本发明CHO-S细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴快速解冻，并于超净台中加入到事先37℃预热好的XH001培养基中，CountStar细胞计数仪进行计数，接种密度控制在0.5～1.0×10⁶细胞/mL，于37℃，85％湿度，5％CO₂，110-150rpm摇床中进行摇瓶培养；

(3)细胞转染

转染前24小时，对细胞进行接种，接种密度为：0.5～0.6×10⁶细胞/mL，培养条件为37℃，5％CO₂，110-150rpm悬浮培养。转染前由培养箱中取出细胞，1000rpm，离心3min，收集细胞，弃上清，用37℃预热的XH001培养基制备密度为1×10⁷细胞/mL的细胞悬液。取800μL细胞悬液至1.5mL离心管中，将40μg质粒加到800μL细胞悬液中，充分混合，将质粒-细胞混合物加到电转杯中。在电转仪上设置输出电压值，电击次数1次，时间17ms，电击杯4mm，启动电击。

(4)细胞株加压筛选

电击48小时后，在T75瓶中对细胞库施加筛选压力，MTX浓度为10-100nM，期间每隔4-5天计数，并对细胞更换含相同MTX浓度的XH001培养基，细胞库在一周后活力降到最低20％，经过一周的低活力阶段，细胞恢复，第一阶段加压筛选细胞库恢复共计20天。取恢复的第一阶段加压筛选的细胞库计数，将细胞库按照3×10⁵细胞/mL的密度接种125mL摇瓶中，接种体积20mL，进行批培养研究，第8天取样检测表达量。

细胞库适应第一阶段加压筛选后，将细胞库在125mL摇瓶中进一步将筛选压力MTX浓度提高至0.5-1μM，每4-5天计数，并对细胞更换含相同MTX浓度的XH001培养基，细胞库在一周后活力降到最低。经过一周的低活力阶段，细胞恢复，第二阶段加压筛选细胞库恢复共计20天。取第二阶段加压筛选恢复的细胞库计数，将细胞库按照0.3×10⁶细胞/mL的密度接种摇瓶，接种体积20mL，进行批培养研究，第8天取样检测表达量。

对照例4重组抗VEGFR2抗体的表达方法

将XH001培养基换为CD FortiCHO培养基，其余步骤及条件均与实施例4相同。

实施例4与对照例4的CHO-S细胞在第一阶段加压筛选后细胞生长情况对比图如图4所示；

实施例4与对照例4的CHO-S细胞在第一阶段加压筛选后抗体表达量对比图如图5所示；

实施例4与对照例4的CHO-S细胞在第二阶段加压筛选后细胞生长情况对比图如图6所示；

实施例4与对照例4的CHO-S细胞在第二阶段加压筛选后抗体表达量对比图如图7所示。

结果分析

由图5和图7的结果可以看出，采用XH001培养基驯化后的CHO-S细胞系在用于重组抗体的表达时，较CD FortiCHO培养基驯化的CHO-S细胞系表达量显著提高，特别是在第二阶段加压筛选后，表达量提高幅度尤为显著。