本发明属于植物基因工程
技术领域：
：，是一种以高粱幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法。
背景技术：
：：甜高粱是籽实高粱的一个变种，它的生长过程中需水量较低，仅为玉米的1/3，并且耐贫瘠耐盐碱，且亩产可达3～5吨粮食，同时它的茎秆中的汁液含有丰富的糖类，是制造酒精的理想生物质原料。因此甜高粱是一种优秀的生物新能源作物，值得我们大力去发展。但是甜高粱产业的发展与突破关键在于新种质的选育与栽培。过去的几十年传统常规育种在甜高粱品质改良，产量提高等方面已经做了重要的贡献，但由于高粱的远源不亲和性，只靠传统的常规育种方法难以取得重大突破，需要与遗传转化技术结合。利用遗传转化技术进行高粱品种的遗传改良早已引起广泛的关注与研究。一个高效的遗传转化体系最主要的是赖于高效的再生体系，但是，离体组织培养进行高粱再生是一个公认的比较困难的过程(ZhuH,MuthukrishnanS,KrishnaveniS,JeoungJ,LiangG(1998)Biolistictransformationofsorghumusingaricechitinasegene.J.Genet.Breed.52,243-252)，特别是对甜高粱组织培养的研究更少。大量的关于高粱遗传转化的研究也已经进行。电击法是第一个成功地将氯霉素乙酰转移酶基因转入高粱原生质体的方法(OU-LeeTM,TurgeonR,WuR(1986)Expressionofaforeigngenelinkedtoeitheraplant-virusoraDrosophilapromoter,afterelectroporationofprotoplastsofrice,wheat,andsorghumProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,6815-6819)。接着新霉素磷酸转移酶和β-葡萄糖醛酸酶基因通过电击法被转入高粱基因组，但没有获得转化单株(BatrrawM,HallT(1991)StabletransformationofSorghumbicolorprotoplastswithchimericneomycinphosphotransfereaseIIandβ-glucuronidasegenes.Theor.Appl.Genet.82,161-168.)。Casas在1993年首次用粒子轰击法获得高粱转基因植株，他以高粱栽培品种p898012的幼胚盾片作为外植体，获得转化R和C1玉米花青素调控基因的转化植株，转化效率达0.33％(CasasA,KononowiczA,ZehrU,TomesD,AxtellJ,ButlerL,BressanR,HasegawaP(1993)Transgenicsorghumplantsviamicroprojectilebombardment.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,11212-11216.)。虽然电击法和粒子轰击法是将外源基因直接转化进植物细胞，然而农杆菌介导的转化方法仍然是最主要的植物转化方法，主要是因为较高的转化效率以及较低的拷贝数或者单拷贝。但是高粱对体外组织培养和遗传转化有拮抗作用，最近在高粱遗传转化的研究 中一直倾向于对再生体系和效率(JeoungJS,KrishnaveniS,MuthukrishnanH,GLT(2002)Optimizationofsorghumtransformationparametersusinggenesforgreenfluorescentproteinandβ-glucuronidaseasvisualmarkers.Hereditas137,20-28.；GirijashankarV,SwathisreeV(2009)GenetictransformationofSorghumbicolor.Physiol.Mol.Biol.Plants15,287-302.；RaghuwanshiA,BirchRG(2010)Genetictransformationofsweetsorghum.PlantCellRep.29,997-1005.；LiuG,GodwinID(2012)Highlyefficientsorghumtransformation.PlantCellRep.31,999-1007.)以及转化程序和方法的优化上(JiQ,XuX,WangK(2013)Genetictransformationofmajorcerealcrops.Int.J.Dev.Biol.57,495-508.；KumarT,HoweA,SatoS,DweikatI,ClementeT(2013)Sorghumtransformation:overviewandutility.PlantGenet.Genomics11,205-221.；HieiY,IshidaY,KomariT(2014)Progressofcerealtransformationtechnologymediatedby.Front.PlantSci.5,628-638.)。2000年，Zhao等首次用农杆菌介导的方法获得了高粱转基因植株；利用p898012及PH1391两个基因型的幼胚作为外植体，BAR基因作为筛选标记，通过优化培养基成分、共培养条件以及筛选培养基的继代频率等，使得转化效率达到2.12％(ZhaoZY,CaiTS,TaglianiL,MillerM,WangN,PangH,RudertM,SherylSchroeder,HondredD,SeltzerJ,PierceD(2000)Agrobacterium-mediatedsorghumtransformation.PlantMol.Biol.44,789-798.)。随后很多研究人员开始着手农杆菌介导的高粱转化体系的研究工作(JeoungJS,KrishnaveniS,MuthukrishnanH,GLT(2002)Optimizationofsorghumtransformationparametersusinggenesforgreenfluorescentproteinandβ-glucuronidaseasvisualmarkers.Hereditas137,20-28.；CarvalhoCHS,ZehrUB,GunaratnaN,AndersonJ,KononowiczHH,HodgesTK,AxtellJD(2004)Agrobacterium-mediatedtransformationofsorghum:factorthataffecttransformationefficiency.Genet.Mol.Biol.27,259-269.；GaoZ,JayarajJ,MuthukrishnanS,ClaflinL,LiangGH(2005)EfficientgenetictransformationofSorghumusingavisualscreeningmarker.Genome48,321-333.GurelS,GurelE,KaurR,WongJ,MengL,TanHQ,LemauxPG(2009)Efficient,reproducibleAgrobacterium-mediatedtransformationofsorghumusingheattreatmentofimmatureembryos.PlantCellRep.28,429-444.WuE,LendertsB,GlassmanK,KaniewskaMB,ChristensenH,AsmusT,ZhenS,ChuU,ChoMJ,ZhaoZY(2013)OptimizedAgrobacterium-mediatedsorghumtransformationprotocolandmoleculardataoftransgenicsorghumplants.InVitroCell.Dev.Biol.:Plant50,9-18.)，转化效率也在不断提高，但高粱遗传转化技术相较于玉米、水稻等作物还不是很成熟，存在转化效率低，基因型依赖严重等问题；特别是对甜高粱遗传转化的研究，只有Raghuwanshi等用基因枪法转化甜高粱品种Ramada 获得成功，但转化效率只有0.09％(RaghuwanshiandBirch2010)。因此本研究的目的是建立一个高效的适宜甜高粱和籽实高粱的遗传转化体系，为高粱基因组学研究以及新品种培育等打下基础，将优良的农艺学性状通过生物技术手段引入高粱是非常重要的。技术实现要素：因此本发明的目的是建立一个适应性广，对多数基因型效率高的甜高粱和籽实高粱(特别是甜高粱品种)再生体系；同时在这个基础上建立一个效率较高的甜高粱和籽实高粱遗传转化体系。本发明提供一种农杆菌介导的以甜高粱和籽实高粱幼穗诱导的愈伤组织作为外植体的遗传转化方法，用于高粱新基因功能的研究以及新品种的培育。一种农杆菌介导的甜高粱和籽实高粱的遗传转化方法，包括如下顺序步骤：1)选取幼穗，旗叶期长约1.5～5cm幼穗；2)将幼穗置于诱导愈伤培养基中培养，所述诱导愈伤培养基CIM：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，高压灭菌前pH6.0；3)将幼穗诱导产生的胚性愈伤组织用农杆菌介导法将外源基因导入，所述农杆菌侵染培养基为IM：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+MES600mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS200μmol/L，pH5.2；4)外植体置于共培养基中共培养，所述共培养基COM：MS基础培养基4.43g/L+MES600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+琼脂8g/L+AS200μmol/L，高压灭菌前pH5.6；5)再转入筛选培养基上进行梯度筛选培养，所述筛选培养基为：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧苄青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+琼脂8g/L，高压灭菌前pH6.0，其中草丁膦的浓度为3和5mg/L梯度筛选；6)将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧苄青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+琼脂8g/L，高压灭菌前pH6.0；7)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：MS培养基+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧苄青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+琼脂5g/L，高压灭菌前pH6.0；8)转移至土壤中(营养土：蛭石＝2:1)中培养1～2周后移栽至温室花盆或大田。所述幼穗长度为2～5cm(此时植株外部形态，旗叶5～10cm，旗下一叶20cm左右)，切成3段左右。所述步骤3)导入为将愈伤浸泡于含有携带外源基因的植物表达载体农杆菌EHA105菌液中10分钟。所述共培养为在20～22℃下暗培养3～5天。所述筛选培养的方法为先在无筛选压的筛选培养基上避光恢复培养7天，再转入筛选剂浓度为3mg/L的筛选培养基上，进行两周低压筛选，再转入筛选剂浓度为5mg/L的筛选培养基上，进行两周筛选。所述分化培养基中的培养条件为：在周期为16小时光照与8小时黑暗循环于22～25℃条件下培养，每两周继代培养一次。所述步骤7)移入之前，高粱植株苗为3～4cm高，所述步骤8)转移之前，高粱植株壮根数3～5根，根长3cm。所述外源基因为GUS和GFP。所述甜高粱品种Keller，籽实高粱品种为JR105。本发明通过对诱导愈伤阶段培养基成分、分化阶段植物激素配比、不同基因型等因素对高粱组织培养的影响的研究，发现培养基中添加2,4-D2.0mg/L和CuSO4·5H2O0.25mg/L对于幼穗愈伤组织的诱导具有重要的作用，可以大幅度提高诱愈率；高粱再生培养基中最好的激素组合为1.0mg/LIAA+1.0mg/L6-BA，Keller和Mn-3025的再生效率达80％以上，说明这个激素组合在高粱离体再生方面非常适合；同时我们发现25个测试品种全部都能产生愈伤，并且有23个基因型再生出苗。其中以甜高粱品种Mn-3025和Keller以及籽实高粱品种871300和JR105愈伤诱导以及再生总体情况较好。本发明建立了适宜甜高粱和籽实高粱再生体系，以此再生体系为基础，建立了农杆菌介导的高粱遗传转化体系，并通过农杆菌介导法成功的将外源基因GUS和GFP转化幼穗诱导的愈伤组织，得到转基因再生植株，经检测表明，外源基因在不同的基因型中得到了不同程度的表达，说明本发明的再生体系可用于遗传转化。Keller遗传转化效率在3～7％之间，Mn-3025的转化效率在8～20％之间，JR105的转化效率在7～16％之间。本发明利用高梁幼穗为外植体在适当的再生培养基上，能得到较高的愈伤组织诱导率和 再生效率。但是，不同基因型来源的愈伤组织的胚性状况及再生能力差别较大。实验结果表明幼穗是建立高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。本发明通过优化转化条件，建立了一套农杆菌介导的适宜甜高粱和籽实高粱的遗传转化体系，为今后高粱新基因的功能研究以及培育高粱新品种奠定了基础。附图说明：图1不同种植环境对幼胚诱导愈伤效果的影响图中不同处理为每年7月初在大田或温室取3～5株植株的幼胚，混合后随机选取30枚进行愈伤诱导实验；每个实验重复3次。小写字母a、b和c表示在0.05水平上差异显著。图2不同生长调节剂及不同培养基添加剂对Keller幼穗诱导愈伤的影响A，表2中各组合诱导愈伤情况；a：组合1、6、7；b：组合2；c：组合3；d：组合4、5，标尺＝1厘米。B，不同状态愈伤组织的细胞状态；a，c：图A-a中箭头所指胚性愈伤组织的细胞状态，b，d：A-d中箭头所指褐化，水渍化愈伤的细胞状态；a，b是愈伤边缘成熟细胞，c，d是愈伤组织内部整体结构，标尺＝50微米。图3不同生长调节剂及不同培养基添加剂诱导出愈伤后对再生情况的影响X轴数字1～7对应于表1-2中7个组合。小写字母a、b、c和d表示在0.05水平上差异显著。图4不同生长调节剂诱导愈伤后再生情况1～3：利用2,4-D作为生长调节剂诱导的愈伤再生苗的情况；4～6：利用Dic作为生长调节剂诱导的愈伤再生苗的情况。标尺＝1厘米。图5不同生长调节剂诱导愈伤后再生苗单株高及株重差异每个处理取5株幼苗测量总重及株高，取其平均值，重复3次。小写字母a、b和大写字母A、B分别表示在0.05水平以及0.01水平上差异显著性。图6分化培养基中不同激素组合对三品种再生的影响同一品种内不同处理进行显著性检验；小写字母a、b和c表示在0.05水平上差异显著。图7分化培养基中不同PVP40浓度对Keller愈伤再生的影响A为再生培养皿底部图，B为愈伤再生过程中褐化情况图。a，未添加PVP40；b，添加1g/LPVP40；c，添加3g/LPVP40；d，添加5g/LPVP40；e，添加1g/LPVP40；f，添加10g/LPVP40。标尺＝1厘米。图8分化培养基中不同PVP40浓度对Keller愈伤再生效率的影响小写字母a和b表示不同处理在0.05水平上差异显著。图9不同基因型愈伤在继代培养基上不同的时间对再生效率的影响每个处理各选取同一时间诱导的愈伤组织10～15枚用于再生实验，计算再生效率；每个处理重复三次。大写字母A、B和C表示在0.01水平上极显著差异。图10pCambia3300-GUS/GFP双元载体T-DNA区结构示意图图11农杆菌介导的高粱遗传转化程序图12转基因植株bar基因PCR检测A，部分T0和T1代转基因植株bar基因PCR扩增结果；T0：M，markerIV；CK-，未转化植株；CK+，质粒；1～12，部分T0代转化单株。T1：M，marker100；CK-，未转化植株；CK+，质粒；1～12，部分T1代转化单株。B，部分T0代转基因植株bar基因RT-PCR分析；M，markerIV；CK-，未转化植株；CK+，质粒；1～8，部分T0代转化单株cDNAPCR扩增结果。bar(箭头所示)：bar基因的扩增；actin(箭头所示)：actin基因扩增。图13部分T0代单株bar试纸条检测，1：阴性对照；2～6：T0阳性植株；箭头所示检测线为bar蛋白表达检测线。图14转基因阳性愈伤和植株的GUS染色及GFP绿色荧光观察A：转基因阳性愈伤、植株GUS染色情况；标尺＝1毫米；B：转基因阳性愈伤开始到出芽GFP表达情况。B-a箭头所指为刚刚进入筛选阶段的阳性愈伤，B-b箭头所指为筛选过程中阳性愈伤生长变大，B-c箭头所指为马上要分化出芽的阳性愈伤。标尺＝100微米。图15T0代阳性苗3mg/L草铵膦筛选及抗性苗叶片涂抹Basta实验a：阳性植株，植株绿色(绿色箭头)；阴性苗，褐化枯死(红色箭头)。b：1：未转化单株涂抹H2O；6-7：未转化单株涂抹basta；2-5：转化单株涂抹basta。标尺＝1厘米。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下面所涉及的不同基因型的高粱均表明来源了，公众可以从申请人的实验室免费得到高粱品种和载体。实施例1以甜高粱和籽实高粱幼穗组织为外植体的再生体系的建立1.1幼穗取样标准确立利用幼胚作为外植体时的取样标准一般是取授粉后9～12天的幼胚，取材前先取2～3个幼胚观察大小，选取大小在1～2mm之间的幼胚。但幼穗被叶片包被，长度不易观察，所以适合长度的幼穗所对应的植株外部形态就显得尤为重要。由表1结果显示：当旗叶露出长度小于10cm，且旗下一叶长度在8～25cm之间时，Keller和JR105的幼穗长度在1.5～5cm，大小合适；旗叶露出长度为5～15cm，旗下一叶长度为20～30cm时，Ji2731的幼穗长度为1.5～5cm，大小合适。结合三个品种的取样标准我们发现在旗叶5～10cm，旗下一叶20cm左右时几个品种所取幼穗大小均合适，因此，所有利用幼穗作为外植体的基因型取样时均可参考此标准。表1不同基因型高粱幼穗取样标准1.2幼穗材料选择与准备本发明取旗叶刚刚露出时约2～5cm的幼穗，用70％酒精进行表面消毒30s～1min，25％的NaClO3(有效Cl-浓度8％)溶液灭菌20min，超净台中无菌水冲洗多次；用一只镊子固定住幼穗茎秆基部，用3#刀柄(23#)刀片将茎秆从中间剖开，用镊子将幼穗轻轻取出；在诱导培养基CIM上用刀切成大小几小段[MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/LpH6.0(高压灭菌前)]置于22～25℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；之后选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养[诱导培养基+2,4-D1mg/L]，每两周继代一次。挑选生长状态良好的愈伤组织接于分化培养基[MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/LpH6.0(高压灭菌前)]上22～25℃光培养2～3周，当苗高3～4cm时将再生出的苗移入生根培养基[MS培养基(大量+微量+有机物，其中大量元素减半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L，pH6.0(高压灭菌前)]中，当长出根时(壮根数3～5根，长约3cm)，洗去培养基，转移至土壤中(营养土：蛭石＝2:1)培养1～2周后移栽至温室花盆或大田。1.3不同种植环境对幼胚诱导愈伤组织的影响本研究以甜高粱品种Mn-3025为实验材料，统计了2013和2014两年在温室和大田种植条件下幼胚诱导愈伤组织的情况。如图1所示，在温室种植条件下，2013年和2014年Mn-3025幼胚诱导愈伤组织的效率都高达90％以上，而大田种植条件下，2013和2014年Mn-3025幼胚诱导愈伤组织的效率分别为50％和40％。此结果与Zhao等的研究结果相矛盾，但符合Kosambo-Ayoo 等人的观点，在人工控制的温室环境中，水肥条件好，病虫害胁迫少，供体材料生长状况好，因此愈伤的诱导效率更高更稳定。1.4不同生长调节剂和培养基添加物对幼穗诱导愈伤组织及愈伤组织再生能力的影响为提高愈伤组织诱导及分化出苗的效率，采用了多种组合进行实验，结果如表2所示。用2mg/L2,4-D可诱导90％以上幼穗产生愈伤组织(表2组合1，图2A-a)，用Dic可诱导50％幼穗产生愈伤组织(表2组合4和5，图2A-d)；培养基中不添加Cu2+离子时，所得愈伤组织有水渍化等现象(表2组合2，图2A-b)，添加AgNO3则对愈伤组织诱导无明显作用(表2组合6和7，图2A-a)。因此本研究中诱导愈伤组织最佳组合是2mg/L2,4-D+1μMCu2+(表2组合1，图2A-a)。不同状态愈伤组织(图2中A-a和A-d黑色箭头所指)细胞显微结构如图2B所示，其中B-a、c(A-a黑色箭头所指)为胚性愈伤组织，细胞呈椭圆形，大而饱满，细胞间排列紧密有序；其中B-b、d(A-d黑色箭头所指)为水渍化或褐化愈伤组织，细胞体积缩小，细胞间连接消失，与周围细胞脱离。表2不同生长调节剂及培养基添加物对Keller幼穗诱导愈伤的影响将不同组合诱导的胚性愈伤移至分化培养基上，研究其再生效率间的差异，统计结果如图3所示，可以看出用Dic作为生长调节剂诱导出的愈伤组织再生效率非常高，与2mg/L2,4-D(添加Cu2+)相比无显著差异，甚至还略高于2mg/L2,4-D(添加Cu2+)；而添加AgNO3诱导的愈伤组织再生效率反而显著低于不添加AgNO3时的情况。同时发现用Dic诱导的愈伤组织产生的再生苗要比用2,4-D(添加Cu2+)诱导的愈伤组织产生的再生苗生长情况好(图4)。通过测量其单株重和单株高发现利用Dic作为生长调节剂的再生苗单株重极显著高于利用2,4-D (添加Cu2+)的情况，单株高也显著高于2,4-D(添加Cu2+)的情况(图5)。因此，本研究中诱导愈伤组织最佳组合是2mg/L2,4-D+1μMCu2+；Dic虽不利于愈伤组织诱导，但其诱导的愈伤组织再生壮苗情况远优于2,4-D，考虑愈伤组织诱导阶段可将2,4-D和Dic结合使用；AgNO3虽未抑制愈伤组织诱导，但抑制愈伤组织再生出苗，所以诱导培养基中不添加AgNO3。1.5不同激素组合对愈伤再生效率的影响在不同的激素处理条件下，对不同高粱品种愈伤组织再分化出苗效率进行统计，结果如图6所示，JR105：组合1和4要显著高于组合2和3；Ji2731：组合1、2及4间差异不显著，但均显著高于组合3；Keller：组合1显著高于组合2、3及4。综合以上结果：分化培养基添加1mg/LIAA和1mg/L6-BA更适合测试基因型Keller、JR105及Ji2731分化出苗，其中Keller和JR105分化出苗效率达80％。1.6PVP40对愈伤组织再生效率的影响本研究通过在分化培养基中添加0、1、3、5、8及10g/L不同浓度的PVP40，研究其对愈伤组织再生效率的影响。结果如下：分化培养基中添加PVP40并不能降低愈伤组织在分化过程中的褐化情况，相反，与未添加PVP40的培养基比较，添加了PVP40的培养基在一定程度上反而加剧了愈伤组织的褐化，并且随着添加PVP40浓度的升高褐化情况加重(图7)。通过对愈伤组织再生效率的统计发现,相比较未添加PVP40时，添加较低浓度的PVP40(1g/L)再生效率反而显著提高，随着浓度的增加，愈伤的再生率开始降低(图8)。综上，再生过程中PVP40可能并不能抑制愈伤褐化，但低浓度PVP40的添加可促进愈伤的再生。至于PVP40影响再生的机理还不清楚，需要我们更深入的研究。1.7继代次数对Keller和JR105愈伤组织再生效率的影响我们对Keller和JR105两个基因型愈伤组织继代次数对再生效率的影响进行了研究，试验设置每两周继代一次，分别继代2次、6次和10次。发现这两个品种的愈伤组织继代2次的时候再生效率最高，JR105达90％以上，Keller也在85％以上；但愈伤组织继代6次后，在0.01水平上，JR105的再生效率极显著下降，仅为12％，Keller的再生效率下降不显著，达80％；当愈伤组织继代10次后，JR105再生效率几乎为0，Keller的再生效率仍有70％左右(如图9)。因此Keller愈伤组织可通过多次继代来保存，为高粱遗传转化提供充足的外植体，在一定程度上克服了高粱遗传转化受季节因素的影响。每个处理各选取同一时间诱导的愈伤组织10～15枚用于再生实验，计算再生效率；每个处理重复三次。大写字母A、B和C表示在0.01水平上极显著差异。1.8不同基因型高粱再生效率分析为验证优化的再生体系的可行性，同时为提供遗传转化候选基因型，我们进行了高粱不同基因型的再生实验。随机选择20个甜高粱品种和5个籽实高粱品种为实验材料，结果如表1-3所示，25个品种均能产生愈伤组织；除E-Tian和2011这两个品种，有23个品种可再生出苗；甜高粱品种Mn-3025和Keller，籽实高粱品种871300和JR105诱导愈伤组织和再分化效率均达到80％以上(表3)。结论：本发明通过对不同生长调节剂及不同培养基添加剂、分化阶段植物激素配比、和不同基因型等因素对高粱组织培养的影响比较发现：诱导愈伤组织最佳的组合是2mg/L的2,4-D加1μM的Cu2+；如果利用Dic代替2,4-D作为生长调节剂，在诱导愈伤方面Dic的效果远远不及2,4-D，但是其诱导的愈伤的再生效率却好于2,4-D；在产生壮苗方面，用Dic诱导的愈伤出苗后平均单株重以及单株高都要远远好于用2,4-D诱导的愈伤，原因可能是愈伤中高浓度的2,4-D可能会影响甚至抑制细胞的再分化。在愈伤再生过程中我们发现1mg/L6-BA+1mg/LIAA的激素组合对诱导愈伤再生出苗效果最好，25个测试品种中只有两个没有再生出苗，并且有13个品种再生效率在80％以上，说明这个激素组合在高粱离体再生方面非常适合。随机选择了20个甜高粱品种和5个籽实高粱品种对优化了的再生体系进行了验证，我们发现25个测试品种全部都能产生愈伤，并且有23个基因型再生出苗。其中以甜高粱品种Mn-3025和Keller以及籽实高粱品种871300和JR105愈伤诱导以及再生总体情况较好。本发明建立了以甜高粱和籽实高粱幼穗愈伤组织为外植体的再生体系：其中愈伤组织诱导培养基为：MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/LpH6.0(高压灭菌前)；继代培养基为：诱导培养基+2,4-D1mg/L；分化培养基为：MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/LpH6.0(高压灭菌前)；生根培养基为：MS培养基(大量+微量+有机物，其中大量元素减半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L，pH6.0(高压灭菌前)。表3不同基因型高粱诱导愈伤及出苗情况统计注：a：褐化致死实施例2.农杆菌介导的适宜甜高粱和籽实高粱的遗传转化方法2.1农杆菌转化所用培养基：农杆菌侵染培养基IM：MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪 蛋白500mg/L+MES600mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS200μmol/L，pH5.2。共培养基培养基COM：MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+MES600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+琼脂8g/L+AS200μmol/L，pH5.6(高压灭菌前)；筛选培养基SM：MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧苄青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+琼脂8g/LpH6.0(高压灭菌前)其中，草丁膦的浓度为3和5mg/L梯度筛选；分化培养基RM：MS基础培养基(大量元素+微量元素+有机物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧苄青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+琼脂8g/LpH6.0(高压灭菌前)；生根培养基RT：MS培养基(大量+微量+有机物，其中大量元素减半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧苄青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+琼脂5g/L，pH6.0(高压灭菌前)。2.2转化方法：将含p3300质粒(携带有GUS/GFP基因的双元植物表达载体，见图10；申请人的实验室保存，可以免费对外发放)的农杆菌在YEB固体培养基(含50mg/L利福平rif+50mg/L卡那霉素Kan)上划线，28℃下暗培养至出现单菌落；挑取单菌落接种于5mLYEB液体培养基(含50mg/Lrif+50mg/LKan)中振荡培养(28℃、200rpm)过夜；将培养的菌液转移到10mL新鲜YEB培养基中振荡培养(28℃、200rpm)约4～6h；4℃、4000rpm离心6min收集菌体，并用IM培养基将菌体悬浮，用于甜高梁幼穗愈伤组织的农杆菌侵染。选取长势良好的胚性愈伤组织在上述农杆菌悬浮液中浸泡10min；弃菌液，用无菌滤纸吸去幼穗愈伤组织块表面多余菌液，接种于共培养基上20～22℃暗培养3～5d；将幼穗愈伤组织块转移到恢复培养基(筛选压为0的SM培养基)上避光恢复1周后转移至SM培养基上进行筛选培养。先在低浓度草丁膦(3mg/L)的筛选培养基SM1筛选两周，然后将幼穗愈伤组织块转入含有浓度为5mg/L草丁膦膦的筛选培养基SM2上筛选两周。将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基上进行分化培养(22～25℃、16h光照/8h黑暗)，每隔2周继代培养一次，直至有不 定芽出现；待不定芽成苗，苗长3～4cm时，将其转移到生根培养基上，诱导生根；如有不定根出现，待长出3～5根壮根且根长3cm左右时，转移到蛭石培养基上过渡培养1～2周，移栽温室或大田(图11)。2.3转基因植株PCR检测为验证bar基因是否已转入高粱基因组中，对T0和T1代转化单株基因组用特异性引物barF(5’-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3’)和barR(5’-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3’)扩增bar基因，目的片段大小为433bp，同时对部分T0代单株进行RT-PCR检测分析。如图12A所示T0：1～3、4～6、7～9及10～12分别来自于4块抗性愈伤分化的所出苗，我们可以看出这4块愈伤组织均有阳性苗产生，但同一愈伤组织产生的苗并不都是阳性植株。主要原因可能是愈伤组织中抗性细胞对周围细胞产生了保护作用，未被筛选剂杀死而分化出苗；图12B所示bar基因在T0代单株中已开始转录；综上所述，bar基因初步检测已经整合到高粱基因组，还需要其它实验验证。2.4T0代转基因植株蛋白水平的检测利用bar检测试纸条对转基因单株bar蛋白表达情况进行检测，如图13所示，箭头所指检测线为bar蛋白表达检测线；bar蛋白若有表达，则有条带出现，bar蛋白若未表达则无条带出现；由此图可以清晰的观察到与1号阴性对照相比，2～6号阳性单株均有bar蛋白表达。2.5不同基因型转化效率统计通过对T0代转化单株基因组进行bar基因PCR检测(重复3次)及bar蛋白试纸条检测，统计转化效率，结果如表4所示，籽实高粱品种JR105利用愈伤组织作为外植体，转化效率在10％左右，最高达到16％；甜高粱品种Keller利用愈伤组织作为外植体，转化效率在3％～7％之间；甜高粱品种Mn-3025利用幼胚作为外植体，转化效率稳定在10％左右，最高达到20％，而籽实高粱品种871300转化效率较低(低于1％)。表4不同高粱品种转化效率统计注：上述质粒都为公开质粒，本申请人的实验室均有保藏，可以对外公开发放。2.6T0代转基因植株自交后代分离比通过对bar基因进行PCR检测以及bar试纸条检测，我们统计了11个T0代单株自交后代的分离比。如表5所示，有部分T0代单株自交后代阳性株与阴性株的比值小于3:1(1个拷贝)，不符合孟德尔遗传定律，说明这些T0代阳性株可能存在嵌合体的问题。为验证是否有嵌合体的原因我们选择了5个T0代转化单株进行不同叶片的PCR检测，由表6可以看出T0代d、f、i单株不是所有叶片都呈PCR检测阳性，所以这3个单株应该存在嵌合体问题；虽然KC所有叶片PCR检测阳性，但其T1代分离比为2:3，小于孟德尔遗传定律3:1分离比，由于未进行细胞水平检测，不能肯定它不存在嵌合体的问题；Kp24所有叶片PCR检测阳性，其自交后代分离比符合孟德尔遗传定律3:1分离比例，所以Kp24转化bar基因的拷贝数应是1。表5T0代自交后代分离比的统计注：a：不符合孟德尔遗传定律；b：T0代为纯合体。表65株T0代单株不同叶片PCR检测结果注：+，叶片PCR检测阳性；-，叶片PCR检测阴性。2.7T0代GUS染色及GFP绿色荧光检测对T0代阳性愈伤和单株进行GUS染色，结果如图14A所示，A-a阳性愈伤组织染成蓝色；A-b,c阳性植株根部和叶鞘染成蓝色。对T0代阳性愈伤组织GFP绿色荧光表达情况进行观察如图14B所示，B-a为愈伤组织转化GFP基因后刚刚进入筛选阶段绿色荧光表达情况，此时绿色荧光点比较小，如箭头所示；B-b为经筛选后阳性愈伤组织生长变大，如箭头所示；B-c为愈伤组织刚开始分化出芽时GFP基因表达情况观察，箭头所示为芽点位置。由此可以看出GUS基因和GFP基因都已经转入高粱基因组中，并开始表达。2.8T0代单株抗除草剂检测T0代单株生根阶段用3mg/L草铵膦进行筛选，如图15a所示，阳性植株经筛选后仍能生根，植株绿色(绿色箭头)；阴性苗经筛选后褐化枯死(红色箭头)。T0代单株抗除草剂涂抹实验：用100mg/LBasta涂抹4～5叶期抗性苗从上往下数第二片叶中部约1cm长；7天后观察叶片受损情况，如图15b所示，未转化单株6、7经basta涂抹后7天叶片已经全部褐化枯死，而2～5转化阳性株叶片经basta涂抹7天后，表现出不同的抗性，其中如3、4号所示叶片仅有所发黄，特别是4号抗性较好，5号叶片边缘稍有损伤，2号损伤情况最严重，但也远好于6、7号对照组。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3