蛋白质固相烷基化试剂的制备及固相烷基化试剂和应用的制作方法

本发明涉及一种蛋白质固相烷基化试剂，可应用于细胞、组织、体液、毛发等提取蛋白质中巯基的选择性反应及预处理。

背景技术：

在临床上，为了对肿瘤进行确诊，通常需要对病人进行穿刺获得组织样本，切片后再通过电子显微镜进行病理诊断，这种方法不仅耗时长(1-4天)，而且存在假阳性的风险。利用分子分型方法对组织形态进行分类已经引起广泛的兴趣，目前主要是通过mRNA转录表达谱或代谢组学方法。最近，Ruedi课题组结合压力循环技术和SWATH技术发展了一种快速的、可重复性分析微量组织样本的蛋白质组分析方法，采用该方法分析9个肾癌病人的18种活体组织样本，可重复定量2000多种蛋白质，通过对获得定量信息的蛋白质进行分类可明显区分来源于肿瘤的肾组织和健康的组织(Guo,T.,Kouvonen,P.,et al.Nat.Medicine.2015,doi:10.1038/nm.3807.)。

然而，由于该方法在样本处理过程中由于难以去除，无法采用强的蛋白质提取试剂(如SDS等表面活性剂)，因此难以实现蛋白质组的深度覆盖分析。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可用于蛋白质预处理的固相烷基化试剂。该试剂不仅可以实现蛋白质的高回收率捕获，而且还能实现与其它小分子的快速分离，降低蛋白质样品的复杂程度。为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)硅胶颗粒、无水甲苯、卤代硅烷化试剂混合后，搅拌回流6-24小时，制备修饰ATRP引发剂的硅胶颗粒；

它们用量为：硅胶颗粒1-100g、无水甲苯10-600mL、卤代硅烷化试剂0.1-12mL。卤代硅烷化试剂可为溴代硅烷化试剂和/或氯代硅烷化试剂；

2)通过原子自由转移聚合反应(ATRP)在载体表面上引入甲基丙烯酸缩水甘油酯的反应过程为：修饰ATRP引发剂的硅胶颗粒，甲醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯、ATRP催化剂及配体试剂混合后，除气，回流反应2-24小时制得含环氧基团的硅胶颗粒(Si-GMA)；

它们用量为：修饰ATRP引发剂的硅胶0.5-10g、甲基丙烯酸缩水甘油酯1-25mL、甲醇10-300mL，ATRP催化剂5-100mg、配体试剂0.01-0.3mL。ATRP催化剂可为卤化亚铜(CuX)、卤化亚铁(FeX₂)或卤化亚钌(RuX₂)中的一种或二种以上；配体试剂可为2,2’联二吡啶(bpy)、N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亚乙基三胺、2-吡啶甲醛缩正丙胺或六甲基三乙基三胺中的一种或二种以上。

3)然后通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺

(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的反应过程为：

含环氧基团的硅胶颗粒(Si-GMA)表面引入亲水活性反应基团，具体步骤如下：

A.将Si-GMA分散于磷酸缓冲溶液中,加入PEI，搅拌反应4-12小时；

其中采用PEI的终浓度范围为1-100mg/mL；Si-GMA于磷酸缓冲溶液中的量为：Si-GMA 0.5-10g于磷酸缓冲溶液1-100mL中；

B.将碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶于甲醇和磷酸缓冲溶液混合体系中，加入修饰PEI的硅胶颗粒，室温避光反应6-12小时；

其中碘乙酸-N-琥珀酰胺酯加入量为硅胶加入质量的1-1.5倍，溶剂体系中甲醇与磷酸缓冲溶液体积比为1/1-3/1。磷酸缓冲溶液浓度为0.01-0.1M,pH值为7-9。

4)将蛋白质固相烷基化试剂应用于细胞、组织、体液或毛发中一种或二种以上提取蛋白质中巯基的选择性反应或预处理。

本发明具有如下优点：

1、采用原子转移自由基聚合反应对硅胶颗粒表面进行修饰，不仅可以提高活性单体的接枝容量，而且制备过程容易控制，重复性好；

2、采用PEI为改性试剂，不仅提高了颗粒表面的亲水性，而且还可掩盖杂化硅胶整体材料未反应完的硅羟基；

3、采用碘乙酸-N-琥珀酰胺酯修饰表面基团，可以缩短修饰时间，提高制作通量；

4、制备的蛋白质固相烷基化试剂，可以实现微量组织或细胞中蛋白质原位预处理(包括烷基化、小分子干扰物去除、以及颗粒酶解)。

附图说明

图1、蛋白质固相烷基化试剂的合成示意图(a)及蛋白质原位预处理示意图(b)；

图2、蛋白质固相烷基化试剂的性能评价；

图3、蛋白质固相烷基化试剂应用于微量细胞样本的预处理；

图4、蛋白质固相烷基化试剂应用于微量组织样本的预处理。

具体实施方式

实施例1

1、ATRP引发剂的修饰：称取4g硅胶，加入60mL甲苯和1.2mL 3-(三甲氧基硅烷基丙基)-2-溴代-2-甲基丙酯,混匀后，搅拌回流90℃反应12h。反应完成后，采用无水乙醇清洗3次。

2、环氧基团的修饰：称取修饰ATRP引发剂的硅胶颗粒1.2g,加入28mL甲醇，2.65mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA),0.0314mL N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亚乙基三胺,混匀后，通氮气5min后，加入10mg CuCl和1.7mg CuCl₂，密封回流60℃反应6h，制得Si-GMA颗粒。反应完成后，分别采用甲醇，水清洗3次，然后加入过饱和EDTA溶液清洗至无色后，再用水、甲醇清洗，干燥后备用。

3、PEI的修饰：将制备的Si-GMA颗粒分散于50mM磷酸缓冲溶液(pH 8.0)中，加入1.0g PEI至终浓度为20mg/mL,50℃搅拌反应4h后，分别用水和乙醇清洗5次，干燥备用。

4、称取PEI修饰的硅胶颗粒10mg,加入1mg/mL碘乙酸-N-琥珀酰胺酯(溶剂为甲醇和磷酸缓冲溶液(pH 8.0)混合体系，溶剂体系中甲醇与磷酸缓冲溶液体积比为1/1)10mL,室温避光振荡反应6h,然后分别用50mM磷酸缓冲盐(pH 8.0)清洗3次，即制得蛋白质固相烷基化试剂，即为试剂1

实施例2

1、ATRP引发剂的修饰：称取10g硅胶，加入150mL甲苯和3mL 3-(三甲氧基硅烷基丙基)-2-溴代-2-甲基丙酯,混匀后，搅拌回流90℃反应12h。反应完成后，采用无水乙醇清洗3次。

2、环氧基团的修饰：称取修饰ATRP引发剂的硅胶颗粒3g,加入50mL甲醇，5mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA),0.1mL N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亚乙基三胺,混匀后，通氮气5min后，加入50mg CuCl和8.5mg CuCl₂，密封回流60℃反应6h，制得Si-GMA颗粒。反应完成后，分别采用甲醇，水清洗3次，然后加入过饱和EDTA溶液清洗至无色后，再用水、甲醇清洗，干燥后备用。

3、PEI的修饰：将制备的Si-GMA颗粒分散于50mM磷酸缓冲溶液(pH 8.0)中，加入1.0g PEI至终浓度为20mg/mL,50℃搅拌反应4h后，分别用水和乙醇清洗5次，干燥备用。

4、称取PEI修饰的硅胶颗粒10mg,加入1mg/mL碘乙酸-N-琥珀酰胺酯(溶剂为甲醇和磷酸缓冲溶液(pH 8.0)混合体系，溶剂体系中甲醇与磷酸缓冲溶液体积比为1/1)10mL,室温避光振荡反应6h,然后分别用50mM磷酸缓冲盐(pH 8.0)清洗3次，即制得蛋白质固相烷基化试剂，即为试剂2

实施例3

其它条件同上实施例1，ATRP催化剂变为FeCl₂/FeCl₃,制备蛋白质固相烷基化试剂，即为试剂3

实施例4

称取1mg BSA,采用质量浓度4％SDS配置成0.1mg/mL,然后依次进行90℃热变性10min,加入25μM TCEP(磷酸三氯乙酯)56℃反应1.5h,然后加入1mg实施例1制备的蛋白质固相烷基化试剂1反应1h，离心5min,采用体积浓度50％甲醇和50mM磷酸缓冲盐(pH 8.0)依次清洗颗粒以除去蛋白表面吸附的SDS，加入1μg Trypsin(胰蛋白酶)紫外光辅助下酶解15min,离心取上清液，进行LC-MS分析，如图2所示，通过匹配数据库，测得BSA的序列覆盖率为32％。

实施例5

取20μg HeLa细胞提取蛋白质，依次进行90℃热变性10min,加入25μM TCEP(磷酸三氯乙酯)56℃反应1.5h,然后加入1mg实施例1制备的蛋白质固相烷基化试剂2反应1h，离心5min,采用体积浓度50％甲醇和50mM磷酸缓冲盐(pH 8.0)依次清洗颗粒，加入1μg Trypsin(胰蛋白酶)紫外光辅助下酶 解15min,离心取上清液，进行LC-MS分析，如图3所示，通过数据库匹配，共鉴定1700种蛋白质。

实施例6

称取1mg鼠脑组织，通过组织匀浆提取蛋白质，离心取上清后，90℃热变性10min,加入25μM TCEP(磷酸三氯乙酯)56℃反应1.5h,然后加入1mg实施例1制备的蛋白质固相烷基化试剂3反应1h，离心5min,采用体积浓度50％甲醇和50mM磷酸缓冲盐(pH 8.0)依次清洗颗粒，加入1μg Trypsin(胰蛋白酶)紫外光辅助下酶解15min,离心取上清液，进行LC-MS分析，如图4所示，通过数据库匹配，共鉴定1100种蛋白质。

本发明试剂可选择性与蛋白质上的巯基反应，具有稳定性高，操作简单、反应快速等优点。与传统的烷基化试剂相比，采用该试剂，蛋白质可与其它小分子(如糖、盐、表面活性剂、脂类等)实现快速分离，提高蛋白质的纯度，显著降低样本复杂程度。由于试剂表面亲水性较好，可显著提高蛋白质或酶解产物的回收率，因此，该试剂适合于细胞、组织、体液、毛发等提取蛋白质中巯基的选择性反应及预处理。