本发明是一种关于Auristatin衍生物以及Auristatin衍生物-接头片段的合成新方法，这种方法能够降低产品的杂质，提高产品的收率，缩短生产周期。
技术背景：
抗体-药物偶联物(ADCs，Antibody-drug conjugate)是近年的研究热点，其主要的作用机制是运用抗体(Antibody)将药物(Drug)靶向运输到靶细胞(如肿瘤细胞)，在靶组织或者靶细胞内释放药物。Takeda/Seattle Genetics在原有ADC技术的基础上，通过一定的技术改进，利用自己的抗体偶联技术开发了新型ADC，brentuximab vedotin(商品名Adcetris)，于2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。
ADCs药物主要由三部分组成，分别是Antibody(抗体)、Linker(接头)和Payload(药物弹头)，其中抗体(Antibody)和药物弹头(Payload)部分通过接头(Linker)相连，弹头部分包括MMAE，MMAD和MMAF等一系列化合物，mc-Valine-citrulline-PABC(Vc)等是最常用的接头，目前合成ADC最常用的方法是将药物弹头-接头合成好后将其与抗体蛋白偶联就可以得到ADC，而药物弹头-接头的合成方法主要是分别合成药物和接头后，在液相中将药物和接头偶联起来，其合成方法分别可以见US7750116，US2005238649，WO2007008603，WO2014072888。
由于austatin衍生物以及药物弹头-接头的合成主要在液相中进行，液相中合成时需要将氨基酸进行重复的保护脱保护，使得反应变得特别冗长，而且中间体需要不断的重结晶或者纯化，降低了反应的收率。得到的衍生物及药物弹头-接头杂质较多，纯化比较困难，由于这些难题的存在，austatin衍生物以及药物弹头-接头的大量生产变的较难实现而且价格非常昂贵。
1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，带来了多肽有机合成上的一次革命，后来经过Lou Carpino等人的努力，将Fmoc方法用于固相多肽的合成并且方法逐渐成熟，经典的Fmoc方法是将多肽的C端固定于树脂上，将N端裸露，用缩合试剂将C端裸露的氨基酸连接到上一个氨基酸的氨基上，脱除该氨基酸氨基上的Fmoc保护后，连接下一个氨基酸，直到肽链的完成，最终将整个肽链从树脂上裂解下来进行纯化就可以得到纯品多肽。跟液相法合成多肽相比，固相方法的羧基端不需要保护，多肽合成过程中的过 量的反应物可以简单除去，从而大大的缩短了反应周期。
经过多年业界人员的努力，已经有了多种树脂可以选择，例如2Cl-CTC，Wang树脂，MBHA树脂，THP树脂等，在工业上已经可以大规模的提供，使得固相合成多肽的工业化成为了可能。
文中所使用的英文和英文缩写注明如下：
Aib 2,2’-二甲基甘氨酸
Ala 丙氨酸
Boc 叔丁氧羰基
BOP-Cl 双(2-氧代’-3-恶唑烷基)次磷酰氯
Cit 瓜氨酸
Dap (2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯酮-2-基)丙酸
DCC 二环己基碳二亚胺
DEPT 3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
DIEA(DIPEA) N,N-二异丙基乙胺
Dil (3R,4S)-3-甲氧基-5-甲基-4-甲氨基己酸
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EEDQ 2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉
Fmoc 笏甲氧羰基
Fmoc-OSu 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HCTU 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAt N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
HOBt 1-羟基苯并三唑
MMAD 单甲基澳瑞他汀D
MMAE 单甲基澳瑞他汀E
MMAF 单甲基澳瑞他汀F
NMeVal N-甲基缬氨酸
NMM N-甲基吗啉
PAB 4-氨基二苯甲酮
PABC 4-氨基苯乙酸
Phe 苯丙氨酸
Phe-OMe 苯丙氨酸甲酯
pNP 对硝基苯酚
PyAoP (3H-1,2,3-三唑并[4,5-B]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
PyBoP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PyBroP 三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐
T3P 1-丙基磷酸酐
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯
TFA 三氟乙酸
TPTU 2-(2-吡啶酮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐
Val 缬氨酸
技术实现要素：
：
本专利旨在解决austatin衍生物及其与接头片段合成过程中的杂质多，周期长的问题，本方法采用全固相合成的方法解决这些问题。
其中#1表示与羰基碳的连接位点，R1可以是H，甲基，Fmoc，Boc或者接头，R2可以是H或者1-8个C的任意碳链，R3可以是H或者1-8个C的任意碳链，D是下式的基团
其中
#2表示与氮原子的连接位点，
R4是氢或甲基，
R5是异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R4和R5与它们所键合的碳原子一起形成下式的(1S,2R)-2-苯基环丙烷-1,1-二基基团
其中
#3表示与相邻氮原子的连接位点，
#4表示与羰基的连接位点，
在其中存在N-O部分的环A是下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#5表示与羰基的连接位点，
R9是氢、羟基或苄氧基，
R6是氢或甲基，
R7是异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R6和R7与它们所键合的碳原子一起形成下式的(1S,2R)-2-苯基环丙烷-1,1-二基基团
其中
#6表示与相邻氮原子的连接位点，
#7表示与基团T1的连接位点，
T1是式-C(C＝O)-OR10、-C(C＝O)-NR11R12、-C(C＝O)-NH-NH-R13或-CH2-O-R14的基团，
其中
R10是氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R11是氢或甲基，
R12是氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R11和R12与它们所键合的氮原子一起形成4-7元杂环，
R13是苯甲酰基，
R14是苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R8是氢、甲基、羧基或下式的基团
其中
#8表示与-CHC(R17)-T2的连接位点，
R15是苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R16是苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R17是氢或羟基，
T2是苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
本发明提供两个技术方案:
当D为非Phe基团时，技术方案一包括以下几个步骤：
(1)将Fmoc-Dap-OH偶联到树脂上，将保护基脱除，进行下一步顺序偶联，直到完成Val-Dil-Dap-树脂。
(2)R1是H或者甲基时，偶联好Z后将得到的多肽到树脂上裂解下来。
(3)R1为接头或者其他结构时，将R1按照顺序偶联完成后从树脂上裂解下来。
(4)将(2)(3)得到的片段与D的片段进行偶联后，得到产物，如果有保护基团，则需要根据实际需求脱除后得到最终产物。
当D为Phe基团时，技术方案二包括以下几个步骤：
(1)将Fmoc-Phe-OH偶联到树脂上，将保护基脱除，进行下一步顺序偶联，直到完成Val-Dil-Dap-Phe-树脂。
(2)R1为接头或者其他结构(不包括H或者甲基)时，将R1按照顺序偶联完成后从树脂上裂解下来，得到产物。
根据技术方案一
步骤(1)中我们采用的Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Dap-OH，Fmoc-Dil-OH,Fmoc-Val-OH。
步骤(1)中，本专利采用2Cl-Trt树脂或者Wang树脂，取代度在0.2-2.0mol/g之间均可，考虑到工业化生产的需要，2Cl-Trt树脂优选的树脂取代度在0.3-1.6mmol/g。Wang树脂优选的树脂取代度0.3-1.8mmol/g。
步骤(1)中偶联第一个氨基酸到树脂上时，Wang树脂采用DIC/HOBt/DMAP，2Cl-Trt树脂采用DIEA或者NMM。
步骤(1)中使用到的缩合剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt，DCC/HOAt,HATU/DIPEA，HBTU/DIPEA，TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P，EEDQ或者DECP，脱Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF。
步骤(1)中，当使用的树脂为2Cl-Trt树脂或者Wang树脂时，得到的Val-Dil-Dap-树脂结构如下：
步骤(3)中偶联Fmoc-PAB-pNP时，使用的是有机碱如DIPEA，NMM，2,6-二甲基吡啶或者他们的任意组合。
步骤(2)和步骤(3)中的缩合剂可以采用DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt，DCC/HOAt,HATU/DIPEA，HBTU/DIPEA，TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P，EEDQ或者DECP，都能顺利进行反应，考虑到工业化生产成本的需要，优先选择DIC/HOBt作为缩合试剂，缩合试剂为氨基酸的2-4个当量。2Cl-Trt树脂选用的裂解液为1-3％TFA/DCM溶液，Wang树脂用的裂解液为95％TFA/DMF溶液。
步骤(3)中的R1包括以下结构：
步骤(3)中裂解液选择1-3％TFA/DCM溶液或者95％TFA/DMF溶液。
步骤(1)、(2)和(3)中，所述偶联氨基酸或者片段的方法，所得到的片段包括Dap- 树脂，Dil-Dap-树脂，Val-Dil-Dap-树脂，NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂，Boc-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂，Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂，PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂，Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂，Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂以及mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂。
步骤(2)和(3)中，从树脂上裂解下来的片段包括Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，Boc-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，Boc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，Fmoc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH及Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH，Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH及Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH。
步骤(4)中D的结构式包含但不限于以下结构：
步骤(4)偶联好D片段后，如果R1为Fmoc，则采用20％哌啶/DMF,如果R1为Boc，则采用比例为95/5的TFA/H2O脱除。如果D上存在叔丁基，采用比例为95/5的TFA/H2O同时脱除。根据技术方案二
步骤(1)中我们采用的Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Dap-OH，Fmoc-Dil-OH,Fmoc-Val-OH。
步骤(1)中，本专利采用2Cl-Trt树脂或者Wang树脂，取代度在0.2-2.0mol/g之间均可，考虑到工业化生产的需要，2Cl-Trt树脂优选的树脂取代度在0.3-1.6mmol/g。Wang树脂优选的树脂取代度0.3-1.8mmol/g。
步骤(1)中偶联第一个氨基酸到树脂上时，Wang树脂采用DIC/HOBt/DMAP，2Cl-Trt树脂采用DIEA或者NMM。
步骤(1)中使用到的缩合剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt，DCC/HOAt,HATU/DIPEA，HBTU/DIPEA，TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P，EEDQ或者DECP， 脱Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF。
步骤(2)中偶联Fmoc-PAB-pNP时，使用的是有机碱如DIEA，NMM，2,6-二甲基吡啶或者他们的任意组合。
步骤(2)中的缩合剂可以采用DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt，DCC/HOAt,HATU/DIPEA，HBTU/DIPEA，TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P，EEDQ或者DECP，都能顺利进行反应，考虑到工业化生产成本的需要，优先选择DIC/HOBt作为缩合试剂，缩合试剂为氨基酸的2-4个当量。2Cl-Trt树脂选用的裂解液为1-3％TFA/DCM溶液，Wang树脂用的裂解液为95％TFA/DMF溶液。
步骤(2)中的R1包括以下结构：
步骤(2)中裂解液选择1-3％TFA/DCM溶液或者95％TFA/DMF溶液。
步骤(2)中D的结构式包含但不限于以下结构：
步骤(2)中,所得到的片段包括PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂，Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂，Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂，Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂及Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂。
步骤(2)中,从树脂上裂解下来的片段包括PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH，Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Boc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH， Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH，Boc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH，Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH。
具体实施方式：
本反应中使用到的试剂及相关原料都来自于普通市售。
实施例一MMAD的合成
将Fmoc-Dap-OH(1.0eq.)和DIPEA(4.0eq.)溶于干燥的DCM中，加入2Cl-Trt树脂后搅拌2个小时，抽干并用DCM洗涤两次，加入甲醇和DIPEA进行封端处理，然后再抽滤，用DCM洗涤三次，DMF洗涤三次，DCM再洗涤三次后抽干，取出树脂在室温下真空干燥5小时后，在得到的Fmoc-Dap-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dil-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解，冷却到0摄氏度，加入DIC进行活化10分钟，加入到上步得到的树脂中，室温下搅拌3.5小时，抽滤，用DMF洗涤5遍，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Val-OH(3eq.)，DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中，加入DMF溶解，反应搅拌3小时，抽干反应液，加入DMF洗涤5次后用20％哌啶/DMF溶液脱除保护基进行下一步。
将Fmoc-NMeVal-OH(3eq.)，DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中，加入DMF溶解，反应搅拌3小时，抽干反应液，用DMF溶液洗涤三遍后用甲醇洗涤3遍，抽干 溶液，干燥树脂后加入2％TFA/DCM溶液，加入DIPEA中和过量的TFA后真空除去多余的溶剂。
将上面得到的固体中加入DMF溶解后，加入(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙胺(1.1eq.)，DEPT(1.1eq.)，DIPEA(1.1eq.)后搅拌5小时后用HPLC监控反应已经完成，将反应溶液真空蒸出溶剂后得到Fmoc-MMAD，用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护，将得到的产品倒入乙醚中，析出的固体过滤，将过滤的产品用HPLC纯化就可以得到MMAD。
实施例二Aib取代的MMAD的合成
将Wang树脂与Fmoc-Dap-OH(1.1eq.)加入到DMF中，加入DIC(2eq.)，HOBt(2eq.)，DMAP(0.2eq.)，反应搅拌三个小时后，抽干，用DMF洗涤树脂5遍后加入甲醇，DIC，HOBt和DMAP封端，抽干，用DMF洗涤3遍后甲醇洗涤3遍，抽干待用。在得到的Fmoc-Dap-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dil-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解，冷却到0摄氏度，加入DIC进行活化10分钟，加入到上述实验得到的树脂中，室温下搅拌3.5小时，抽滤，用DMF洗涤5遍，抽干，在树脂中加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Val-OH(3eq.)，DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到树脂中，加入DMF溶解，反应搅拌3小时，抽干反应液，加入DMF洗涤5次后用20％哌啶/DMF溶液脱除保护基进行下一步。
在上述方法得到的Val-Dil-Dap-Wang Resin中加入DMF，将Fmoc-Aib-OH(3eq.)，DEPT(3eq.)，DIPEA(3.3eq.)加入到树脂中，搅拌三个小时后，茚三酮检测呈阴性，抽干反应 液，用DMF溶液洗涤三遍后用甲醇洗涤3遍，抽干溶液，干燥树脂后加入95/5的TFA/H2O溶液，搅拌三个小时后，过滤，将滤液倒入乙醚中析出固体，将固体洗涤几遍后干燥。
将上面得到的估计加入DMF溶解后，加入(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙胺(1.1eq.)，DEPT(1.1eq.)，DIEA(1.1eq.)后搅拌5小时后用HPLC监控反应已经完成，将反应溶液真空蒸出溶剂后得到Fmoc保护的产物，用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护，将得到的产品倒入乙醚中，析出的固体过滤，将过滤的产品用HPLC纯化就可以得到Aib取代的MMAD。
实施例三VcMMA-PHE的合成
在根据实施例一中的方法得到Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-Resin中，加入20％用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-PAB-PNP(1.5eq.)加入到以上所得到的树脂中，加入DIPEA(4eq.)，2,6-二甲基吡啶(4eq.)和HOAt(0.2eq.)，搅拌3小时后，取出少量裂解，用HPLC监控反应完成，加入20％用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Cit-OH(3eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解，冷却到0摄氏度，加入DIC进行活化10分钟，加入到上一步得到的树脂中，室温下搅拌3.5小时，抽滤，用DMF洗涤5遍，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。用这种方法依次偶联Fmoc-Val-OH及6-马来酰胺基己酸后，用 2％TFA/DCM将mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap从树脂上切割下来。用乙醚将得到的粗品反复洗涤后干燥得到mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Dap用于最后一步偶联反应。将mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap溶解于NMP/DMF(1：1)的溶液中，加入Phe-OMe(1.2eq.)，PyBrOP(3.0eq.)后，反应室温下搅拌8小时后，HPLC检测反应完成，将产品倒入乙醚中析出固体后，将固体过滤洗涤，HPLC纯化后得到产品。
实施例四VcMMAF的合成
将Fmoc-Phe-OH(1.0eq.)和DIPEA(4.0eq.)溶于干燥的DCM中，加入2Cl-Trt树脂后搅拌2个小时，抽干并用DCM洗涤两次，加入甲醇和DIPEA进行封端处理，然后再抽滤，用DCM洗涤三次，DMF洗涤三次，DCM再洗涤三次后抽干，取出树脂在室温下真空干燥5小时后，在得到的Fmoc-Phe-树脂中加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dap-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解，冷却到0摄氏度，加入DIC进行活化10分钟，加入到上步得到的树脂中，室温下搅拌3.5小时，抽滤，用DMF洗涤5遍，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行 下一步反应。
将Fmoc-Dil-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解，冷却到0摄氏度，加入DIC进行活化10分钟，加入到上步得到的树脂中，室温下搅拌3.5小时，抽滤，用DMF洗涤5遍，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Val-OH(3eq.)，DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中，加入DMF溶解，反应搅拌3小时，抽干反应液，加入DMF洗涤5次后用20％哌啶/DMF溶液脱除保护基进行下一步。
将Fmoc-NMeVal-OH(3eq.)，DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中，加入DMF溶解，反应搅拌3小时，抽干反应液，用DMF溶液洗涤三遍后用甲醇洗涤3遍，
在根据上述方法得到Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-Resin中，加入20％用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-PAB-PNP(1.5eq.)加入到以上所得到的树脂中，加入DIPEA(4eq.),2,6-二甲基吡啶(4eq.)和HOAt(0.2eq.),搅拌3小时后，取出少量裂解，用HPLC监控反应完成，加入20％用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Cit-OH(3eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解，冷却到0摄氏度，加入DIC进行活化10分钟，加入到上一步得到的树脂中，室温下搅拌3.5小时，抽滤，用DMF洗涤5遍，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液后，搅拌30分钟，抽干，加入DMF洗涤五次后，抽干直接进行下一步反应。用这种方法依次偶联Fmoc-Val-OH及6-马来酰胺基己酸后，用2％TFA/DCM将粗品从树脂上切割下来,经过制备HPLC纯化就可以得到纯的VcMMAF。