1.一种副猪嗜血杆菌菌株五价疫苗的制备方法,其特征在于,
菌株LYD1为副猪嗜血杆菌菌株LYD1,于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.11143;
菌株LYH5为副猪嗜血杆菌菌株LYH5,于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.11144;
菌株LY02为副猪嗜血杆菌菌株LY02,于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.11145;
菌株LYW1为副猪嗜血杆菌菌株LYW1,于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.11146;
菌株LYC2为副猪嗜血杆菌菌株LYC2,于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.11147;
使用上述菌株进行五价疫苗的制备,方法如下:
繁殖培养:取上述的菌株LYD1、菌株LYH5、菌株LY02、菌株LYW1和菌株LYC2并分别划线接种于TSA琼脂平板上,且于5%~10%CO2、37℃下培养24~48h,挑取典型菌落并接种于TSB培养基上,置于37℃振荡培养24~48h,即得菌株LYD1的一级种子液、菌株LYH5的一级种子液、菌株LY02的一级种子液、菌株LYW1的一级种子液及菌株LYC2的一级种子液;取所得菌株LYD1的一级种子液、菌株LYH5的一级种子液、菌株LY02的一级种子液、菌株LYW1的一级种子液及菌株LYC2的一级种子液并分别划线于TSA琼脂平板上,且于5%~10%CO2、37℃下培养24~48h,挑取典型菌落并接种于TSB培养基上,置于37℃振荡培养24~48h,即得菌株LYD1的二级种子液、菌株LYH5的二级种子液、菌株LY02的二级种子液、菌株LYW1的二级种子液及菌株LYC2的二级种子液;将菌株LYD1的二级种子液、菌株LYH5的二级种子液、菌株LY02的二级种子液、菌株LYW1的二级种子液及菌株LYC2的二级种子液分别接种至发酵培养基,并于37℃、180r/min下培养22~24h,得菌株LYD1菌液、菌株LYH5菌液、菌株LY02菌液、菌株LYW1菌液及菌株LYC2菌液;
其中,发酵培养基为半合成培养基,该半合成培养基的配制方法为:取TSB30g溶于去离子水,并定容至1000mL,充分摇匀溶解后于121℃蒸汽灭菌15min,冷却后加入50ml过滤除菌的新生牛血清、200μL过滤除菌的0.02%NAD即可;
浓缩与灭活:将繁殖培养所得各菌液分别进行浓缩,且菌株LYD1菌液、菌株LYW1菌液、菌株LYC2菌液均浓缩至菌液中的抗原含量为2.5×109CFU/mL,菌株LYH5菌液、菌株LY02菌液则均浓缩至菌液中的抗原含量为2.0×109CFU/mL;接着将浓缩后的各菌液分别进行灭活;
总混合菌液的制备:取已浓缩、灭活后的菌株LYD1菌液、菌株LYW1菌液及菌株LYC2菌液并按1:1:1的体积比混合,获得第一混合菌液;取已浓缩、灭活后的菌株LYH5菌液、菌株LY02菌液并按1:1的体积比混合,获得第二混合菌液;之后将所得第一混合菌液与第二混合菌液按1:1.5的体积比混合则得总混合菌液;
水相配制:按体积份取已灭菌的吐温-80 4份、无菌检验合格的总混合菌液96份,并导入配液罐中,开启搅拌电机,匀速搅拌至吐温-80完全溶解,获得水相;
油相配制:按体积份取注射用白油94份、司本-80 6份并加至油相制备罐中,开启搅拌电机,匀速搅拌,同时开启导热油开关,125℃加热30min,冷却后即得油相;
乳化:取油相1.5体积份置于乳化罐内,开动电机1500-2000r/min搅拌,同时缓缓加入水相1体积份,再以4000r/min乳化30min;乳化后,取样10ml并以3000r/min离心15min,若不分层则乳化所得乳化液即为所述副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗;若有分层现象则将所得乳化液重复乳化直至不分层,最终即得所述副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗;
TSA琼脂平板的配制方法为:取胰蛋白大豆琼脂40g,加入去离子水定容至1000mL,充分摇匀溶解,121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却后加入50mL过滤除菌的新生牛血清、200μL过滤除菌的0.2g/mLNAD即可;
TSB培养基的配制方法为:取胰蛋白大豆肉汤即TSB30g溶于去离子水,定容至1000mL,充分摇匀溶解后121℃蒸汽灭菌15min,加入50mL过滤除菌的新生牛血清、200μL过滤除菌的0.02%NAD即可。