本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种神经干细胞的专用培养基及其培养方法。
背景技术：
在神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎和成体脑、脊髓等神经组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式自我复制更新或分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。因此培养神经干细胞旨在获得足够数量的具有增殖及分化潜能的神经干细胞，以供移植治疗、进行转基因操作攻击肿瘤的生长、或进行自体回输、治疗中枢神经系统功能损害等。
因为神经是机体中最复杂和最高度分化的组织，神经干细胞的培养难度极高，在培养过程中极其容易自发分化，从而很快就失去干细胞的特性和功能。所以目前有大量神经干细胞体外培养的研究，均旨在培养高质量和数量的神经干细胞。例如《早期人胚神经干细胞分布及分离培养》，吕海侠，翟伟，刘勇等，西安交通大学学报(医学版)，2003年4月第24卷第2期：97-100；《人胚神经干细胞的分离培养和鉴定》，罗树伟，谢常青，卢光，中南大学学报(医学版)，2004，29(2)：129-131；，中国专利申请CN02134313.6中提供的人神经干细胞的培养方法；中国专利申请CN104694475A中提供的一种新型神经干细胞培养添加剂及筛选方法、应用及利用该添加剂的培 养基等。由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，虽然有血清时培养扩增效率较高，然而无血清培养仍然成为发展趋势，目前一般采用添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)、抗生素、N2和/或B24添加剂等成分的DMEM或者DMEM/F12培养液作为神经干细胞的无血清培养液，这种培养液虽然解决了潜在病毒、污染的问题，具有培养液成分更加清晰，重复性高等优点，但是神经干细胞成活率低、增殖缓慢、传代产量低、分化严重等问题依旧较难解决。
技术实现要素：
本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种神经干细胞专用培养基以及应用所述培养基培养神经干细胞的方法。经过大量试验确定培养基的合理配方，以及培养神经干细胞的具体条件，可有效的对神经干细胞进行体外培养和扩增。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种神经干细胞专用培养基，所述培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：300-450μg/ml2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、5-15μg/ml N2添加剂、15-30ng/ml干细胞生长因子、5-7mg/ml硫代甘油、50-70ng/ml神经生长因子、0.05-0.07mmolol/ml乙酰胆碱、10-25mg/ml羧甲基纤维素钠、0.005-0.01mmolol/ml维甲酸和0.110-0.20mmolol/ml叶酸。
优选的，所述神经干细胞专用培养基，所述培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：350μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、8μg/ml N2添加剂、22ng/ml干细胞生长因子、6mg/ml硫代甘油、63ng/ml神经生长因子、0.06mmolol/ml乙酰胆碱、18mg/ml羧甲基纤维素钠、0.008mmolol/ml 维甲酸和0.15mmolol/ml叶酸。
本发明所提供的神经干细胞专用培养基，配方合理有效，保持神经干细胞的高活率，在能有效提高细胞扩增速度的同时保持神经干细胞的未分化状态，不影响其分化性能，延长传代次数。
另一方面，本发明提供了一种应用所述的神经干细胞专用培养基培养神经干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)在无菌条件取得离体脑神经组织，用含有5％双抗的PBS缓冲液进行漂洗；
2)将步骤1)所得的脑神经组织切成1-2mmol3碎块，加入含由0.5mg/ml I型胶原酶、0.5mg/ml IV型胶原酶和0.1mg/ml脱氧核糖核酸I的DMEM/F12培养基，于4-8℃的CO2培养箱中消化分解20-24h,得到组织悬液；
3)将步骤2)所得的组织悬液离心，去上层清液，加入DMEM/F12培养基清洗3次，加入细胞消化液，于35-38℃消化42-57min,轻轻吹打混匀后终止消化，于DMEM/F12中漂洗，过200-400目细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
4)向步骤3)所得的单细胞悬液中加入所述神经干细胞专用培养基，调整细胞浓度为1×107个/ml，接种于培养皿中，培养10-12天，得到所述P0代神经干细胞；
5)取步骤4)得到的P0代神经干细胞，加入细胞消化液于37℃消化40s-85s，吹打混匀后，离心6-10min，弃上层清液，加入所述神经干细胞专用培养基，使细胞浓度为3×105个/ml，接种培养瓶中，并向培养皿中加入1g/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺，缓慢送气混合均 匀，每隔天换一次新鲜培养基的同时缓慢送气混合，培养3-5天，得到传代神经干细胞。
其中，双抗为细胞培养添加物：青霉素及链霉素溶液，是一种含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。
结合神经干细胞生长特性，通过大量试验总结出上述神经干细胞的培养方法及条件，能有效维持神经干细胞的最佳状态，引导细胞增殖；在传代细胞培养过程中加入二氨基乙烷聚丙烯酰胺，作为神经干细胞贴壁培养的微载体，使神经干细胞粘附与微载体表面生长，结合了贴壁培养和悬浮培养的优点于一身，大大提高了神经干细胞的产量和质量，本发明所选择的二氨基乙烷聚丙烯酰胺，与所述培养基中的成分相协调，在培养神经干细胞的应用中，不但可以促进细胞的粘附和增殖，还能有效传递生物活性分子和养分，同时保持神经干细胞的活性。
优选的，所述所述离心转速为1300rmp。
优选的，步骤4)P0代干细胞的培养条件为：37℃、5％CO2的潮湿空气、PH值保持7.3-7.4；第3天换半量培养基，并加入50ug/ml的血清替代物；第6天后每隔两天换新鲜培养基；优选的，所述PH之值2M的NaOH调节，优选的，所述血清替代物为KnockoutTM血清替代物。
经试验发现，在培养中间阶段向培养基中加入50ug/ml的血清替代物，并保持上述PH值的条件下培养神经干细胞，能有效促进细胞生长和增殖，产量可进一步增加。
优选的，所述步骤5)传代神经干细胞的培养条件为：37℃、5％CO2的潮湿空气，第1-2天PH值保持7.05-7.15，第2-3天PH保 持7.15-7.25，所述送气步骤送入气体为5％CO2的潮湿空气，优选的，所述PH之值2M的NaOH调节。
隔天送气，使微载体持续保持悬浮状态，并保证O2和CO2供应量的稳定与新鲜，有利于神经干细胞的粘附和生长，而随着神经干细胞的代谢过程随时调节最佳PH值，是保证细胞存活、良好生长、活性和功能维持的重要条件，经大量实验，总结了上述PH条件下，神经干细胞的生长和存活状况最佳。
优选的，所述所述细胞消化液为含有1.5mg/ml胰蛋白酶和0.1mg/ml EDTA的PBS。
优选的，所述步骤4)中所述的培养皿表面包被鼠尾胶。
进一步的优选，所述培养皿包被鼠尾胶的方法为：采用0.5mg/ml的鼠尾胶去离子水溶液，均匀涂布于培养皿表面，放入37℃、5％CO2的培养箱中包被50min，吸弃溶液后加入无菌水冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗一遍吹干即得。
本发明所述的神经干细胞专用培养基，配方合理有效，能满足神经干细胞生长的营养需求，有效促进神经干细胞的增殖生长的同时，保持神经干细胞的干细胞特性，降低神经干细胞培养过程中分化行为发生概率。
本发明经过大量试验，结合神经干细胞的生长特性与需求，总结出应用上述神经干细胞专用培养基培养神经干细胞的方法，能有效维持神经干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，降低细胞死亡率；在传代细胞培养过程中加入二氨基乙烷聚丙烯酰胺，作为神经干细胞贴壁培养的微载体，使神经干细胞粘附与微载体表面生长，结合了贴壁培养和悬浮培养的优点于一身，大大提高了神经干细胞的产量和质量。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
一种用于神经干细胞专用培养基，所述培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：300μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、5μg/ml N2添加剂、15ng/ml干细胞生长因子、5mg/ml硫代甘油、50ng/ml神经生长因子、0.05mmol/ml乙酰胆碱、10mg/ml羧甲基纤维素钠、0.005mmol/ml维甲酸和0.110mmol/ml叶酸。
实施例2
一种用于神经干细胞专用培养基，所述培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：350μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、8μg/ml N2添加剂、22ng/ml干细胞生长因子、6mg/ml硫代甘油、63ng/ml神经生长因子、0.06mmol/ml乙酰胆碱、18mg/ml羧甲基纤维素钠和0.15mmol/ml叶酸。
实施例3
一种神经干细胞的培养方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件取得离体脑神经组织，用含有5％双抗的PBS缓冲液进行漂洗；
2)将步骤1)所得的脑神经组织切成1mmol3碎块，加入含由0.5mg/mlI型胶原酶、0.5mg/ml IV型胶原酶和0.1mg/ml脱氧核糖核酸I的DMEM/F12培养基，于8℃的CO2培养箱中消化分解20h,得到组织悬液；
3)将步骤2)所得的组织悬液离心，去上层清液，加入DMEM/F12培养基清洗3次，加入细胞消化液，于35℃消化57min,轻轻吹打混匀后终止消化，于DMEM/F12中漂洗，过200-400目细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
4)向步骤3)所得的单细胞悬液中加入所述神经干细胞专用培养基，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于培养皿中，培养12天，得到所述P0代神经干细胞；
5)取步骤4)得到的P0代神经干细胞，加入细胞消化液于37℃消化85s，吹打混匀后，离心10min，弃上清，加入所述神经干细胞专用培养基，使细胞浓度为3×106个/ml，接种培养瓶中，并向培养皿中加入1g/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺，缓慢送气混合均匀，每隔天换一次新鲜培养基的同时缓慢送气混合，培养3-5天，得到传代神经干细胞。
其中，神经干细胞专用培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：450μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、15μg/ml N2培养添加剂、30ng/ml干细胞生长因子、7mg/ml硫代甘油、70ng/ml神经生长因子、0.07mmol/ml乙酰胆碱、25mg/ml羧甲基纤维素钠、0.01mmol/ml维甲酸和0.20mmol/ml叶酸。
实施例4
一种神经干细胞的培养方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件取得离体脑神经组织，用含有5％双抗的PBS缓冲液进行漂洗；
2)将步骤1)所得的脑神经组织切成2mmol3碎块，加入含由0.5mg/ml I型胶原酶、0.5mg/ml IV型胶原酶和0.1mg/ml脱氧核糖核酸I的DMEM/F12培养基，于4℃的CO2培养箱中消化分解24h,得到组织悬液；
3)将步骤2)所得的组织悬液离心，去上层清液，加入DMEM/F12培养基清洗3次，加入细胞消化液，于38℃消化42min,轻轻吹打混匀后终止消化，于DMEM/F12中漂洗，过200-400目细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
4)向步骤3)所得的单细胞悬液中加入所述神经干细胞专用培养基，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于培养皿中，培养10天，得到所述P0代神经干细胞；
5)取步骤4)得到的P0代神经干细胞，加入细胞消化液于37℃消化40s，吹打混匀后，离心6min，弃上清，加入所述神经干细胞专用培养基，使细胞浓度为3×106个/ml，接种培养瓶中，并向培养皿中加入1g/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺，缓慢送气混合均匀，每隔天换一次新鲜培养基的同时缓慢送气混合，培养3-5天，得到传代神经干细胞。
其中，神经干细胞专用培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：350μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、8μg/ml N2添加剂、22ng/ml干细胞生长因子、6mg/ml硫代甘油、63ng/ml神经生长因子、0.06mmol/ml乙酰胆碱、18mg/ml羧甲基纤维素钠和0.15mmol/ml叶酸。
实施例5
一种神经干细胞的培养方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件取得离体脑神经组织，用含有5％双抗的PBS缓冲液 进行漂洗；
2)将步骤1)所得的脑神经组织切成2mmol3碎块，加入含由0.5mg/mlI型胶原酶、0.5mg/ml IV型胶原酶和0.1mg/ml脱氧核糖核酸I的DMEM/F12培养基，于6℃的CO2培养箱中消化分解24h,得到组织悬液；
3)将步骤2)所得的组织悬液离心，去上层清液，加入DMEM/F12培养基清洗3次，加入含有1.5mg/ml胰蛋白酶和0.1mg/ml EDTA的PBS于36℃消化50min,轻轻吹打混匀后终止消化，于DMEM/F12中漂洗，过200-400目细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；其中，所述离心转速为1300rpm；
4)向步骤3)所得的单细胞悬液中加入所述神经干细胞专用培养基，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于培养皿中，并于37℃、5％CO2的潮湿空气、PH值保持7.3-7.4的条件下进行培养；第3天换半量培养基，并加入50ug/ml的KnockoutTM血清替代物；第6天后每隔两天换新鲜培养基；培养11天后得到所述P0代神经干细胞；
5)取步骤4)得到的P0代神经干细胞，加入含有1.5mg/ml胰蛋白酶和0.1mg/ml EDTA的PBS于37℃消化40s，吹打混匀后，1300rpm转速下离心8min，弃上清，加入所述神经干细胞专用培养基，使细胞浓度为3×106个/ml，接种培养瓶中，并向培养皿中加入1g/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺，缓慢送气混合均匀，于37℃、5％CO2的潮湿空气的条件下进行培养；每隔天换一次新鲜培养基的同时缓慢送入5％CO2的潮湿空气进行混合，培养3-5天，得到传代神经干细胞。
其中，神经干细胞专用培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成，所述 溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为：420μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、10μg/ml N2培养添加剂、18ng/ml干细胞生长因子、6mg/ml硫代甘油、60ng/ml神经生长因子、0.06mmol/ml乙酰胆碱、20mg/ml羧甲基纤维素钠和0.13mmol/ml叶酸。
优选的，步骤4)中第1-2天PH值保持7.05-7.15，第2-3天PH保持7.15-7.25；
进一步优选的，所述PH值由2M的NaOH调节。
实施例6
一种神经干细胞的培养方法，与实施例5的区别在于，
进一步的限定了，步骤4)中的培养皿表面包被鼠尾胶，其中，鼠尾胶包被方法为：采用0.5mg/ml的鼠尾胶去离子水溶液，均匀涂布于培养皿表面，放入37℃、5％CO2的培养箱中包被50min，吸弃溶液后加入无菌水冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗一遍吹干即得。
试验1：神经细胞体外增值情况
1)分组
试验组：本发明所述的肝干细胞培养基；
对照组：中国专利申请CN104818245A中所提供的神经细胞培养基；
2)试验方法
体外培养扩增方法，选实施例4所述的方法。
采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，按照实施例4的方法培养扩增肝干细胞，分别统计原代干细胞、第3代、第6代和第9代活神经干细胞的数量，结果见表1。
表1神经干细胞体外培养扩增细胞数量
由表1可以看出，本发明所述的神经干细胞的培养方法可以有效的体外培养神经干细胞，而本发明所提供的肝干细胞专用培养基对肝干细胞的扩增培养非常高效，较对照组有非常显著的差异，另外经台盼蓝经典染色法可测的试验组每次传代后细胞活率都在86％以上，较对照组63％有差异。
试验2：神经干细胞分化状态检测
1)分组
试验组：本发明所述的肝干细胞培养基；
对照组：中国专利申请CN02134313.6中所提供的神经细胞培养基；
2)试验方法
体外培养扩增方法，选实施例4所述的方法。
取按照实施例4的方法培养的P10代神经干细胞，其中，神经干细胞传代时，在培养基中加入Brdu(5μmol/L)。用4％多聚甲醛在室温固定细胞，PBS洗涤三次。对于细胞内抗原的染色，在0.1％Triton X-100中破细胞膜30分钟，接着在5％正常山羊血清孵育30分钟以阻断非特异性结合，一抗孵育2小时，其中一抗使用的主要的抗体是：小鼠单克隆抗-微管蛋白TuJ1(1:750稀释)，用于染神经元； 兔多克隆抗GFAP(1:400稀释)，用于染星形胶质细胞；小鼠单克隆抗O4(1:10稀释)，用于染少突胶质细胞及其前体细胞。用PBS洗三次后，在生物素标记的羊抗鼠IgG二抗中孵育1小时；用PBS洗三次后，在链霉亲和素碱性磷酸酶溶液孵育30分钟；最后用底物BCIP/NBT显示颜色，在倒置显微镜下观察和计数。
表2试验组和对照组神经干细胞分化结果
经试验结果分析可知，试验组95％以上的细胞呈现TuJ1、GFAP和小鼠单克隆抗O4为阴性，而Brdu呈阳性，因而证明使用本发明的选择培养基传代培养的肝干细胞第10代也较少出现分化变性的现象，保持了原代肝干细胞的细胞性状，应用Brdu标记可以进一步说明神经干细胞的分裂增殖能力；而对照组只有56％以上的细胞呈现TuJ1、GFAP和小鼠单克隆抗O4为阴性，传10代后肝干细胞分化相对严重。
试验3：神经干细胞分化行为检测
1)分组
试验组：本发明所述的肝干细胞培养基；
对照组：中国专利申请CN02134313.6中所提供的神经细胞培养基；
2)试验方法
体外培养扩增方法，选实施例4所述的方法。
取按照实施例4的方法培养的P10代神经干细胞，用胰酶消化和胎牛血清终止后分别种植于直径315cm预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用有血清培养基DMEM/F12+5％Fcs进行分化培养，培养24h后采用试验2的方法进行免荧光法检测，检测结果见表3。
表3试验组和对照组神经干细胞分化结果
经试验结果可以知试验组神经干细胞在分化培养条件下，可多向分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，说明本发明所提供的神经干细胞专用培养基和培养方法在对神经干细胞有效扩增的同时，保持了其作为干细胞的特性，维持了其分化潜能；与对照组相比，试验组神经干细胞更易分化为神经元细胞，减弱其在培养过程中自发分化为胶质细胞的倾向。
结论
由上述试验可知，使用本发明所述的神经干细胞培养方法及其专用培养基，可以有效的体外培养神经干细胞，而本发明所提供的神经干细胞专用培养基对神经干细胞的扩增培养非常高效，而且有效保持神经干细胞的干细胞潜能，第10代也较少出现分化变性的现象。