高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法。

背景技术：

视网膜变性疾病是全球首要的致盲原因。在该疾病中，视网膜色素上皮细胞(retina pigmented epithelium,RPE)的损伤和功能异常导致光感受器细胞(photoreceptor)变性，最终影响病人视力直至失明。由于RPE和光感受器细胞的不可再生，至今在临床上缺乏对这类疾病的有效治疗措施。相较于其他治疗方法，细胞治疗对视网膜退行性疾病的治疗有更大的前景。

由于多能干细胞具有无限增殖和分化为各种细胞的能力，因此可以作为理想的移植细胞的来源。已有报道证实胚胎干细胞(ESCs)来源的RPE应用于人类视网膜退行性疾病临床研究的可行性与安全性，尽管病人术后视力与正常生活的要求还有很大差距。那么，一套稳定有效的体外多能干细胞向RPE细胞分化的方法对视网膜退行性疾病的治疗和制药研究显得尤为重要。

在过去的十几年间，多种方法被报道可以控制多能干细胞向RPE细胞分化，并且在多种动物病变模型中发挥保护作用。但是这些方法仍存在若干缺点如耗时长，方法繁琐，批次间差异大和细胞得率低等。

因此，需要一种诱导多能干细胞向RPE细胞分化的方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，本发明的方法不仅可以得到成熟的有功能的视网膜色素上皮细胞，而且方法简单、耗时短、可重复性强且细胞得率高。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，包括以下步骤：

a、将多能干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期换液至细胞达到融合状态；

b、用酶处理多能干细胞成团块并接种到培养皿中，加入添加有200ug/ml Matrigel的第一诱导分化培养基培养两天，更换无Matrigel添加的第一诱导分化培养基继续培养5天；

c、在分化第8天更换第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液至细胞分化形成大量的色素细胞；

d、用酶处理分化细胞成团块并悬浮培养，1天后进行挑选分离，收集黑色的细胞悬球；

e、将黑色细胞悬球接种于培养皿中，加入第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液便可得到成熟的视网膜色素上皮细胞。

优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)或诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。

优选地，步骤a中所述饲养层细胞为X射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞，所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml，所述达到融合状态为每天换液至细胞达到80％～90％的融合。

优选地，步骤b中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述第一诱导分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。

优选地，步骤c中所述第二诱导分化培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积分数为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基 乙醇浓度为0.1mmol/L；所述形成大量的色素细胞为隔天换液至分化40天，培养皿中出现大量单层的色素细胞。

优选地，步骤d中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理20分钟并用移液器机械吹打；所述悬浮培养为将细胞团块接种到不贴壁的细胞培养皿中培养；所述挑选分离为：由于细胞悬球主要包括黑色与白色两种，根据颜色进行分离挑选。

优选地，各步骤中所述培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行。步骤b或/和步骤e中所述培养皿为有100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿。步骤c或/和步骤e中所述定期换液为隔天换液。步骤e中所述成熟的色素上皮细胞为具有鹅卵石样形态，色素积累的单层细胞。

目前文献报道的体外诱导hESCs向RPE分化的方法不仅耗时长(8周到数月不等)，而且获得的RPE细胞往往有其它分化细胞混合，需要人工挑取含有色素的RPE细胞进行RPE的纯化。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明方法未添加任何分子刺激诱导分化，避免外源添加分子可能引入污染的风险，减少批次之间的差异，提高实验的重复性。

2、本发明在体外严格模拟体内眼球发育的过程，自发的分化为RPE细胞。

3、本发明通过采用培养方法以及胞外基质的改变实现定向自发分化，而传统自发分化的方法，因非定向分化则得到的细胞种类多样，分化时间长且目的细胞少，因此本发明方法简单、快捷，并且由于本发明后期可根据颜色简单富集黑色细胞悬球，无杂细胞的污染，最终得到百分百色素上皮细胞，因而细胞得率高。通过该方法可获得高纯度和大量的成熟且有功能的RPE细胞。

附图说明

图1为本发明人ESCs分化2天形成类似神经上皮及荧光鉴定的示意图；

图2为本发明人ESCs分化7天形成类似眼区及荧光鉴定的示意图；

图3为本发明人ESCs分化14天形成类似视囊及荧光鉴定的示意图；

图4为本发明人ESCs分化40天出现大量色素细胞的示意图；

图5为本发明黑色细胞悬球在悬浮培养分离前后的示意图；

图6为本发明黑色细胞悬球贴壁后生长及形成成熟RPE的示意图；

图7为本发明的多能干细胞来源的RPE细胞染色及功能鉴定的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

本实施例为高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的方法。

本实施例中，所述多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞，均能利用本方法实现发明目的。

本实施例中，所述诱导分化包括如下步骤：

a.将多能干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期换液至细胞达到融合状态；

本步骤中所述多能干细胞为第50代人胚胎干细胞；所述饲养层细胞为X射线处理小鼠胚胎成纤维细胞；所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml；所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行；所述定期换液为每天换液；所述达到融合状态为每天换液至细胞达到80％～90％的融合。

b.用酶处理干细胞成团块并接种到培养皿中，加入添加有200ug/ml Matrigel的第一诱导分化培养基培养两天，更换无Matrigel添加的第一诱导分化培养基继续培养5天；

本步骤中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述培养皿为100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿；所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行；所述第一诱导分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。该诱导分化方法在添加200ug/ml Matrigel的第一诱导分化培养基中分化两天可得到囊泡样的极性神经上皮样结构，通过免疫组化鉴定表达ZO-1，N-cadherin和Sox-2，如图1；继续培养5天细胞开始表达眼区相关基因Pax6和Rax，如图2。

c.在分化第8天更换第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液至细胞分化形成大量的色素细胞；

本步骤中所述第二诱导分化培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积分数为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行；所述定期换液为隔天换液；该诱导分化方法在分化第14天已经鉴定分化细胞表达视囊相关的基因Vsx2和MITF，如图3；所述形成大量的色素细胞为在分化40天左右培养皿中已经出现大量单层的色素细胞如图4。

d.用酶处理分化细胞成团块并悬浮培养，一天后可进行挑选分离，收集黑色的细胞悬球；

本步骤中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理20分钟并用移液器机械吹打；所述悬浮培养为将细胞团块接种到不贴壁的细胞培养皿中培养；所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行；所述挑选分离为由于细胞悬球主要包括黑色与白色两种，可以根据颜色进行分离挑选，如图5。

e.将黑色细胞悬球接种于培养皿中，加入第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液便可得到成熟的色素上皮细胞。

本步骤中所述培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行；所述培养皿有100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿；所述定期换液为隔天换液；所述成熟的色素上皮细胞为具有鹅卵石样形态，色素积累的单层细胞。该诱导方法将黑色细胞悬球贴壁培养两周后即可得到成熟的色素上皮细胞，如图6。

进一步对人ESCs分化来源的RPE细胞进行免疫组化鉴定，发现hESC-RPE细胞表达成熟的RPE细胞相关蛋白Bestrophin，ZO-1和RPE65，进一步检测其功能发现分化的细胞具有吞噬外节的能力，如图7。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。