一种检测阴沟肠杆菌O12型的引物及方法与流程

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及一种检测阴沟肠杆菌O12型的引物及方法。
背景技术：
：阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)作为一种革兰氏阴性粗短杆菌，广泛存在于自然界中，在土壤、植物、昆虫及人和动物的粪便中均可检出，是人和动物肠道正常菌种之一，同时它也是一种重要的条件致病菌。近年来，由于第三、四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，该菌的耐药菌株日益增多，使得临床上对该菌引起的感染性疾病的治疗趋于复杂化。耐药菌株的出现的主要原因是未能在第一时间辨明病原菌，在不明病原菌的情况下，滥用药物。80年代以来，陆续有文献报道了对阴沟肠杆菌进行血清型分型、噬菌体分型、细菌素分型，以及生物型分型等手段。但以上分型方法只能联合使用，由于单独使用一种方法分型的重现性不理想和分型能力弱，不能很好地将阴沟肠杆菌进行准确分型。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，识别病原体，从而进行针对性治疗。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种针对阴沟肠杆菌O12型的检测引物及方法。该方法可用于阴沟肠杆菌O12型的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性强。本发明的技术目的是通过以下的技术方案实现的。一种检测阴沟肠杆菌O12型的引物，由正向引物5’—CGTTCGCAGAATACAGAG—3’和反向引物5’—TCAAAGCAAACAGGGAGT—3’组成。即序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的核苷酸序列。上述引物在检测阴沟肠杆菌O12型中的应用，即检测阴沟肠杆菌O12型的方法，首先提取待检测样品的DNA，并以样品DNA为模板，利用由正向引物5’—CGTTCGCAGAATACAGAG—3’和反向引物5’—TCAAAGCAAACAGGGAGT—3’ 组成的引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品中是否含有阴沟肠杆菌O12型。在上述的检测方法中，若电泳结果在723bp位置出现单一条带，则说明样品中含有阴沟肠杆菌O12型；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌O12型。在上述检测方法中，在上述检测方法中，进行PCR扩增的反应体系为30μL的反应体系，具体为：10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL；2.5mmol/L的dNTP1μL；Taq酶1.5-2.25U；10μmol/L的引物(即检测阴沟肠杆菌O12型的引物，由正向引物5’—CGTTCGCAGAATACAGAG—3’和反向引物5’—TCAAAGCAAACAGGGAGT—3’组成的引物对)0.1-0.3μL；10-300ng/μL的样品DNA(即模板DNA)1μL；最后用灭菌超纯水补至30μL。在上述检测方法中，进行PCR扩增时，PCR反应程序为：95℃5min，1个循环；94℃30s,58℃-65℃45s,68℃1min，共35个循环；72℃7min，1个循环；4℃保存。在上述检测方法中，10μLPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，在检测时从PCR扩增产物中进行取样检测，即PCR扩增的反应体系为PCR检测体系。与现有技术相比，本发明具有如下优点：采用本发明的检测方法检测阴沟肠杆菌O21型所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时，本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用，一般基层实验室即可开展检测工作，实用性更强。本发明所检测的靶点具有单一性，检测结果特异，易于判定。附图说明图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图。图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆，实验室手册(NewYork:ColdSpringHaborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验试剂蒸馏水Milli-Q系统，MilliporeCo.,USA10×PCRBuffer(含Mg2+)宝生物工程(大连)有限公司2.5mmol/L的dNTP宝生物工程(大连)有限公司Taq酶宝生物工程(大连)有限公司DL1000分子量标准宝生物工程(大连)有限公司100bpDNALadder分子量标准宝生物工程(大连)有限公司1％琼脂糖凝胶GenviewCo.,USA实验仪器恒温摇床上海世平实验设备有限公司分光光度计德国Eppendorf公司，BioPhotometer凝胶成像系统上海Tanon公司,GIS2010超纯水仪MilliporeCo.,USA离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司公司H1650-W实验菌种菌名来源菌种原始编号阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO12株NCTC11581阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO21株NCTC11590阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO20株NCTC11589大肠杆菌EscherichiacoliO157株CMCC44752-5沙门氏菌SalmonellatyphiO67株CMCC50071-9痢疾志贺氏菌ShigelladysenteriaeO1株CMCC51491鲍氏志贺氏菌ShigellaboydiiO2株CMCCC2CMCC：中国医学微生物菌种保藏管理中心，即中国医学细菌保藏管理中心，北京市东城区天坛西里2号；NCTC：NationalCollectionofTypeCultures,CentralPublicHealthLaboratory,London,UnitedKingdom英国国立标准菌种收藏中心。步骤一，设计针对阴沟肠杆菌O12型的特异性引物对，并由Invitrogen英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。正向引物5’—CGTTCGCAGAATACAGAG—3’和反向引物5’—TCAAAGCAAACAGGGAGT—3’组成。步骤二，DNA模板制备将阴沟肠杆菌O12型接种于5mL营养肉汤液体培养基(制备方法参考J.Sambrook 等《分子克隆实验指南(第二版)》909页)中，于35℃恒温摇床中震荡培养12h增菌后，取1mL菌液，放入1.5mL无菌离心管中；12000r/min离心15min，弃尽上清液，加入500μL灭菌超纯水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，12000r/min离心15min，弃尽上清液，收集细菌；加入100μL灭菌超纯水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，置于沸水中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。随后35℃解冻，12000r/min离心15min，取上清液放置4℃备用或-20℃保存。步骤三，阴沟肠杆菌O12型特异性PCR检测方法建立PCR检测体系为30μL(即进行PCR扩增的反应体系)，反应体系具体为：10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL，2.5mmol/L的dNTP1μL，Taq酶1.5U,10μmol/L的引物对(即检测阴沟肠杆菌O12型的引物，由正向引物5’—CGTTCGCAGAATACAGAG—3’和反向引物5’—TCAAAGCAAACAGGGAGT—3’组成的引物对)0.3μL,100ng/μL的模板DNA1μL，最后用灭菌超纯水补至30μL；PCR检测反应程序为：95℃5min，1个循环；94℃30s,58℃-65℃45s,68℃1min，共35个循环；72℃7min，1个循环；4℃保存。步骤四，PCR扩增结果凝胶电泳判定所述判定方法具体为：取10μLPCR扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯照射下观察电泳结果，若在723bp位置出现单一条带，则说明样品中含有阴沟肠杆菌O12型；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌O12型。PCR检测方法特异性评估实验按上述DNA模板制备与PCR检测方法，对保存的阴沟肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌进行PCR扩增反应，并对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，特异性检测结果见图1。图中：泳道M为DL1000分子量标准；泳道1为模板为灭菌超纯水的阴性对照；泳道2-8分别为阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO12株、阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO20株、阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO21株、大肠杆菌EscherichiacoliO157株、沙门氏菌SalmonellatyphiO67株、痢疾志贺氏菌ShigelladysenteriaeO1株、鲍氏志贺氏菌ShigellaboydiiO2株。图1中电泳结果为只有阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO12株在723bp处出现特异条带，而其他菌种未出现特异条带。PCR检测方法灵敏度评价实验PCR检测方法的灵敏度通过每个反应中能检测到的最低DNA质量来表示(即在进行PCR扩增后反应体系中样品DNA的质量)。取纯培养物的基因组DNA提取液，用分 光光度计测定DNA浓度，以灭菌超纯水进行不同倍数的梯度稀释(即浓度稀释)，得到1000ng/μL,100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL梯度的DNA(即阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeO12株)，将上述不同浓度的DNA在相同条件下进行PCR扩增(以1μL梯度稀释液为模板进行PCR扩增)，凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察凝胶电泳结果，如图2所示。图2中：泳道M为DL1000分子量标准；泳道1-4为阴沟肠杆菌O12型模板量1000ng、100ng、10ng、1ng的PCR扩增结果。由图2可知，本发明的检测方法可检测的最低DNA模板量为10ng，具有较好的灵敏度。临床疑似菌株检测利用上述方法建立的阴沟肠杆菌O12型特异性PCR检测方法对从临床分离到的2株疑似菌株进行检测。检测结果见图3，图中泳道M为100bpDNALadder分子量标准；泳道1为阴沟肠杆菌O12型阳性对照，泳道2-3为2株疑似菌株，泳道4为模板为灭菌超纯水的阴性对照。图中可知，泳道2对应的1号疑似菌株呈阳性结果。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。当前第1页1 2 3