具有ACC1蛋白调控作用的五环三萜类化合物及其用途的制作方法

本发明属于药学领域；更具体地，本发明涉及具有ACC1蛋白调控作用的五环三萜类化合物及其用途及其在制备抗肿瘤的药物中的用途。

背景技术：

近20多年来，世界上多数国家结直肠癌(主要是结肠癌)发病率呈上升趋势。随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势影响，我国结直肠癌发病人数和死亡人数也呈增长态势。据统计，我国每年新发病例已超过17万，是我国发病率排第四位的恶性肿瘤性疾病。结直肠癌的中位发病年龄在中国比欧美提前约十年，青年患者比欧美多见，这是结直肠癌在中国的一个特点。结直肠癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是遗传因素、环境因素、免疫因素等综合作用的结果。

11羰基-β-乙酰乳香酸的英文全名是：Acetyl-11-keto-β-boswellic acid，简称AkβBA或AKBA，其具有如图1A的结构式。是植物卡式乳香树的胶状树脂-乳香含有的重要成份之一。从天然乳香树提取物中富集纯化AKBA已经描述于国际专利申请WO 03/0746，美国专利20030199581以及国际专利申请WO 03/077860中。更高纯度的产品可以通过色谱分离以及重结晶的方法而获得。

乳香提取物已经在传统的医药中被用作抗炎剂，如对关节炎以及溃疡性结肠炎患者的治疗。另外乳香酸由于其抗增殖作用而受到关注，乳香酸在体外可以抑制几种白血病细胞株，黑素瘤的生长并促进细胞凋亡。但是，现有的乳香酸的抗增殖作用还有待提高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供具有ACC1蛋白调控作用的五环三萜类化合物及 其用途及其在制备抗肿瘤的药物中的用途。

在本发明的第一方面，提供式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗肿瘤的药物；

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。

在一个优选例中，式(I)所示化合物中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。

在另一优选例中，所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐通过靶向结合ACC1蛋白，调控ACC1蛋白功能，抑制肿瘤的生长。

在另一优选例中，所述的肿瘤是ACC1过表达或过度活化的肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：结肠癌，淋巴癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌。

在另一优选例中，所述的式(I)化合物通过以下方法制备：以11羰基-β-乙酰乳香酸为原料，将其AcO-基团替换为基团。

在另一优选例中，所述的式(I)化合物通过以下方法制备：

(i)以11-羰基-β-乙酰乳香酸为原料，与碱反应获得11-羰基-β-乳香酸；和

(ii)将11-羰基-β-乳香酸与环己甲酰氯反应，获得式(I)所示化合物。

所述的碱包括但不限于：有机碱，例如三乙胺、三丁胺、N-甲基吗啉、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吡咯烷、吡啶、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶、吗啉、咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑等；无机碱，例如碱金属氢化物如氢 化钠、氢化钾等；氨基钠；正丁基锂；二异丙基氨基锂；碱金属氢氧化物例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铯；碱土金属氢氧化物例如氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化钙等；碱金属碳酸盐例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、碳酸铯等；碱土金属碳酸盐例如碳酸镁、碳酸钙等；碱金属碳酸氢盐例如碳酸氢钠、碳酸氢钾等；离子交换树脂，包括与离子例如钠离子、钾离子、锂离子、钙离子、镁离子、取代的或未取代的铵离子等结合的树脂；以及其他适合的碱。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(i)包括：在双口瓶中加入acetyl-11-keto-β-boswellic acid(简称AKBA)和氢氧化钾(KOH)，在氮气保护下加入异丙醇作为溶剂；加热回流反应，待反应体系冷却到室温，使用旋转蒸发仪旋干溶剂，得到白色固体，加入二氯甲烷后加入稀盐酸调节混合体系pH值至酸性；用二氯甲烷萃取水相，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂得到棕色油状产物，使用石油醚：乙酸乙酯作为洗脱剂，用柱层析法提纯，得到白色固体11-羰基-β-乳香酸(简称KBA)；步骤(ii)包括：将KBA溶于二氯甲烷(含有4-二甲基吡啶)，加入三乙胺和环己基上取代或非取代的环己甲酰氯，冰浴过夜；反应完全后，用碳酸氢钠溶液处理，并用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥混合物，旋干溶剂得到白色固体。用石油醚：乙酸乙酯作为洗脱剂，用柱层析法提纯，得到酰化产物3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid(简称CKBA)。

在本发明的另一方面，提供式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备靶向结合ACC1蛋白和调控ACC1蛋白的组合物；

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4 链炔基、卤素。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物包含：式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体；

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。

在一个优选例中，所述的药物组合物中，所述的药学上可接受的载体是羧甲基纤维素钠和水混合获得的混悬液。

在本发明的另一方面，提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐；

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：AKBA和CKBA结构式。

A，AKBA结构式；

B，CKBA结构式(式(II)化合物)。

图2：CKBA及AKBA对多种人结肠癌细胞株生长抑制效果。

A-B，CKBA及AKBA对人结肠癌细胞株HCT116的抑制效果；

C-D，CKBA及AKBA对人结肠癌细胞株Lovo的抑制效果；

E-F，CKBA及AKBA对人结肠癌细胞株HT29的抑制效果；

G-H，CKBA及AKBA对人结肠癌细胞株SW480的抑制效果。

图3：CKBA显著抑制肠炎相关结肠癌模型中结肠肿瘤的生长。

A，给予CKBA治疗的小鼠的结肠部位照片；

B，给予CMC-Na的小鼠的结肠部位照片；

C，分别给予CKBA及CMC-Na的小鼠结肠中的肿瘤大小；纵坐标是肿瘤大小的评分。

D，分别给予CKBA及CMC-Na的小鼠结肠中的肿瘤负荷(所有肿瘤大小评分相加后得到的值，为肿瘤大小和个数的综合评分)。

图4：CKBA显著抑制结肠癌皮下移植瘤的生长。

图5：AKBA和CKBA的生物素标记。

图6：AKBA和CKBA共同作用靶点ACC1(其编码基因为ACACA)的鉴定。

A，SDS-PAGE分析和银染结果；

B，银染差异条带质谱打分结果(部分)。

图7：蛋白免疫印迹实验显示AKBA和CKBA作用于ACC1。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种新的五环三萜结构修饰化合物，其能够有效地治疗肿瘤如结肠癌，通过靶向结合ACC1蛋白来发挥抗肿瘤的作用。在此基础上完成了本发明。

术语

本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。

本文所用的术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。

本文所用的术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。

本文所用的术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。

本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。

本文所用的的表示方法是本领域人员熟知的，其表示基团R可以取代在环上的任意一个或多个可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R的选择可以是不同的。

本文所用的术语“溶剂合物”表示携带有溶剂分子的化合物，例如，所述的溶剂合物可以是水合物。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含 有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(I)化合物、异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

如本发明所用，所述的“ACC1表达或过表达相关的肿瘤”是指一类肿瘤，该类肿瘤的生长必需依靠ACC1表达或过表达，抑制该类肿瘤中ACC1的表达或活性可使得肿瘤的生长受到抑制甚至凋亡。

化合物

本发明人在11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)基础上进行结构修饰，获得了经修饰的五环三萜结构化合物，相较于AKBA，该经修饰的五环三萜结构化合物的体外抑制人结肠癌细胞增殖的能力显著性增强。并且，该经修饰的五环三萜结构化合物具有卓越的体内抑制肠炎相关结肠癌模型和人结肠癌肿瘤移植模型肿瘤生成能力。

基于本发明人的新发现，首先提供了一种如结构式(I)所示的化合物：

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。较佳地，R独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。

本发明还包括上述式(I)化合物的异构体、溶剂合物、前体，或它们的药 学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)化合物具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。

作为本发明的一种优选方式，所述的化合物具有式(II)所示的结构。

式(II)化合物的英文名为3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid，简称CKBA。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，提供了一种制备本发明的式(I)所示的化合物的方法，所述方法包括：以11羰基-β-乙酰乳香酸为原料，将其AcO-基团替换为基团。更佳地，制备步骤包括：(i)以11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA) 为原料，与碱(如KOH)反应获得11-羰基-β-乳香酸；和(ii)将11-羰基-β-乳香酸与环己甲酰氯反应，获得式(I)所示化合物。其它的制备式(I)化合物的方法也被包含在本发明中，例如可以以11-羰基-β-乳香酸(KBA)为原料，使其与环己甲酰氯反应直接获得式(I)所示化合物。

合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。

用途

本发明人在研究中发现，相比于11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)，本发明的式(II)化合物具有更显著的抑制结肠癌细胞分裂、增殖能力的作用，对于肠炎相关结肠癌模型和皮下移植瘤模型有显著的治疗作用。

另外，本发明人还发现，本发明的式(II)化合物和AKBA均靶向作用于ACC1蛋白。通过使用生物素(biotin)标记的AKBA和其修饰物，结合使用链霉亲和素(streptavidin)琼脂糖微球从结肠癌细胞株中“钓取”直接作用靶蛋白的方法，本发明人发现AKBA和其结构修饰物主要通过直接作用于乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl CoA carboxylase 1，简称ACACA或ACC1)基因发挥治疗肿瘤作用。这是首次在肿瘤细胞中明确AKBA和其结构修饰物的共同直接作用靶点。

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase)分为ACC1(ACC-α)和ACC2(ACC-β)两亚型，分子量分别为265kD、280kD，广泛存在于生物界。ACC1主要表达在产生脂肪的组织，如肝脏和脂肪细胞，而ACC2主要在耗氧组织或细胞中表达，如心脏和肌肉细胞。由于ACC1调控脂肪酸的代谢，所以被认为是治疗代谢综合症和多种肿瘤的靶点。研究表明：靶向ACC1，可以抑制多种肿瘤干细胞的生长。

ACC1是长链脂肪酸生物合成反应中限速步骤催化酶，其缺失可以导致一些肿瘤细胞系的生长受到抑制甚至凋亡，通过化学抑制剂的方法抑制ACC1的功能还可以抑制肿瘤干细胞的自我更新。因此，本发明的化合物通过靶向结合ACC1蛋白，调控ACC1蛋白功能，抑制肿瘤的生长。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了式(I)所示的化合物或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗 肿瘤的药物。所述的肿瘤较佳地是ACC1过表达或过度活化的(或导致的)肿瘤，例如结肠癌，淋巴癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌等。

在本发明的具体实施例中，通过体外试验，利用本发明所述的式(I)所示化合物对四种人结肠癌细胞系：HCT116、Lovo、HT29和SW480进行了效果验证，结果本发明的化合物显示出比AKBA更好的抑制肿瘤细胞生长的作用。

在本发明的另一具体实施例中，还利用所述的式(I)所示化合物进行了体内试验，验证其对肠炎相关肠癌模型中结肠肿瘤的生成的影响。结果，本发明所述的式(I)化合物显示出与溶剂对照组相比更显著的抑制作用。

在本发明的另一具体实施例中，还利用所述的式(I)所示化合物进行了体内试验，验证其对HCT116结肠癌细胞皮下移植瘤的生长。结果，本发明所述的式(I)化合物显示出和溶剂对照组相比更显著的抑制作用。

基于本发明人的上述新发现，本发明还提供一种治疗肿瘤(如结肠癌等ACC1过表达或过度活化相关的肿瘤)的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐。

药物组合物

本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，含有：(a)有效量的式(I)所述的化合物、或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明中，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.01-5％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。较佳的，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.03-3％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐；更佳地，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.05-1％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的。比如可选自：溶液、悬浮液、片剂、胶囊、粉末、颗粒或糖浆。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。

式(I)化合物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.05-500mg/kg，较佳地0.1-300mg/kg，更佳地1-200mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：式(II)化合物(CKBA)的制备及鉴定

在100毫升双口瓶中加入8克acetyl-11-keto-β-boswellic acid(简称AKBA)和2.63克氢氧化钾(KOH)，在氮气保护下加入异丙醇50毫升作为溶剂。加热回流反应约6小时，待反应体系冷却到室温，使用旋转蒸发仪旋干溶剂，得到白色固体，加入30毫升二氯甲烷后加入稀盐酸调节混合体系pH值至酸性。用二氯甲烷萃取水相3次(3*15毫升)，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂得到棕色油状产物，使用石油醚：乙酸乙酯(90：10)作为洗脱剂用柱层析法提纯，得到白色固体KBA 5.8g，产率约为78％。将1克KBA溶于10毫升二氯甲烷(含有2mol％4-二甲基吡啶)，加入1.5当量的三乙胺和1.2当量的环己甲酰氯，冰浴过夜。反应完全后，用10％的碳酸氢钠溶液处理，并用二氯甲烷萃取3次(3*10毫升)，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥混合物，旋干溶剂得到白色固体。用石油醚：乙酸乙酯(90：10)作为洗脱剂，用柱层析法提纯，得到酰化产物3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid 4g，产率约为55％。

取一定量的式(II)的化合物进行核磁、质谱分析得其分子式为C₃₇H₅₆O₅，分子量为581，如图1。

实施例2：式(II)的化合物的羧甲基纤维素钠混悬液的制备

(1)混悬液1

取一定量羧甲基纤维素钠(简称CMC-Na)用双蒸水溶解过夜制备成0.3％(g/ml)的CMC-Na溶液。将此溶液加入一定量的CKBA粉末制备成5mg/ml的混悬液，可以简单超声辅助CKBA分散。

(2)空白混悬液

取一定量羧甲基纤维素钠(简称CMC-Na)用双蒸水溶解过夜制备成0.3％(g/ml)的CMC-Na溶液作为空白混悬液。该空白混悬液作为动物实验中的对照。

实施例3：体外抑制人结肠癌细胞生长的实验

取对数生长期的人结肠癌细胞株HCT116、Lovo、HT29和SW480(购自ATCC)种96孔板，每孔1.5×10⁴个细胞，分别加入呈梯度浓度(1，5，10，20，25，30，35，50，100μM)的CKBA和AKBA，总体积为100微升，对照组加入终浓度为0.5％的DMSO，空白对照孔仅加入100微升培养基，每组均设三个复孔。细胞培养箱培养24小时后，每孔加入CCK-8溶液10微升，将培养板放置于培养箱(37℃，5％CO₂条件下)避光孵育4小时后取出。酶标仪测定450nm波长处的O.D.值。计算抑制率：抑制率＝【1-(实验组O.D.值/对照组O.D.值)】×100％。

结果如图2，式(II)化合物(CKBA)及AKBA均能够抑制结肠癌细胞分裂、增殖。两者相比较，式(II)化合物(CKBA)比AKBA能更加有效地抑制结肠癌细胞。CKBA在较低浓度(20-25μM)下完全抑制人结肠癌细胞的生长，而AKBA则需要在100μM浓度下才能达到相同效果，故CKBA体外抑制结肠癌细胞生长的活性显著地优于AKBA。

实施例4：体内抑制肠炎相关结肠癌肿瘤生长的实验

建立AOM/DSS结肠癌肿瘤动物模型。取6-8周龄的C57BL/6小鼠10只，第1天每只小鼠腹腔注射AOM 1mg/ml 200μl，第6-10天连续喂含2.5％DSS的水5天，第11-26天换成普通水喂，第27-31天再次连续喂含2.5％DSS的水5天，第32-47天换成普通水喂，之后第48-49天第三次喂含2.5％DSS 的水2天，再换成普通水喂第50-56天。第50-56天给治疗组5只小鼠每只每天腹腔注射5mg/ml CKBA的CMC-Na混悬液200μl，对照组5只小鼠每只每天腹腔注射空白混悬液200μl。第57天处死小鼠，取结肠拍照，记录结肠部位肿瘤的数量和大小。

结果如图3A-D。CKBA治疗组小鼠结肠部位肿瘤的个数明显少于对照组小鼠，并且肿瘤的大小也明显小于对照组。

实施例5：体内抑制结肠癌细胞皮下移植瘤的实验

培养HCT116细胞，用0.5％胰酶消化后离心，重悬于无菌的PBS中，对细胞计数，稀释细胞至浓度为2.8×10⁸个/ml。对12只裸鼠每只裸鼠的腋下通过皮下注射细胞悬液100ul，记为实验开始第一天。第5-16天实验组6只裸鼠腹腔注射5mg/ml CKBA的CMC-Na混悬液200μl，对照组6只裸鼠每只每天腹腔注射空白混悬液200μl，两组裸鼠均使用游标卡尺测量肿瘤大小并记录。第17天处死裸鼠，拍照，取肿瘤和脾脏拍照并称重记录。

结果如图4。CKBA治疗组裸鼠的皮下肿瘤大小明显小于对照组裸鼠，表明CKBA对结肠癌细胞皮下移植瘤具有显著治疗作用。

实施例6：在细胞中钓取蛋白靶点的试验

人结肠癌细胞HCT116先和AKBA和CKBA孵育1小时，再加入biotin标记的AKBA和CKBA(结构如图5)继续孵育1.5小时。细胞用PBS洗两遍，RIPA裂解细胞后离心得到蛋白上清。加入预先洗好的琼脂糖微球，在摇床上孵育1小时。洗微球6遍后加入蛋白上样缓冲液95℃煮10分钟。样品用SDS-PAGE分离，银染显色(如图6A)后割取差异条带，LC/MS/MS ESI-MicroTOF-QII质谱分析(如图6B)。

分析结果显示，ACC1蛋白评分最高，为AKBA和CKBA在结肠癌细胞中潜在直接作用靶点。

实施例7：蛋白免疫印迹实验验证AKBA和CKBA作用于ACC1

已变性的各组蛋白样品在SDS-PAGE胶中加入相同体积，跑胶后通过湿转将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜，膜室温封闭2小时后， 和ACC1的一抗4℃孵育过夜，TBST洗3遍后和对应二抗室温孵育2小时，TBST再洗3遍后加入ECL显色液显色拍照。

结果如图7，biotin对照组中没有ACC1蛋白条带，biotin-AKBA和biotin-CKBA组中都显示明显的ACC1蛋白条带，相应的AKBA和CKBA竞争组中ACC1条带明显变弱，说明AKBA和CKBA对biotin标记的化合物结合ACC1有竞争作用。进一步说明AKBA和CKBA作用于ACC1。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。