本发明属于生物技术领域，涉及两株土壤有益菌及其酶，菌株为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri JF-1）和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens JF-2)。
背景技术：
狭义的生物肥料，是通过微生物生命活动，使农作物得到特定的肥料效应的制品，也被称之为接种剂或菌肥，它本身不含营养元素，不能代替化肥。广义地生物肥料称之为生物有机肥，是既含有作物所需的营养元素，又含有微生物的制品，是生物、有机、无机的结合体它可以代替化肥，提供农作物生长发育所需的各类营养元素。
目前，国内液体肥生产，实际上是微生物菌剂的水溶肥。而普遍采用固体堆肥发酵罐方法生产生物有机肥，是在人工控制下，在一定的温度、湿度、碳氮比和通风条件下，利用自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物的发酵作用，人为地促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质生化转化的微生物学过程，即人们常说的有机肥腐熟过程。现代化堆肥发酵罐工艺基本都是好氧堆肥，这是因为好氧堆肥具有温度高、基质分解比较彻底、堆制周期短、异味小、可以大规模采用机械处理等优点。我国已获得国家批准登记的微生物肥料有100余种，全国微生物肥料企业总数约950个，年产量1000万吨，年产值已达150亿元。但由于科研投入严重不足，技术力量相对滞后于市场需求，导致若干类微生物肥料产品发酵生产过程的质量监控指标设置不尽合理，对产品稳定性和大田应用效果无法把控。农业“回归有机肥”，仍然任重而道远。虽然我国针对生物肥料（微生物肥料）的研发、产品质量、推广应用等方面非常重视，监管方面实行生产许可制度并由农业部审核并发放。但随着生物肥料的发展，不少地方在生产生物肥料时出现了无生产许可证、生产工艺落后、用未通过鉴定的菌种进行生产、有效菌含量低、杂菌超标等现象。还有些厂家在生物肥料中加入不适量的化肥或其它添加剂，使肥料中化肥的氮、磷、钾含量过高导致有效菌死亡，而失去生物肥的作用。
技术实现要素：
本发明通过土壤-植物-大气系统研究有益微生物，从根际土壤中分离出三株以上有益微生物菌剂，目的是将在土壤内自然生成促进植物生长的微生物生长环境和抑制或减少有害病原菌对植物的侵害有决定性意义的的三株菌，在自制反应釜设备在适宜环境温度和供氧的条件下，通过适宜的营养元素和C:N基质（马粪或牛粪）培养，生成液体生物肥。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
本发明提供两株土壤有益菌，保藏编号为JF-1和JF-2，其基因序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
本发明提供三株土壤有益菌用于制备液体生物肥的酵剂，其中的JF-1、JF-2、菌的活菌数均为109～1010CFU/ml。
本发明的三株土壤有益菌剂加入以牛粪或马粪的基质后，通过自制反应釜设备在适宜环境温度和供氧的条件下生成的液体生物肥中JF-1和JF-2的活菌数分别为107～108CFU/ml。
JF-1和JF-2的发酵培养基牛粪或马粪由以下成分组成：
牛粪、马粪营养元素含量（一般情况）
牛粪或马粪的C:N 为30-50:1作为JF-1和JF-2的培养基是最适宜的。
本发明中JF-1和JF-2菌的发酵的环境条件为：自制反应釜内筒培养基（牛粪或马粪）体积0.5m3,外筒水体积1.5m3;发酵环境温度为30-40℃;发酵时间为12-30h；初始pH值为6.5-7.5；初始接种量为1-3%，通气量40.0L(L/min）。
优化工艺：发酵环境温度35℃；pH值为7.0；初始接种量为2%；通气量40.0L(L/min）；发酵时间27h（稳定期）。
有益效果
本发明生成的液体生物肥，施入土壤后促进固氮菌类生长成为较强的固氮体系；
本发明有利于释放难溶矿质中的营养元素菌类生长；
本发明有利于提高植物的抗逆性菌类生长；
本发明有利于降解污染物，减少毒性菌类生长；
本发明有利于促进腐质酸的形成菌类生长；
本发明有利于产生植物激素菌类生长；
本发明有利于生防菌类生长。
本发明的三株土壤有益菌JF-1、JF-2、JF-3作为发酵剂，对牛粪或马粪进行处理，增加植物对牛粪或马粪中营养元素的有效吸收。
附图说明
图1是液体生物肥试验田和对照田大白菜播种10天后的对照图；图的上方是液体生物肥试验田，图的下方是对照田
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的生物液体肥料的制备工艺和应用进行详述，所述说明是描述性的，并不限制本发明的保护范围。
实施例1 两种菌的高密度发酵及液体复合微生态制剂的制备
1、施氏假单胞菌高密度发酵液的制备：1）平板培养复壮：将施氏假单胞菌菌种接种于LB平板培养基上，于30℃培养18h，使施氏假单胞菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，30℃培养24h；2)一级种子的制备：将步骤1）培养的施氏假单胞菌菌种转接茄子瓶LB斜面培养基上，30℃培养16h，使处于对数后期，得一级种子；3）二级种子的制备：将步骤2）制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有60L LB种子培养基的100L种子罐中，温度30℃，转速250rpm，罐压0.05MPA，通风比：1：0.6，培养146,得二级种子液。4）施氏假单胞菌发酵液的制备：将步骤3）制备的二级种子液按照5%的接种量接种到10m3发酵培养基的发酵罐中，温度30℃，转速200rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1：0.6，培养16h，活菌数为3.2×109CFU/ml的施氏假单胞菌发酵液；所述的发酵培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g、氯化钠10g,去离子水1000ml,pH为7.0。2、解淀粉芽孢杆菌高密度发酵液的制备：1）平板培养复壮：将解淀粉芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于30℃培养24h，使解淀粉芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，30℃培养24h；2)一级种子的制备：将步骤1）培养的解淀粉芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养基上，37℃培养24h，使处于对数后期，得一级种子；3）二级种子的制备：将步骤2）制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有60L BPY种子培养基的100L种子罐中，温度30℃，转速300rpm，罐压0.05MPA，通风比：1：1培养14h,得二级种子液。4）解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3）制备的二级种子液按5%的接种量接种到600L发酵培养基的1m3发酵罐中，温度30℃，转速300rpm，罐压0.05Mpa，通风比1：1，培养16h，得芽孢生成率90%以上，活菌数为5×109cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液；所述的发酵培养基为（质量百分比）：蔗糖1.0%，蛋白胨1.0%、酵母浸粉 0.5%，硫酸铵0.2%，硫酸镁0.04%；硫酸锰 0.08%、消泡剂0.06%，pH为6.8。3、生物液体肥料发酵剂的制备：将1和2制得到的发酵液按1：1的比例混合均匀后调节pH至7.0左右，进行灌装，每瓶1000mL,加10%氯化钠，制得菌数大概在4.0×109CFU/ml的液体肥料发酵剂。
实施例2 生物液体肥料制备工艺
将实例1制得的发酵菌剂按照1%的接种量添加到牛粪或马粪反应釜内，初始pH7.0，发酵温度控制在30～37℃，通气量40.0L(L/min），发酵时间为12～30h，发酵结束后，JF-1和JF-2的活菌数在107～108CFU/ml。液体肥料颜色深棕色或酱油色，固形物含量约3～5%。液体肥料采用塑料制品包装，包装规格1000ml/瓶。
自制反应釜内筒培养基（牛粪或马粪）体积0.5m3,外筒水体积1.5m3，带有温度控制系统和压缩空气通气装置。
实施例4 生物液体肥料应用试验
在通州国际种业园区和顺义农科所大孙各庄赵家峪基地设置土壤培肥试验基地：粮田为夏玉米和冬小麦轮作，露地菜田为白菜和茄子轮作。作物品种：冬小麦农大211、夏玉米京单28，大白菜为新3号、茄子为黑宝。两地粮田、菜田试验种植面积均为0.5亩。使用10天后，生物液体肥料试验田与对照组相比，种植作物出芽率提高10%，达到90%出芽率；作物高度比对照组高3～5cm,达到8～10cm，作物生长整齐度显著提高；茎叶当中叶绿素含量实验组比对照组高10%。试验田与对照田生长情况如图1所示。