本发明涉及生物医药技术领域，更具体的，本发明涉及适于抗EGFR抗体生产的培养基及应用。
背景技术：
随着环境的不断恶化，全球癌症发病率和死亡率呈现逐年递增的趋势，世界卫生组织和各国政府卫生部门纷纷把攻克恶性肿瘤列为一项重要任务。有研究表明表皮生长因子受体(EGFR)的过表达与多种癌症发生相关。表皮生长因子受体是一种上皮生长因子细胞增殖和信号传导的重要受体，EGFR通过与其配体相结合来产生效应。EGFR的特异性配体为EGF和EGF相关多肽，包括转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白和肝素结合EGF样生长因子。为了激活EGFR，配体EGF(单体)同时结合并连接两个相邻的受体链，使受体的胞内激酶局域在多个酪氨酸上相互磷酸化，酪氨酸激酶活性提高从而可以激活数个信号通路如ras-MAPK通路，PI3激酶通路以及JAK/STAT通路等。EGFR受体过表达或突变后结构激活(不需要配体)以及自分泌刺激导致的过度EGFR功能与多种癌症发生相关。EGFR的致瘤效应包括DNA合成启动、促进细胞生长、侵袭以及转移，特异性敲除EGFR可导致细胞周期俘获、细胞凋亡以及癌细胞的分化。研究发现，EGFR在多种人上皮组织来源的癌症(如膀胱、乳腺、宫颈、结肠、头颈、肾、肺、胰腺、以及前列腺等)中有不同水平的表达，EGFR在结肠直肠癌表达率高达25－77％，且与肿瘤的恶化以及不良预后相关。正因为EGFR具有上述特点，以EGFR为靶点的抗体药物不断被开发，有的产品已被用于肿瘤治疗的临床实践：
(爱必妥、cetuximab、西妥昔单抗)是Imclone公司开发的一种鼠/人嵌合的单克隆抗EGFR抗体。Cetuximab可以与EGFR受体以高出内源配体约5到10倍的亲和力与EGFR特异结合，从而竞争性拮抗配体与EGFR的结合，封锁受体与配体的结合继而抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的激活，从而使肿瘤细胞或肿瘤微环境中的基质细胞中多种由EGFR信号通路调节的细胞过程被阻断，包括EGFR下调，细胞内信号的抑制，细胞周期的抑制，凋亡的诱导，DNA修复的抑制，血管生成的抑制，肿瘤细胞运动性、侵袭性以及转移性的抑制等等。美国FDA于2004年2月批准用于结直肠癌的治疗，2006年FDA还批准其用于治疗头颈部肿瘤。
(帕尼单抗、panitumumab)是由Amgen公司开发的一种用于治疗化疗失败后转移性结直肠癌的抗EGFR全人源单克隆抗体，2006年被美国FDA批准用于治疗转移结肠癌。
但是，抗EGFR抗体药物价格非常高，例如需要137953美元/人/年，这对于普通老百姓来说，根本无力承担。抗体药物之所以如此昂贵，生产成本居高不下是其中重要原因，例如用于细胞大规模培养的商用培养基价格非常昂贵，动则几百万元，而且用常规的培养基如DMEM/F12、RPMI1640等进行抗EGFR单克隆抗体制备，其细胞表达效果不是非常理想，因此，有必要开发一种特别适合于抗EGFR单克隆抗体的细胞培养的培养基，以便最大限度地提高生产效率，降低生产成本。
技术实现要素：
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种新型培养基。具体地，本发明的发明人经过大量的实验研究，在DMEM/F12培养基(Sigma公司购买)的基础上成功开发了一种新型培养基，其特别适于抗EGFR单克隆抗体规模化生产的培养基，与现有商业化DMEM/F12培养基相比，本发明的培养基可大大提高生产效率。具体地，
本发明公开了一种新型培养基，其包括：氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物和其他有机分子。
优选地，所述的培养基的氨基酸的组分和用量如下：
更优选地，上述培养基的氨基酸的组分和用量如下：
更优选地，上述任一所述的培养基的微量元素及无机盐的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的微量元素及无机盐的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的维生素的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的的维生素的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的碳水化合物和其他有机分子的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的碳水化合物和其他有机分子的组分和用量如下，
最优选地，所述培养基中各组分和用量如下，
另外，发明还公开上述任一所述培养基在抗体生产中的应用，尤其是在抗EGFR单克隆抗体生产中的应用。非常适合于抗EGFR单克隆抗体的生产过程中的细胞培养，可大大提高生产效率。
现有培养基的组分一般包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、类固醇激素和相关蛋白替代物，其中，氨基酸：是中主要营养物质之一，用于蛋白、核酸以及脂类等物质的合成，还可以通过几个主要的中间代谢节点进入TCA循环，用于能量的生成，并同其他营养物质的代谢相关联；无机盐：NaCl维持渗透压平衡，协调共同转运有机大分子进入细胞，K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+等离子则参予代谢与信号转导以及促进贴壁和细胞增殖，各种阴离子(SO42-，NO3-等)，则主要用于调节转细胞膜势能或作为含硫或氮元素有机分子的前体；维生素：培养基中主要营养物质之一，维生素在培养基中存在的量很微量，但在细胞代谢中作为细胞功能有机催化剂，起重要的调控作用；碳水化合物：葡萄糖是主要的碳水化合物，作为主要的碳源和能源物质；微量元素：主要起调节、传递和控制的作用，在无血清培养基中的作用尤为重要，如：Fe：酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分；Cu：超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分；Mg：对ATP酶、激酶等起活化作用；Zn：酶的辅基；此外，培养基中还加入酚红用作培养基pH的指示剂，为适合细胞发酵罐中的大规模培养而添加有0.1％的Pluronic F68以消除剪切力的影响。但是如何对这些成分进行合理设计，是开发培养基的关键。
本发明人通过对DMEM/F12培养基的组分和含量进行适当的改变，经过大量的实验最终确定培养基的各个组分及最佳剂量，从而完成了本发明。实验结果表明，本发明的培养基与DMEM/F12培养基相比，本发明的培养基特别适合于抗EGFR单克隆抗体的生产，细胞培养效率得到了大大提高。
具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。本发明的基础培养基DMEM/F12购自Sigma公司，并按相关要求储存。
实施例1：培养基配制
通过常规方法配制培养基，本发明的培养包括：氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物和其他有机分子，优选的3种培养基各组分和用量如下：
培养基1：
培养基2：
培养基3：
培养基干粉配置方法：
将1L用量的干粉加入900ml超纯水中，温度35℃左右，搅拌半小时后，加入一定量的氢氧化钠助溶，然后加入浓盐酸和碳酸氢钠，调节PH到6.5～7.5。用0.2um负压过滤，分装于500毫升的玻璃瓶中无菌避光保存。
本发明获得的培养基的理化性质参数、检测方法和检测结果如表1所示。
表1：培养基检测结果表
从检测结果看，配置的液体培养基结果合格，能够用于CHO细胞培养。
实施例2：不同培养基在相同培养条件下的细胞培养效果对比
培养条件如下表2所示：
表2：细胞培养条件列表
如上述培养方法，本发明人分别将上述配制好的4种培养基300ml装入1000ml的摇瓶中，再加入CHO细胞，接种密度为6.5×105细胞/ml，放置CO2培养箱中(CO2为5％)中培养，温度为37℃，每隔24小时取样20μl，通过细胞计数仪(购自invitrogen)进行细胞计数，通过MTT法检测细胞存活率，并通过光镜观察细胞成团情况。实验结果如表3所示：
表3：不同培养基培养的细胞密度、细胞存活率和细胞成团情况检测结果表
以上实验结果表明，本发明的培养基1、培养基2和培养基3相比市售的DMEM/F12培养基具有更好的细胞培养效果，在第5-7天活细胞密度均大于80×105(市售DMEM/F12培养基仅40×105)，8天细胞存活率均大于80％(市售DMEM/F12培养基第八天存活率仅51.0％)；且本发明的培养基在细胞培养过程中未见细胞成团现象，而商业培养基DMEM/F12在第五天则见有 细胞成团现象产生。
另外，本发明人还对cetuximab及panitumumab等抗EGFR单克隆抗体的CHO细胞重复上述实施例2的试验，实验结果与上述实施例2的实验结果类似，结果均显示本发明的培养基相比市售的DMEM/F12培养基具有更好的细胞培养效果，本发明培养基1、培养基2和培养基3在对上述抗EGFR抗体的细胞培养中，在第5-7天活细胞密度均大于80×105(市售DMEM/F12培养基仅40×105)，8天细胞存活率均大于80％，且未见细胞成团现象产生(市售DMEM/F12培养基第5天已现成团)。