技术领域本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法。
背景技术：
结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，M.tb）感染引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病，也是由单一致病菌引起死亡数最多的疾病，能够感染人和多种哺乳动物及禽类，其中导致人类感染的结核菌大多数是人型结核分枝杆菌。人体各个器官都可被其侵犯，但以肺结核为多见。其病理特征是在多种组织器官中形成肉芽肿和干酪样、钙化结节病变。该病是伴随人类历史最长的疾病之一，早在古希腊、古埃及时期就有结核病的记载。德国细菌学家柯赫于1882年发现并证实了结核分枝杆菌是导致结核病的病原菌。目前，全球结核病每年新发病例800万左右，其中80%集中在发展中国家。我国结核病疫情的主要特点是感染率高、耐药率高、患病率高等。结核病已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。结核分枝杆菌简称结核杆菌，属于分枝杆菌属（Mycobacterium）。其基因组由共价闭合环状DNA组成。结核分枝杆菌为细长、直或微弯的杆菌，单在、少数成丛，大小为0.2-0.5μm×1.5-4.0μm。菌体两端有浓染颗粒，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。该菌为专性厌氧菌，对营养要求严格。最适pH6.4-7.0，最适温度为37-37.5oC。生长缓慢，繁殖一代需18-24小时。对干燥、冷、酸等理化因素抵抗力较强，但对酒精及紫外线抵抗力较弱。具有一定的变异性，可发生菌落、形态、毒力及耐药性等变异，同时对异烟肼、利福平等药物极易产生耐药性。结核分枝杆菌包括人型、牛型、非洲型和鼠型，其中致人发病的主要是人型。结核分枝杆菌的致病性不依赖内毒素、外毒素及侵袭酶类，而主要与代谢产物的毒性、菌体成分及机体产生的免疫病理损伤密切相关。近年来，由于一些客观因素及人为因素的出现，如人免疫缺陷病（HIV）感染的流行、艾滋病毒的传播、人口增长以及多重耐药性结合分枝菌株的出现等，导致结核病的疫情在不断上升。因此，建立快速检测结核分枝杆菌的方法是必要的。传统的结核分枝杆菌检测方法由于检测周期长、漏检率高、程序复杂等缺点，已经远远不能满足临床检测的需求。分子生物学方法如核酸探针技术、基因芯片技术、聚合酶链式反应（PCR）以及等温核酸技术中的LAMP法已经建立起来，并且在结核分枝杆菌的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。应用探针技术可以在短期内处理大量样品，但由于其敏感性尚不够高、加之常常需要放射性标记，操作比较繁琐费时，因而限制了其应用。PCR技术如实时定量PCR、多重PCR以其高度的特异性及敏感性在结核分枝杆菌检测方面取得了重大的突破。但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。环介导等温核酸扩增技术克服了PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已应用于沙门氏菌的检测。但是，LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高。由于现存结核分枝杆菌检测方法的不足以及结核分枝杆菌快速实地检测的需求，因此研究一种能在基层应用，可简单快速检测结核分枝杆菌的扩增方法非常有必要。本发明中的等温核酸扩增技术不仅检测时间短、灵敏度高，并且摆脱了昂贵仪器的束缚，可以在非实验室环境下进行，达到现场检测的目的。此外，该方法操作方便，对人员要求不高。因此该方法具有很高的推广应用价值，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员进行常规和应急检测的工具。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用重组酶介导的等温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，该检测方法的主要步骤是先进行结核分枝杆菌基因组的提取，将结核分枝杆菌基因组DNA加入到含有特异引物和探针的等温核酸扩增体系中进行扩增，在等温条件(35-45oC)下，10-20分钟即可检测扩增产物。本发明的具体技术方案如下：1．获取结核分枝杆菌DNA，设计结核分枝杆菌的引物和探针，建立结核分枝杆菌等温核酸扩增体系，将结核分枝杆菌DNA加入到扩增体系中，再加入反应缓冲液，在等温条件(35-45℃)下，10-20分钟即可检测到扩增产物。2．根据上述1所述的方法，建立结核分枝杆菌等温核酸扩增体系，如下所示：3．根据上述1、2所述的等温核酸扩增体系，将配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状，方便保存和运输。4．根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其中所述的反应缓冲液为终浓度为6%(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇水溶液。5．根据上述1、2所述的引物组，其引物序列为：正向引物序列：5’-TGACAAAGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCCAG-3’,反向引物序列：5’-CAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCG-3’。6．根据上述1、2所述的等温核酸扩增体系，其探针序列为：5’-CACAGCCGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGACGAGATC-3。7．根据上述1、2所述的荧光等温核酸扩增方法，其特征在于，所使用的荧光探针为荧光/猝灭基团修饰的探针，所使用的荧光基团为FAM荧光基团。8．根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其扩增的最佳等温条件为39℃。9.根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，扩增的最佳时间为20分钟。10．根据上述1-9所述的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，其中将结核分枝杆菌DNA加入到等温核酸扩增体系中，体系体积可以是25μL、50μL、100μL中的任何一个体积或其它体积，最佳体积为50μL，反应体系加入结核分枝杆菌DNA，放入可检测FAM荧光的仪器中，39℃反应15分钟，即可观察到结核分枝杆菌DNA的扩增情况。本发明所提供的方法，更适合应用于有大量样品的检测，操作更为简单，对操作人员的技术要求更低。检测时间短，并且可同时检测大批量的样本，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益附图说明图1为使用本发明的利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的实时荧光结果图。具体实施方式下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此实施例一：1、样品来源及结核分枝杆菌DNA提取样本来源：杭州市疾病预防控制中心收集的，从不同患者痰液标本中分离培养并灭活而得的菌株核酸，菌株均已鉴定保存。DNA提取方法：灭活菌株DNA抽提：采用细菌基因组抽提试剂盒抽提，以QIAgen试剂盒为例：取细菌培养液1-5ml，10,000rpm(~11,500×g)离心1min，尽量吸净上清。加100ulbufferATL，20ul蛋白酶K，涡流震荡混匀，56℃1小时孵育，每20分钟涡流混匀1次。2000g离心10秒。2000g离心10秒，加200ulbufferAL,涡流旋转(震荡)15秒混匀，70℃孵育10分钟，2000g离心10秒。加入200ul无水乙醇,涡旋震荡15秒混匀，离心。将以上EP管中的所有溶液包括沉淀移至试剂盒提供的2ml离心柱中,盖上盖子6000g离心1分钟，弃离心物。将离心柱放置于另一洁净的2ml离心管上，打开盖子，加200ul（500ul）bufferAW1，6000g离心1分钟，丢弃离心物。加500ulbufferAW2，20000g离心3分钟，弃离心物，将离心柱放置于新的2ml离心管上，20000g离心1分钟，弃离心物。将离心柱放置干净的1.5ml离心管上，打开盖子，加100ulbufferAE，室温放置1分钟，6000g离心1分钟。重复1次。DNA溶液-20℃保存。2、引物和设计设计以下结核分枝杆菌引物和探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：正向引物序列：5’-TGACAAAGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCCAG-3’,反向引物序列：5’-CAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCG-3’探针序列：5’-CACAGCCGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGACGAGATC-3。3、配制扩增体系在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50μL)：将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状扩增体系。4、结核分枝杆菌DNA检测向离心管中加入终浓度为6%(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成为49μL，再加入制备好的1μL结核分枝杆菌DNA，混合均匀，瞬时离心，放入到可检测FAM荧光的仪器中，在39℃反应20分钟。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。结果显示，在6分钟之后开始显示扩增的荧光信号。如附图1所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。以上实施例说明使用本发明的利用等温核酸扩增技术能够快速检测结核分枝杆菌，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床上的应用，该方法适用于对结核分枝杆菌的快速检测。以上所述仅为本发明的较佳实施范例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。<110>江苏奇天基因生物科技有限公司<120>一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>1tgacaaaggccacgtaggcgaaccctgcccag32<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>2caaagcccgcaggaccacgatcgctgatccg31<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3cacagccggttaggtgctggtggtccgaagcggcgctggacgagatc