一种基于微波处理的提取放线菌基因组DNA的方法与流程

本发明属于放线菌微生物总基因组提取的技术领域，涉及一种放线菌微生物的快速破壁及其裂解物中基因组纯化的方法。

背景技术：

放线菌微生物是存在于自然中极其重要的生物，其次级代谢基因产物对人类生活和健康非常重要，因此，挖掘相关基因为人类服务是很有意义的工作。

为了发掘放线菌微生物基因就要提取总DNA，一般采用液氮研磨法、溶菌酶破壁法等方法提取放线菌微生物基因组，由于放线菌细胞壁含肽聚糖，物理法破壁费时、费力，酶法破壁的消化处理过程过长，两种方法获得的总 DNA 质量和产量一般都不高，因此，放线菌微生物的某些基因不能获得有效扩增。

微波法即在基因组DNA提取过程中，用微波处理，使细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收能量而产生大量热，细胞质受热甚至水分子汽化膨胀产生较大压力冲破细胞壁，释放胞内物质便于基因组DNA的提取。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于微波处理的放线菌微生物快速破壁提取基因组的方法，对比其它放线菌微生物提取方法，本发明具有简便、高效、快速和价廉等特点，特别是在大量菌株的快速鉴别和活性物质产生菌的快速基因筛选方面可以避免较多的资源浪费，大大节省了人力物力财力。微波法提取基因组DNA时仅需微量菌体，可直接采用固体琼脂平板上的单菌落，避免了菌体大量繁殖所需的时间。微波法由于只需洗涤、微波处理和酚/氯仿抽提等三步反应，可以有效避免物理破壁的费时、费力或酶解法破壁的长时间消化处理过程。

本发明提出一种快速提取放线菌基因组的方法, 其特征在于仅需微量菌体，经过微波处理，提取放线菌基因组。

所述方法包括以下步骤。

1、放线菌微生物收集。

2、放线菌微生物细胞的洗涤：挑取0.05g放线菌孢子丝溶于洗涤液，10000rpm离心1-2min后弃上清，加50μL裂解液，振荡悬浮；所述洗涤液成分包括：50-100mmol/L Tris pH7.0-8.0的Tris缓冲液，25-50mmol/L EDTA，0.1-1% PVP；所述裂解液成分包括：50-100mmol/L pH7.0-8.0的Tris缓冲液，25-50mmol/L EDTA，3-5% (w/v) SDS，1.2-2% (w/v) PVP。

3、将上述前期处理所得的菌体混合液，采用700-1000W微波中火处理。

4、之后将微波处理产物经酚/氯仿抽提纯化得到放线菌基因组DNA。

本发明在上述放线菌微生物破壁及基因组提取整个过程中，平均只需1h，使得基因组提取时间大大缩短，提高了效率。

综上所述，本发明提供了放线菌微生物的快速破壁及其基因组的提取方法，为提取放线菌微生物基因组DNA提供了快捷适用的技术。本发明可用于链霉菌属、诺卡氏菌属以及不产孢子的放线菌微生物的快速破壁及其基因组的提取。

附图说明

图1 微波法提取的放线菌基因组DNA电泳图。

图2 实验菌株Z8的四种16S rDNA序列结果比对图

（注：Z8为采用溶菌酶破壁法提取的DNA作为16S rDNA序列的扩增模板）。

具体实施方式

通过以下具体实施例和附图，对本发明作详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除本领域的普遍知识和公知常识外，本发明没有特别限制内容。

实施例1 微波法提取放线菌基因组DNA。

1）向经灭菌的EP管中加入300μL洗涤液，挑取放线菌约0.01g至EP管中，振荡器振荡悬浮。

2）8000rpm离心1min；弃上清液。

3）加35μL裂解液，振荡悬浮。

4）700W微波处理，中火，秒表计时90s。

5）加400μL 65℃的抽提液，振荡5s。

6）加等体积酚/氯仿，轻混合，静置2min，12000rpm离心5min。

7）取上清至新EP管，加等体积异丙醇，轻混，之后，静置30min，弃上清。

8）加入70%乙醇200μL，12000rpm离心1min。

9）弃上清， 置于37℃烘干。

10）加40μL 1×TE溶解，静置20min，期间不时摇动使溶解充分。

按上述方法本发明获得了大于10kb的基因组DNA条带，无降解，无蛋白质污染，结果如图1 所示。

实施例2 微波法提取的基因组准确性的检测。

用700W微波功率，处理时间分别为60s、90s和120s，提取放线菌菌株基因组DNA，同时用溶菌酶破壁法提取同一种菌株的基因组DNA。以这四组DNA作为PCR扩增模板，扩增菌株的16S rDNA全长序列，对得到的16S rDNA全长序列进行比对分析，来检测微波法提取的基因组DNA的准确性。

1）16S rDNA序列的扩增。

16S rDNA体系（50μL）

扩增用的引物序列为细菌16S rDNA通用引物（27F和1492R），扩增产物为约1500bp的16S rDNA全长序列。

PCR反应条件: 94℃ 5min，94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min 30s，72℃10 min，4℃保存，30个循环。将PCR产物送至测序公司进行测序，获得16S rDNA序列。

2）16S rDNA序列的分析比较。

将上述1）中得到的16S rDNA序列用DNAMAN软件比较其核酸序列的同源性。得到序列比对结果图2。比对结果表明，三种不同处理时间的微波法所得到的16S rDNA序列同源性为99.71%，差别极微小；三种不同处理时间的微波法所得到的16S rDNA序列与溶菌酶破壁法所得序列的同源性为99.75%，差别极微小，表明微波法与溶菌酶破壁法所提取的放线菌基因组DNA效果是相同的。

3）结论

综上所述，微波法与标准酶法所提取的放线菌基因组DNA效果是相同的；另外，与溶菌酶破壁法相比，微波法节省了溶菌酶消化的时间，大大缩短了操作时间的同时也节省了费用，可用于大量快速提取放线菌基因组DNA。