本发明涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖胞外分泌量的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。
背景技术：
：氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。N-乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物具有重要的生理功能，在保健食品和医药领域具有广泛应用，如能特异性地作用于关节软骨，有效治疗风湿性关节炎；可抑制白血病细胞K562的生长，是新型抗癌药物氯脲霉素的主要成分；可参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用等。氨基葡萄糖的生产方法可分为三种：甲壳素水解法、生物转化法和微生物发酵法，其中甲壳素水解是目前生产氨基葡萄糖的主要方法。甲壳素水解是利用强酸强碱将虾壳或蟹壳中的甲壳素水解，再经过过滤和脱色处理，最后蒸馏结晶得到成品。水解法存在很多缺点，如原料来源受到一定的地域和季节限制，环境污染严重，部分消费者服用后会过敏等。生物转化法是指利用微生物的甲壳素水解酶将甲壳素进行酶解得到单体氨基葡萄糖。相对于水解法，生物转化法对环境的污染较小，但由于甲壳素水解酶的价格较高，目前仅限于实验室研究阶段。虽然用含有甲壳素水解酶的微生物细胞直接进行生物转化可降低生产成本，但转化时间很长，生产强度很低。在这种背景下，近几年人们对微生物发酵法生产氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖产生了浓厚的兴趣。相对于水解法和生物转化法，微生物发酵法具有以下优点:1)发酵时间较短，生产强度较高；2)原料来源不受地域和季节限制，产品无鱼腥味；3)对环境污染小；4)产品来自微生物，消费者服用后不会出现过敏。氨基葡萄糖乙酰化酶属于GCN5相关的GNAT蛋白质超家族，催化N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸的生成，将乙酰辅酶A中的乙酰基转移到葡萄糖胺-6-磷酸的氨基上，是N-乙酰氨基葡萄糖合成途径上的关键性酶。对氨基葡萄糖乙酰化酶的改造对在重组枯草芽孢杆菌积累乙酰氨基葡萄糖有重要作用，以下三件专利文件中尝试了对氨基葡萄糖乙酰化酶的改造。中国专利CN103045527A公开了一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌，其含有外源的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，外源基因来自酿酒酵母，该专利可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度可达到115mg/L.中国专利CN103060252A公开了一种高产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌工程菌，是对CN103045527A的进一步改进，即将酿酒酵母S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1克隆到枯草芽孢杆菌，同时敲除该枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB及乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP构建而成的枯草芽孢杆菌工程菌。该专利可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累浓度达到415mg/L。中国专利CN102978149B公开了一种高产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌，也是对CN103045527A的进一步改进，即将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1克隆到枯草芽孢杆菌，同时敲除该枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP构建而成的重组枯草芽孢杆菌；将氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因连接到表达载体pP43NMK上；所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168。该专利可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累浓度达到1.23g/L。从上述专利文件公开内容可知，改造后的重组枯草芽孢杆菌，乙酰氨基葡萄糖在胞外积累浓度虽然有所增加，但仍有提升的空间。另外，重组枯草芽孢杆菌培养时，还存在连续好几次发酵，接种后迟迟不生长；以及培养基的配方在实验室摇瓶可以，上罐就不能获得理想的乙酰氨基葡萄糖在胞外积累浓度等技术问题。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明的第一个目的是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)为出发菌株，表达了白色念珠菌(Candidaalbicans)来源的氨基葡萄糖乙酰化酶基因(CaGNA1)。本发明优选的白色念珠菌为CandidaalbicansSC5314。下面是更具体地表述敲除非必需区域skin的重组枯草芽孢杆菌。将枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)敲除基因组片段skin，基因组片段skin为枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)基因组上2655129—2700742非必需区域。进一步对基因组片段skin进行了优选，基因组片段skin为枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)基因组上2655903—2700742非必需区域。进一步对基因组片段skin进行了优选，基因组片段skin为枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)基因组上2655129—2699959非必需区域。本发明的氨基葡萄糖乙酰化酶(CaGNA1)的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)基因组如NC_000964.3所示。本发明的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，是在白色念珠菌来源的如NCBIGenBank:XM_715990.1所示的核苷酸序列的基础上，进行枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化得到的。为了构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，本发明的另外重要改进是：出发菌株是改造枯草芽孢杆菌(表示为BSGN6-PxylA-glmS)，改造枯草芽孢杆菌168是以枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)为基础，基因型作如下改造：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72，并以木糖诱导启动子PxylA调控表达氨基葡萄糖合成酶基因glmS。本发明的枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)的部分基因在基因组的位置如下表：基因NCBIGeneID在基因组上的位置nagP938418254907,256802gamP(nagP)938418254907,256802gamA(nagBB)938425256814,257572nagA9366213595356,3596546nagB(nagBA)9366193596543,3597271ldh938348329774,330739pta(eutD)9365813865355,3866326以改造枯草芽孢杆菌(BSGN6-PxylA-glmS)为出发菌株，敲除出发菌株基因组上非必需区域skin，得到缺失skin改造枯草芽孢杆菌(表示为BSGN6Δskin-PxylA-glmS)，然后以P43启动子控制表达氨基葡萄糖乙酰化酶基因(CaGNA1)，获得优选的重组枯草芽孢杆菌(表示为BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1)。本发明的改造枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS的构建方法大体可参考文献：ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.YanfengLiu,etal.MetabolicEngineering,23(2014)p42-52.本发明的第二个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括：1)构建重组质粒克隆白色念珠菌的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因CaGNA1，连接到pP43NMK上；2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌将上述重组质粒转化BSGN6-PxylA-glmS或者BSGN6-Δskin-PxylA-glmS，得到产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌。本发明的第三个目的是提供一种提高乙酰氨基葡萄糖胞外分泌量的方法，该方法是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1或者BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。本发明的表达是将氨基葡萄糖乙酰化酶(CaGNA1)基因克隆于表达载体上，再转化到出发菌株中进行表达，优选用表达载体pP43NMK表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。本发明的表达载体pP43NMK的构建方法参见：High-LevelExpressionandSecretionofMethylParathionHydrolaseinBacillussubtilisWB800.Xiao-ZhouZhang,etal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,71(4102-4103).本发明的第四个目的是提供一种应用重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，方法具体为：将37℃、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下发酵30h；发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素15ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，含5MHCl。为了进一步解决本发明所提出的技术问题，本发明还提供了一种发酵方法，具体为：将37℃、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，OD600达到0.3-0.5时，添加木糖至终浓度5g/L诱导，于37℃、200rpm条件下发酵25h；发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，葡萄糖20，胰蛋白胨10，NaCl10，琼脂粉20，微量元素15ml/L,吲哚丁酸0.1-0.3,万古霉素0.2-0.5,非达霉素0.1-0.6；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，NiCl2·6H2O0.01，Na2SeO4·2H2O0.01，含5MHCl。更优选的本发明发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，葡萄糖20，胰蛋白胨10，NaCl10，琼脂粉20，微量元素15ml/L,吲哚丁酸0.2,万古霉素0.4,非达霉素0.4；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，NiCl2·6H2O0.01，Na2SeO4·2H2O0.01，含5MHCl。本发明的有益效果：枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168)中推测出大量非必需基因区域，这些非必需基因是在不断变化的环境中获得的。系统研究覆盖全基因组的单基因扰乱发现，在丰富培养基中，一定条件下破坏这些非必需基因区域不会影响其生长能力，可有利于产物的合成。本发明通过敲除相对包含大量功能同源基因的非必需基因区域skin，降低维持这些基因表达的物质代谢和能量代谢，底物消耗可以直接用于合成必须基因和期望产物。另外通过改造代谢途径，实现乙酰氨基葡萄糖的积累；与过表达酿酒酵母来源GNA1基因的对照菌株相比，本发明表达白色念珠菌来源的CaGNA1的重组菌BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1、BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1的乙酰氨基葡萄糖胞外积累量分别提高了94％、21％，重组枯草芽孢杆菌产量可达14.6g/L。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。重组枯草芽孢杆菌培养简单，不存在需要连续发酵并且接种后迟迟不生长的问题，即使上罐后也能有很好的乙酰氨基葡萄糖胞外积累量。具体实施方式重组枯草芽孢杆菌种子培养：种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。乙酰氨基葡萄糖的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。实施例1：敲除基因组上非必需区域skin根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCCNo.27370)基因组序列，设计敲除框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：skin-L-F(序列如SEQIDNO.2所示)和skin-L-R(序列如SEQIDNO.3所示)；右臂上下游引物分别为：skin-R-F(序列如SEQIDNO.4所示)和skin-R-R(序列如SEQIDNO.5所示)。运用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)基因组中扩增敲除框中包含的左臂和右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(NCBIaccessionno.EU541492)，设计引物，扩增博来霉素抗性基因(zeo)，上下游引物分别为：skin-Z-F(序列如SEQIDNO.6所示)和skin-Z-R(序列如SEQIDNO.7所示)。通过融合PCR方法，将敲除框左、右臂及抗性基因融合为敲除框。通过测序确认skin敲除框构建成功。构建好的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认skin敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌(表示为BSGN6Δskin-PxylA-glmS)。引物序列如下(5’-3’)：skin-L-F：GGTCCCTCGATGATTATCACTTTCATAAAATGCskin-L-R：ctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcGATTGCTGTAGCTGTTGGTGTATTTGGAATTCskin-R-F：gtcgtgactgggaaaaccctggcCTTAGACGCATTTTCCTATGAAAAAAGTCTTGATTTCskin-R-R：CGCTTTTCCTTCTCTGCCCGATAAAACTskin-Z-F：gaattccaaatacaccaacagctacagcaatcGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGskin-Z-R：gaaatcaagacttttttcataggaaaatgcgtctaagGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC实施例2：重组质粒的构建根据NCBI上公布的白色念珠菌(CandidaalbicansSC5314)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CaGNA1)核苷酸序列如NCBIGenBank:XM_715990.1所示，进行枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化，核苷酸序列如SEQIDNO.1，并由上海生工生物工程股份有限公司合成基因序列。设计引物CaGNA1-F(序列如SEQIDNO.8所示):5’-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCTGCTGCCACAAGGTTATACAT-3’，CaGNA1-R(序列如SEQIDNO.9所示)：5’-CCCAAGCTTTTAAAAGCGGCATACCATTTCTACG-3’。使用上述引物从合成的序列核苷酸序列SEQIDNO.1中扩增氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CaGNA1)。扩增片段经KpnI和HindIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体。酶切验证并测序，确认重组质粒pP43-CaGNA1构建成功。实施例3：重组枯草芽孢杆菌的构建将构建好的表达载体pP43-CaGNA1转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-Δskin-PxylA-glmS和BSGN6-PxylA-glmS。采用CaGNA1-F及CaGNA1-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现450bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功，分别得到重组枯草芽孢杆菌BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1和BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1。实施例4：发酵生产乙酰氨基葡萄糖将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。最终发酵上清液中，BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1和BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1的乙酰氨基葡萄糖含量分别达到14.6g/L、9.1g/L。对照菌株以BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，过量表达来源于酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeS288C)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1(核苷酸序列如GenBank:NM_001179949)，相同培养条件下最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量仅为7.5g/L。与表达了酿酒酵母来源GNA1基因的对照菌株比较，仅表达白色念珠菌来源的CaGNA1基因的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖产量提高了21％，同时敲除skin和表达CaGNA1的重组菌产量提高了94％。本发明通过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CaGNA1)，或同时敲除skin，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。实施例5：发酵生产乙酰氨基葡萄糖将37℃、200rpm下培养12h的的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，OD600达到0.3-0.5时，添加木糖至终浓度5g/L诱导，于37℃、200rpm条件下发酵25h；发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，葡萄糖20，胰蛋白胨10，NaCl10，琼脂粉20，微量元素15ml/L,吲哚丁酸0.2,万古霉素0.4,非达霉素0.4；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，NiCl2·6H2O0.01，Na2SeO4·2H2O0.01，含5MHCl。本实施例结果表明，发酵培养基引入吲哚丁酸、万古霉素、非达霉素的试验组，10批次发酵，接种后无一批次发生不生长现象；无论在实验室摇瓶还是上罐，最终发酵上清液中，BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1和BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1的乙酰氨基葡萄糖含量分别达到14.1-15.8g/L、9.0-10.1g/L，同时发酵时间缩短4-6小时。以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。当前第1页1 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