1.一种在没有外源提供的核酸酶的情况下将转基因靶向整合到细胞的基因组中的方法,所述方法包括:
使细胞与重组病毒载体接触,所述重组病毒载体包含:
i.包含第一核酸序列和第二核酸序列的多核苷酸,其中所述第一核酸序列编码所述转基因;并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5’或3’方向上并在整合到细胞基因组中的靶整合位点中后促进产生2种独立的基因产物;
ii.第三核酸序列,其位于所述多核苷酸的5’方向上并包含与细胞基因组中靶整合位点的5’基因组序列基本同源的序列;和
iii.第四核酸序列,其位于所述多核苷酸的3’方向上并包含与细胞基因组中靶整合位点的3’基因组序列基本同源的序列;
其中所述细胞不与核酸酶或编码核酸酶的核酸接触。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞是非分裂细胞。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述接触发生在体内。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述方法发现用于治疗与遗传缺陷相关的医学病症。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述医学病症选自:血友病、A型血友病、B型血友病、支链有机酸尿症、槭树糖浆尿病(MSUD)、异戊酸血症(IVA)、丙酸尿症(PA)、甲基丙二酸尿症(MMA)、3-甲基巴豆酰甘氨酸尿症、I型3-甲基戊烯二酸尿症、短/支链乙酰-CoA脱氢酶缺乏、2-甲基-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶缺乏、异丁酰基-CoA脱氢酶缺乏、3-羟基异丁酸尿症、丙二酸尿症、长链脂肪酸氧化疾病、糖原贮积病、I型糖原贮积病(GSD1)、肉碱循环障碍、尿素循环障碍、克里格勒-纳贾尔综合征、遗传性酪氨酸血症、大疱性表皮松解症、肝豆状核变性、腺苷脱氨酶缺乏、镰状细胞疾病、X连锁重症联合免疫缺陷(SCID-X1)、地中海贫血、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏、戴-布二氏贫血、高雪氏病、生长激素缺乏、和帕金森病。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述方法发现用于促进免疫预防。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述转基因编码促进免疫预防的试剂。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述促进免疫预防的试剂是抗体或嵌合多肽,并且针对选自下组的病原体有特异性:人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、真菌、和细菌。
9.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述方法发现用于促进伤口愈合。
10.一种用于将转基因整合到细胞的基因组中的靶整合位点的重组病毒载体,所述载体包含:
包含第一核酸序列和第二核酸序列的多核苷酸盒,其中所述第一核酸序列包含所述转基因;并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5’或3’方向上并在整合到细胞基因组中的靶整合位点中后促进产生2种独立的基因产物;
第三核酸序列,其位于所述多核苷酸盒的5’方向上并包含与细胞的基因组中靶整合位点的5’基因组序列基本同源的序列;和
第四核酸序列,其位于所述多核苷酸盒的3’方向上并包含与细胞的基因组中靶整合位点的3’基因组序列基本同源的序列。
11.如权利要求10所述的重组病毒载体,其特征在于,所述病毒载体是rAAV载体。
12.如权利要求10所述的重组病毒载体,其特征在于,在所述靶整合位点处促进产生2种独立的基因产物的核酸序列选自:编码2A肽的序列;IRES;内含肽;位点特异性蛋白酶的识别序列;编码作为凝结级联的部分被切割的可切割接头的序列;编码因子XI切割位点的序列;和内含子剪接供体/剪接受体序列。
13.如权利要求12所述的重组病毒载体,其特征在于,包含靶整合位点的内源性基因的表达和活性不被所述转基因的整合所破坏。
14.如权利要求13所述的重组病毒载体,其特征在于,
所述内源性基因的3’端包含所述靶整合位点,
所述第三核酸序列的序列与所述内源性基因的终止密码子上游的DNA序列基本同源;并且
所述第四核酸序列的序列与所述内源性基因的终止密码子下游的DNA序列基本同源。
15.如权利要求13所述的重组病毒载体,其特征在于,
所述内源性基因的5’端包含所述靶整合位点,
所述第三核酸序列的序列与所述内源性基因的起始密码子上游的DNA序列基本同源;并且
所述第四核酸序列的序列与所述内源性基因的起始密码子下游的DNA序列基本同源。
16.如权利要求13所述的重组病毒载体,其特征在于,所述内源性基因选自:白蛋白基因、胶原基因和肌动蛋白基因。
17.如权利要求10所述的重组病毒载体,其特征在于,所述转基因补偿基因缺陷。
18.如权利要求10所述的重组病毒载体,其特征在于,所述转基因编码促进免疫预防的试剂。
19.如权利要求18所述的重组病毒载体,其特征在于,所述促进免疫预防的试剂是包含免疫球蛋白结构域和效应结构域的多肽。
20.如权利要求18所述的重组病毒载体,其特征在于,所述促进免疫预防的试剂是抗体。
21.如权利要求18所述的重组病毒载体,其特征在于,所述促进免疫预防的试剂是抗体或嵌合多肽,并且针对选自下组的病原体有特异性:人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、真菌、和细菌。
22.如权利要求10所述的重组病毒载体,其特征在于,所述转基因促进血管发生和/或血管生成。
23.如权利要求22所述的重组病毒载体,其特征在于,所述转基因是VEGF。