用于生产化学品及其衍生物的组合物和方法与流程

本申请根据U.S.C.§119(e)要求2014年3月21日提交的美国申请序号14/222,453的部分继续申请、2013年9月20日提交的美国申请序号14/033,300的部分继续申请的优先权，其根据35U.S.C.§119(e)要求2012年9月21日提交的美国临时申请序号61/704,408的优先权权益，每篇申请在此以引用的方式整体并入，包括所有表、图及权利要求。序列表的合并在所附序列表中的材料在此以引用的方式并入本申请中。所附的序列表文本文件被命名为SGI1660_3WO_Sequence_Listing.txt，于2015年3月20日创建，且为191KB。可使用在采用WindowsOS的计算机上的MicrosoftWord评价该文件。发明背景近年来，已投入日益增多的精力来鉴定使用可再生原料生产有机化学品的新型和有效方式。在众多的下游化学加工技术中，生物质衍生的糖向高附加值化学品的转化被认为是十分重要的。具体说来，六种含碳的糖类，即己糖，如果糖和葡萄糖，是广为人知的在自然界中存在的最大量的单糖，因此可适当地且经济地用作化学原料。由糖生产呋喃和呋喃衍生物已在化学和催化研究中吸引了越来越多的关注，且据信具有提供实现可持续性供能和化学品生产的一条主要路线的潜能。实际上，在用整合生物质转化工艺的生物精炼内可获得的糖的脱水和/或氧化可产生一大家族产物，包括各种各样的呋喃和呋喃衍生物。在具有最大商业价值的呋喃中，呋喃-2，5-二甲酸(也称为2，5-呋喃二甲酸，在下文中缩写为FDCA)是在包括药物、杀虫剂、抗细菌剂、香料、农业化学品的若干产业以及广泛范围的聚合物材料(例如，生物塑料树脂)的制造应用中具有多种用途的有价值的中间体。因此，FDCA被认为是对苯二甲酸(TPA)的绿色替代品，即一种石油基单体，其是全世界每年生产的最大体积的石化产品之一。实际上，美国能源部已将FDCA鉴定为最佳的12种优先级化合物之一，这些化合物都是由糖制成为高附加值的化学品用于确立未来的“绿色”化学，且因此，其已被命名为可再生的中间体化学品的“沉睡的巨人”之一(Werpy和Petersen，TopValueAddedChemicalsfromBiomass.USDepartmentofEnergy，Biomass，第1卷，2004)。虽然已提出各种方法用于大规模生产FDCA(关于综述，参见，例如Tong等人，Appl.CatalysisA：General，385，1-13，2010)，但FDCA的主要工业合成当前依赖于己糖如葡萄糖或果糖的化学脱水为中间体5-羟甲基糠醛(5-HMF)，然后化学氧化为FDCA。然而，据报道当前经由脱水的FDCA生产过程一般是非选择性的，除非其刚形成，不稳定的中间产物便立即转化为更稳定的材料。因此，在FDCA的生产和使用中的主要技术壁垒是开发有效的和选择性的生物质衍生的糖的脱水工艺。因此，需要开发通过替代手段生产这种十分重要的化合物以及许多其他化学品和代谢物的方法，这种手段不仅对于石油基原料是可再生的替代品，而且使用能源更少和资本密集型技术。具体说来，糖脱水的选择性控制可以是一项非常强大的技术，产生广泛多种额外的便宜的结构单元。技术实现要素：本发明提供用于生产一个或多个酶促途径的产物的方法。本发明方法中所用的途径包括一个或多个转化步骤，例如像古罗糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸(步骤7)；5-酮葡糖酸(5-KGA)酶促转化为L-艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸酶促转化为艾杜糖二酸步骤7b)；以及5-酮葡糖酸酶促转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步骤16)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸-内酯(步骤19)。在一些实施方案中，本发明的方法生产2，5-呋喃二甲酸(FDCA)作为产物。所述方法可包括酶促和化学转化两者作为步骤。还提供各种途径用于将葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)，并且将相同的糖转化为FDCA。所述方法还可包括以高特异性和效率进行反应的工程化酶的用途。第一方面，本发明提供一种用于从起始底物生产酶促或化学途径的产物的方法。所述途径可含有任何一个或多个以下转化步骤：古罗糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸(步骤7)；5-酮葡糖酸(5-KGA)酶促转化为L-艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸酶促转化为艾杜糖二酸(步骤7b)；以及5-酮葡糖酸酶促转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步骤16)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸-内酯(步骤19)。在一个实施方案中，酶促途径的产物是5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)。在不同实施方案中，方法的底物可为葡萄糖，并且产物可为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)。所述方法可包括以下步骤：D-葡萄糖酶促转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸-内酯(步骤19)；古罗糖醛酸-内酯酶促转化为古罗糖醛酸(步骤1B)；古罗糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸(步骤7)；以及D-葡糖二酸酶促转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)(步骤8)。在本发明的另一方法中，底物是葡萄糖且产物是DDG，并且所述方法包括以下步骤：D-葡萄糖转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯转化为葡糖酸(步骤1a)；葡糖酸转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)(步骤14)；5-酮葡糖酸(5-KGA)转化为L-艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸转化为艾杜糖二酸(步骤7b)；以及艾杜糖二酸转化为DDG(步骤8a)。在本发明的另一方法中，底物是葡萄糖且产物是DDG，并且所述方法包括以下步骤：D-葡萄糖转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯转化为葡糖酸(步骤1a)；葡糖酸转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)(步骤14)；5-酮葡糖酸(5-KGA)转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步骤16)；4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)转化为4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步骤4)；以及4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)转化为DDG(步骤5)。在本发明的另一方法中，底物是葡萄糖且产物是DDG，并且所述方法包括以下步骤：D-葡萄糖转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯转化为葡糖酸(步骤1a)；葡糖酸转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)(步骤14)；5-酮葡糖酸(5-KGA)转化为L-艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸转化为4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步骤7B)；以及4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)转化为DDG(步骤5)。本文所公开的任何方法可进一步包括DDG转化为2，5-呋喃-二甲酸(FDCA)的步骤。在任何方法中DDG转化为FDCA可包括将DDG与无机酸接触以使DDG转化为FDCA。另一方面，本发明提供一种用于合成衍生化(酯化)的FDCA的方法。所述方法包括将DDG与醇、无机酸在超过60C的温度下接触以形成衍生化的FDCA。在不同实施方案中，所述醇是甲醇、丁醇或乙醇。另一方面，本发明提供一种用于合成FDCA的衍生物的方法。所述方法包括将DDG与醇、无机酸及助溶剂接触以产生DDG的衍生物；任选地纯化DDG的衍生物；并且将DDG的衍生物与无机酸接触以产生FDCA的衍生物。无机酸可为硫酸且醇可为乙醇或丁醇。在不同实施方案中，助溶剂可为以下任一种：THF、丙酮、乙腈、醚、乙酸丁酯、二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。在一个实施方案中，DDG的衍生物是二乙基DDG且FDCA的衍生物是二乙基FDCA，并且在另一实施方案中，DDG的衍生物是二丁基DDG且FDCA的衍生物是二丁基FDCA。另一方面，本发明提供一种用于合成FDCA的方法。所述方法包括将DDG与无机酸在气相中接触。另一方面，本发明提供一种用于合成FDCA的方法。所述方法包括将DDG与无机酸在超过120C的温度下接触。另一方面，本发明提供一种用于合成FDCA的方法。所述方法包括将DDG与无机酸在无水反应条件下接触。附图简述图1是蛋白474、475及476的粗裂解物和纯化酶的电泳凝胶。图2A-2H分别是路线1、2、2A、2C、2D、2E、2F的途径的示意图。图3A-3c分别示出了路线3、4及5的途径的示意图。图4是用葡糖酸脱水酶对葡糖酸脱水以通过pSGI-359产生DHG的HPCL-MS分析。图5是用于测量葡糖酸脱水酶活性的氨基脲(semicarbizide)测定绘图的曲线图。图6A-6B提供用本发明的三种酶进行的葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的氧化的Lineweaver-Burk绘图。图7A示出了使用EC5.3.1.17家族中的酶DTHU异构酶对5KGA和艾杜糖醛酸进行异构化的时间点的HPLC分析的结果。对照：死的酶是与热灭活酶的对照。MedB1是指没有添加异构酶的反应。时间点，x轴1＝0.5h；2＝1；3＝2h；4＝16h。图7b示出了使用EC5.3.1.17家族中的酶对5KGA和艾杜糖醛酸进行异构化的时间点的HPLC分析。对照：死的酶是与热灭活酶的对照。；MedB1：是指没有添加异构酶的反应。时间点，X轴：1＝0h；2＝1h；3＝2h；4＝17h。图8示出了用EC5.3.1.nl家族中的酶对5KGA和艾杜糖醛酸进行异构化的产物形成。从酶测定中获得数据。图9：2，5-DDH形成的HPLC分析及5KGA浓度随时间的降低。示出了2，5-DDH的总离子计数。图10是显示由1，5-葡糖酸内酯产生古罗糖醛酸内酯的HPLC-MS色谱图。示出了真正的古罗糖醛酸的迹线的重叠。图11是方案6反应途径的示意图。图12A-12B分别是示出了5-KGA和DDG反应产物的LC-MS色谱图。图13是示出了FDCA和FDCA二丁酯衍生反应产物的LC-MS色谱图。图14A是来自DDG与乙醇的反应的二乙基FDCA合成的粗反应样品的GC-MS分析。单峰对应于二乙基-FDCA。图14B是来自DDG与乙醇的反应的主要产物的MS片段。图15A是来自DDG与乙醇的反应的二乙基FDCA合成的粗反应样品的GC-MS分析。单峰对应于二乙基-FDCA。图15B是来自DDG与乙醇的反应的主要产物的MS片段。图16是由DTHU合成FDCA及其衍生物的示意图。图17是方案1的示意图。由葡萄糖开始的DDG的无细胞酶促合成。酶是ST-1：葡萄糖氧化酶；ST-1A：水解-化学品；ST-14：葡糖酸脱氢酶(pSGI-504)；ST-15：5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖醛酸异构酶(DTHUIS，pSGI-434)；ST-7B：糖醛酸脱氢酶(UroDH，pSGI-476))；ST-8A：葡糖二酸脱水酶(GlucDH，pSGI-353)；ST-A：NAD(P)H氧化酶(NADH_OX，pSGI-431)；ST-B：过氧化氢酶。图17b示出了如通过HPLC所分析的反应中间体在头3h内的浓度。在两个反应中都显示了DDG的形成。具体实施方式本发明提供用于生产酶促途径的产物的方法。所述方法可包括底物酶促转化为产物。通过利用本发明的酶促及化学途径，有可能以高效和经济的方式合成广泛多种产物。可通过本发明的方法和途径产生的一种产物是2，5-呋喃基二甲酸(FDCA)，其可根据本发明以工业规模生产。所述方法可包括一个或多个本文所公开的酶促和/或化学的底物向产物转化步骤。在一些实施方案中，利用的酶使用对于所述酶未知的活性进行酶促转化步骤。因此，可在本发明中使用这些新型活性以进行转化步骤和底物向产物的转化作为酶促和/或化学途径的一部分。本文所公开的任何途径的任何产物(例如DDG、艾杜糖醛酸、艾杜糖二酸、葡糖二酸、FDCA等)都可如本文所公开在单个生物反应器或反应容器中以工业规模，即至少1克或至少10克或至少100克或至少1kg的量生产。本发明的途径包含本文所公开的任何一个或多个步骤。应当理解，本发明的途径的步骤可包括正反应或逆反应，即底物A被转化为产物B，而在逆反应中底物B被转化为产物A。在方法中，除非另作说明，正反应和逆反应都被描述为步骤。所述方法包括生产途径的产物，该途径可为酶促途径。所述方法包括一个或多个酶促和/或化学转化步骤，这些步骤将底物转化为产物。可包括在方法中的步骤包括例如以下任何一个或多个：古罗糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸(步骤7)；L-艾杜糖醛酸酶促转化为4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(17)；5-酮葡糖酸(5-KGA)酶促转化为L-艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸酶促转化为艾杜糖二酸步骤7B)；以及5-酮葡糖酸酶促转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步骤16)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸-内酯(步骤19)。任何一个或多个上述步骤都可包括在本发明的方法或途径中。酶促步骤或途径是在反应中需要酶作为催化剂以使步骤进行的步骤或途径。化学步骤可在反应中没有酶作为催化剂的情况下进行。在方法中所列举的任何一个或多个步骤都可为酶促步骤。在一些实施方案中，途径的每个步骤都是酶促步骤，而在其他实施方案中，途径中的一个或多个步骤是化学步骤。在一些实施方案中，任何所述方法都可包括涉及将反应的底物添加到含有执行转化的酶的反应混合物中的步骤。因此，古罗糖醛酸转化为D-葡糖二酸(步骤7)的方法可包括将古罗糖醛酸作为起始底物添加到反应混合物中；L-艾杜糖醛酸酶促转化为艾杜糖二酸(7B)可包括将L-艾杜糖醛酸作为起始底物添加到反应混合物中；L-艾杜糖醛酸酶促转化为4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(17)可包括将L-艾杜糖醛酸作为起始底物添加到反应混合物中。任何所述方法都可包括将葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖或甘露糖或另一单糖或二糖添加到反应混合物中的步骤。可包括在任何方法中的另一步骤是从反应混合物中纯化反应产物的步骤。因此，纯化葡糖二酸/D-葡糖二酸或L-艾杜糖醛酸/艾杜糖醛酸、或艾杜糖二酸、或2，5-二酮己二酸/DKHA的步骤可包括在本文所述的任何方法中。所公开的任何方法都可包括从反应混合物中分离或纯化DDG或FDCA的步骤。并且任何方法都可包括添加酶到反应混合物中的步骤，所述酶执行本文所述的任何一个或多个步骤。反应混合物是至少一种底物和至少一种酶的混合物并且包括至少一种底物转化为至少一种酶产物。任何所述方法都可包括将分离的酶添加到反应混合物中的步骤，执行本发明途径的底物向产物转化步骤的酶，并且分离的酶是至少10％纯化或至少20％纯化或至少25％纯化或至少50％纯化或至少70％纯化或至少80％纯化或至少90％纯化的，所有都是w/w。由于许多糖可转化为其他糖，所以本发明的任何方法或途径都可涉及葡萄糖、蔗糖、果糖或半乳糖用作起始底物。因此，在其中葡萄糖是起始底物的本文所公开的任何途径或反应中，应当理解果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖或另一起始底物也可以是那个途径或反应的起始底物。在一些实施方案中，糖转化为葡萄糖，葡萄糖随后进入途径，但在其他实施方案中，途径是从果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖或另一单糖或二糖开始。本发明的反应可在含有一种或多种执行酶促转化的酶的细胞裂解物或无细胞的裂解物中发生，但也可在含有组分的反应混合物中发生，所述组分是由用户添加以形成反应混合物，或可含有从细胞裂解物中纯化的组分，或可包含在全细胞生物催化剂中。反应也可在由已经合并的纯化组分制成的混合物中发生，如在其中底物与酶已合并形成反应混合物的混合物中。反应可在体外反应中发生或可在重组细胞中发生，且因此，一种或多种产物可通过溶解细胞或通过从培养基处收集来收获。反应可在以下实验室容器或反应容器中发生，例如像离心管、试管、小瓶、烧杯或玻璃或金属或塑料容器或反应器、发酵罐或发酵容器或生物反应器、藻池、可以是小规模或大规模的任何容器。本文所述的任何生物体都可用作宿主细胞以产生本发明的步骤或途径的产物。生物体也可用于产生本发明的一种或多种酶以用于本发明的方法中。可使用各种类型的生物体。实例包括：醋杆菌科的细菌(例如醋杆菌属、嗜酸菌属、葡糖杆菌属、葡糖酸醋酸杆菌属的细菌)、或假单胞菌科的细菌(例如固氮菌属、假单胞菌属)、或肠杆菌科的细菌(例如埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、克雷伯氏杆菌属)。酵母也可用于这些目的，如酵母菌属、阿舒囊霉属、克鲁维酵母属、Lachancea、接合酵母属、念珠菌属、毕赤氏酵母属、Arxula或毛孢子菌属或Blastobotry的酵母。也可使用蓝藻细菌，如蓝丝菌属(例如蓝杆藻菌株ATCC51142、PCC7424、PCC7425、PCC7822、PCC8801、PCC8802)、或微胞藻属或聚球藻属(例如细长菌株PCC7942、PCC7002、PCC6301、CC9311、CC9605、CC9902、JA-2-3B’a(2-13)、JA-3-3Ab、RCC307、WH7803、WH8102)或集胞藻属或嗜热聚球藻。因此，本发明提供重组宿主细胞，其包含SEQIDNO：4-6、20-32、36-38、47-54、56、62-66、69-70、72及79-84中的一个或多个的重组核酸或SEQIDNO：1-84中的任一个的密码子优化序列。宿主细胞还可含有本文所述的本发明的载体。“密码子优化”序列是指序列密码子变化成在具体的生物体中优先使用的那些以使得所编码的蛋白质在携带该序列的生物体中有效地表达。重组核酸序列可包含在如本文所公开的载体上。在不同实施方案中，本发明的方法是以下方法：葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖转化为DDG，或者葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖转化为FDCA，或者葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖转化为DTHU或DEHU，或者DDG转化为FDCA。所述方法可包括将在方法中的起始底物转化为产物。起始底物是被视为开始该方法的化学实体且产物是被视为方法的最终产物的化学实体。中间体是在方法中生成(暂时地或永久地)且在起始底物与产物之间的反应途径中存在的那些化学实体。在不同实施方案中，本发明的方法和途径具有约四个或约五个中间体或4-5个中间体、或约3个中间体、或3-5个中间体、或小于6或小于7或小于8或小于9或小于10或小于15或小于20个中间体，意味着这些值没有将起始底物或最终产物算在内。本发明提供从葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖生产FDCA和/或DDG的方法，其具有高产率。理论产率是如果反应在理想条件下完成的话将形成的产物的量。在不同实施方案中，本发明的方法从葡萄糖、果糖或半乳糖生产DDG，其理论产率为至少50摩尔％、或至少60摩尔％或至少70摩尔％、或至少80摩尔％、至少90摩尔％或至少95摩尔％或至少97摩尔％或至少98摩尔％或至少99摩尔％，或理论产率为100摩尔％。本发明的方法还可提供具有以下碳保存率的产物：至少80％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％或100％，意味着在初始底物中存在的具体碳原子以所列举的百分比存在于方法的最终产物中。在一些实施方案中，所述方法经由脱水反应从葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖生产DDG和/或FDCA。示例性合成途径本发明还提供用于合成和产生所需产物的特定途径。任何以下所述路线或途径都可从葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖开始并且向所需产物移动。在一些实施方案中，D-葡萄糖是起始底物并且朝向途径的中间体或最终产物的途径方向被认为是下游方向，而朝向葡萄糖的相反方向被认为是上游方向。应该认识到，路线或途径可以下游或上游方向移动。虽然葡萄糖被用作本文所述的途径的示例性起始底物，但还应理解的是蔗糖、果糖、半乳糖或甘露糖或在任何途径中的任何中间体也可以是本发明任何方法中的起始底物，并且DDG、DTHU、FDCA或本发明的任何路线或途径中的任何中间体都可以是本发明方法的最终产物。因此，所公开的方法包括本发明的任何路线或途径中所公开的任何一个或多个步骤，使用所公开的路线或途径中的一个或多个步骤将任何起始底物或中间体转化为所公开的路线或途径中的任何最终产物或中间体。因此，举例来说，所述方法可以是以下方法：用于将葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖转化为DDG、或转化为古罗糖醛酸、或转化为半乳糖酸、或转化为DTHU、或转化为DEHU、或转化为古罗糖醛酸、或转化为艾杜糖醛酸、或转化为艾杜糖二酸、或转化为葡糖二酸；或者用于将半乳糖酸转化为DDG；或用于将古罗糖醛酸转化为D-葡糖二酸；或用于将5-KGA转化为L-艾杜糖醛酸；或用于将L-艾杜糖醛酸转化为艾杜糖二酸；或用于将5-KGA转化为2，5-DDH或DTHU；或用于将DHG转化为DEHU。在这些实施方案中，所述方法利用本发明的方法和途径中所公开的步骤，从起始底物到相关最终产物。这些步骤中的一个或多个也可在方法中使用，以来自本文所公开的途径的“逆向”或上游方向移动。路线1示于图2a中。路线1经由一系列所示步骤经由酶促途径将D-葡萄糖(或途径中的任何中间体)转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)。路线1经由具有以下的途径将D-葡萄糖转化为DDG：具有1，5-葡糖酸内酯、葡糖酸、3-脱氢-葡糖酸(DHG)、4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)及4-脱氧-L-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)作为中间体且DDG作为最终产物。对于任何途径，也可存在未示出的额外中间体。这些步骤是D-葡萄糖酶促转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为葡糖酸(步骤1A)；葡糖酸酶促转化为3-脱氢-葡糖酸(DHG)(步骤2)；3-脱氢-葡糖酸(DHG)酶促转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步骤3)；4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)酶促转化为4-脱氧-L-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步骤4)；以及4-脱氧-L-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)酶促转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)(步骤5)。路线1还包括子路线，其中作为底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为作为最终产物的任何其他下游中间体，并且每条底物至产物的子路线都被视是如同每个都在本文中详细阐述一般公开。路线2示于图2b中并且将D-葡萄糖转化为DDG。路线2途径中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为葡糖酸(步骤1A)；葡糖酸酶促转化为古罗糖醛酸(步骤6)；古罗糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸(步骤7)；D-葡糖二酸酶促转化为DDG(步骤8)。路线2还包括子路线，其中作为底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线2中所述的一个或多个步骤将作为底物的葡萄糖或葡糖酸转化为作为产物的古罗糖醛酸或D-葡糖二酸的步骤。路线2A示于图2c中。途径2A中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸内酯(步骤19)；古罗糖醛酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸(步骤1B)；古罗糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸(步骤7)；D-葡糖二酸酶促转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)(步骤8)。路线2A还包括子路线，其中作为起始底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线2A中所述的一个或多个步骤将作为底物的葡萄糖或古罗糖醛酸内酯转化为作为产物的葡糖二酸或DDG的步骤。路线2B示于图2d中。路线2B中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为葡糖酸(步骤1和1A)；葡糖酸酶促转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)(步骤14)；5-KGA酶促转化为L-艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸酶促转化为艾杜糖二酸(步骤7B)；艾杜糖二酸酶促转化为DDG(步骤8A)。路线2B还包括子路线，其中作为起始底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线2B中所述的一个或多个步骤将作为底物的葡萄糖或5-KGA转化为作为产物的艾杜糖醛酸或艾杜糖二酸的步骤。路线2C示于图2e中。路线2C中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为葡糖酸(步骤1和1A)；葡糖酸酶促转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)(步骤14)；5-KGA酶促转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步骤16)；4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)酶促转化为4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步骤4)；DTHU酶促转化为DDG(步骤5)。路线2C还包括子路线，其中作为起始底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线2C中所述的一个或多个步骤将作为底物的葡萄糖或葡糖酸转化为2，5-DDH或DTHU的步骤。路线2D示于图2f中。路线2D中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为葡糖酸(步骤1和1A)；葡糖酸酶促转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)(步骤14)；5-KGA酶促转化为艾杜糖醛酸(步骤15)；L-艾杜糖醛酸酶促转化为DTHU(步骤17)；DTHU酶促转化为DDG(步骤5)。路线2D还包括子路线，其中作为起始底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线2D中所述的一个或多个步骤将作为底物的葡萄糖或5-KGA转化为L-艾杜糖醛酸或DTHU的步骤。路线2E示于图2g中。路线2D中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为1，5-葡糖酸内酯(步骤1)；1，5-葡糖酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸内酯(步骤19)；古罗糖醛酸内酯酶促转化为古罗糖醛酸(步骤1B)；古罗糖醛酸酶促转化为4-脱氧-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(步骤17A)；DEHU酶促转化为3-脱氧-D-赤型-2-己酮糖二酸(DDH)(步骤7A)。路线2E还包括子路线，其中作为起始底物的葡萄糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线2E中所述的一个或多个步骤将作为底物的葡萄糖转化为古罗糖醛酸或DEHU的步骤。路线2F示于图2h中。路线2F中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为葡糖酸(步骤1和1A)；葡糖酸酶促转化为古罗糖醛酸(步骤6)；古罗糖醛酸酶促转化为4-脱氧-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(步骤17A)；DEHU酶促转化为3-脱氧-D-赤型-2-己酮糖二酸(DDH)(步骤7A)。路线2F还包括子路线，其中使用路线2F的一个或多个步骤将作为起始底物的葡萄糖或葡糖酸或途径中的任何中间体转化为古罗糖醛酸或DDH或任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。路线3示于图3a中。路线3中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为葡糖酸(步骤1和1A)；葡糖酸酶促转化为3-脱氢-葡糖酸(DHG)(步骤2)；DHG酶促转化为4-脱氧-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(步骤6A)；DEHU酶促转化为DDG(步骤7A)。路线3还包括子路线，其中使用路线3的一个或多个步骤将作为起始底物的葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖或途径中的任何中间体转化为葡糖酸或DDH或路线3的任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。路线4示于图3b中。路线4中的步骤是D-葡萄糖酶促转化为a-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖(步骤9)；a-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖酶促转化为a-D-葡吡喃糖醛酸(步骤10)；a-D-葡吡喃糖醛酸酶促转化为D-葡糖二酸1，5-内酯(步骤11)；D-葡糖二酸1，5-内酯酶促转化为D-葡糖二酸(步骤1C)；D-葡糖二酸酶促转化为DDG(步骤8)。路线4还包括子路线，其中使用路线4的一个或多个步骤将作为起始底物的葡萄糖或途径中的任何中间体转化为葡糖二酸或DDG或任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。路线5示于图3c中。路线5中的步骤是D-半乳糖酶促转化为D-半乳糖-己二醛糖(步骤9A)；D-半乳糖-己二醛糖酶促转化为半乳糖醛酸(步骤10A)；半乳糖醛酸酶促转化为半乳糖酸(步骤11A)；半乳糖酸酶促转化为DDG(步骤13)。路线5还包括子路线，其中作为起始底物的半乳糖或途径中的任何中间体都被转化为任何其他下游中间体作为最终产物，并且每条子路线都被视为如同每个都在本文中详细阐述一般公开。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括使用路线5中所述的步骤将半乳糖或另一底物转化为半乳糖醛酸盐或半乳糖酸的步骤。在各种其他实施方案中，本发明提供一种从起始底物生产酶促和/或化学途径的产物的方法，所述方法包括执行步骤1，然后是步骤19，然后是步骤1B，以产生古罗糖醛酸产物。任选地，所述途径可继续进行步骤7以产生葡糖二酸。在另一实施方案中，所述方法包括执行步骤1和1A，然后是步骤14，然后是步骤15，以产生艾杜糖醛酸。任选地，所述方法可继续进行步骤7B以产生艾杜糖二酸产物或进行步骤17以产生DTHU。在另一实施方案中，所述方法包括执行步骤1和1A，然后是步骤14，然后是步骤16以产生2，5-DDH产物。在另一实施方案中，所述方法包括执行步骤1，然后是步骤19，以产生古罗糖醛酸内酯。酶促步骤已公开了广泛多种可执行本文所述的方法步骤的酶(及编码酶的核酸)。在本发明的酶促步骤中利用的酶可以是蛋白质或多肽。除用于执行本发明步骤的本文所公开的酶家族和类别之外，与本文所公开的任何酶或核酸或与SEQIDNO1-84中的任一个具有序列同一性的同源物也适用于本发明。是SEQIDNO：1-84的同源物的酶和核酸与SEQIDNO：1-84的任何核酸或酶或与本文所公开的酶类别的成员具有至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％的序列同一性。相对于氨基酸或核苷酸序列的序列同一性或同源性百分比在本文中被定义为氨基酸或核苷酸残基在与已知多肽相同的候选序列中的百分比，必要时，比对序列的最大同一性百分比并引入缺口，以便实现最大同一性或同源性百分比。在核苷酸或氨基酸序列水平下的同源性或同一性可使用本领域中已知的方法测定，包括但不限于使用由程序blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx(Altschul(1997)，NucleicAcidsRes.25，3389-3402，及Karlin(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，2264-2268)所采用的算法的BLAST(基本局部比对检索工具)分析，这些程序是专为序列相似性检索。或者，也可使用任何酶或编码所述酶的核酸或本文所公开的SEQIDNO1-84的任何酶或核酸的功能片段。术语“功能片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部缺失(其可被取代以形成嵌合蛋白)的多肽，其中剩余氨基酸序列与参照序列中的相应位置具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，和/或保持约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％全长多肽的活性。EC编号提供国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)的酶命名。在其他实施方案中，功能片段保留对由SEQIDNO：1-84编码的蛋白质活性所需的辅因子存在的要求。还公开了具有以下序列的表达载体：SEQIDNO：4-6、20-32、36-38、47-54、56、62-66、69-70、72以及79-84。所述载体可为细菌、酵母或海藻载体。为基因表达而设计的载体还可包括在携带载体的生物体中有活性并与本发明序列可操作地连接的启动子。载体可含有与以下序列可操作地连接的启动子或表达控制序列：SEQIDNO：4-6、20-32、36-38、47-54、56、62-66、69-70、72以及79-84或其任一者的密码子优化序列。“启动子”是指能够结合RNA聚合酶以便在5’至3’(“下游”)方向上启动基因转录的核酸序列。当RNA聚合酶与启动子的结合是所述基因转录的近因时，序列“可操作地连接”至启动子。步骤1-葡萄糖转化(氧化或脱氢)为1，5-葡糖酸内酯。此步骤可用各种酶进行，如氧依赖性葡萄糖氧化酶家族(EC1.1.3.4)或NAD(P)-依赖性葡萄糖脱氢酶家族(EC1.1.1.118、EC1.1.1.119)。已显示当在发酵罐中生长时，氧化葡糖杆菌将葡萄糖有效地氧化为葡糖酸和5-酮葡糖酸(5-KGA)。可使用见于葡糖杆菌属及其他氧化细菌中的可溶性和膜结合PQQ-依赖性酶家族的酶(EC1.1.99.35和EC1.1.5.2)。醌蛋白葡萄糖是适用于进行此步骤的另一种酶。选出的特定酶将取决于所需反应条件和将存在于反应中的必需的辅因子，其示于表1中。步骤1A-1，5-葡糖酸内酯转化(例如水解)为葡糖酸。此步骤可在含水介质中以化学方式进行并且水解速率取决于pH(Shimahara，K，Takahashi，T.，Biochim.Biophys.Acta(1970)，201，410)。水解在碱性pH(例如pH7.5)下较快且在酸性pH下较慢。许多微生物还含有特定的1，5-葡糖酸内酯水解酶，且它们中有一些已被克隆和表征(EC3.1.1.17；Shinagawa，EBiosci.Biotechnol.Biochem.2009，73，241-244)。步骤1B-古罗糖醛酸内酯转化为古罗糖醛酸。古罗糖醛酸内酯的化学水解可通过在水溶液中的自发反应完成。能够催化此水解的酶是在众多内酯酶之中被鉴定(EC3.1.1.XX及更具体地，3.1.1.17、3.1.1.25)。步骤2-葡糖酸转化为3-脱氢葡糖酸(DHG)：几种酶，如葡糖酸脱水酶，可用于葡糖酸脱水成脱氢葡糖酸(DHG)的反应中。实例包括属于葡糖酸脱水酶家族的那些(EC4.2.1.39)。所述脱水酶的一个特定实例已显示对葡糖酸进行脱水(Kim，S.Lee，S.B.Biotechnol.BioprocessEng.(2008)，13，436)。来自此家族及其克隆的酶的具体实例示于实施例1中。步骤3：3-脱氢-葡糖酸(DHG)转化为4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。已描述用于进行此转化的酶，2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸5-脱氢酶(或DHG脱氢酶)(EC1.1.1.127)。步骤4：4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)转化为4-脱氧-L-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)。EC5.3.1.12家族的酶可用于此步骤，并且步骤15显示五种所述酶被克隆并展现具有用于5-KGA脱水的活性。这些酶还展示针对2，5-DDH和DTHU的活性。步骤5：DTHU转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)。DDG可由例如用温和的化学催化剂进行的DTHU的化学或酶促氧化产生，所述化学催化剂能够在醇存在下氧化醛。醛氧化酶可用于催化此氧化反应。氧化细菌如醋杆菌属和葡糖杆菌属(Hollmann等人GreenChern.2011，13，226)将适用于筛选。以下家族的酶可进行此反应：醛氧化酶EC1.2.3.1、醛铁氧化还原蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.5)、以及在EC1.2.1.-XX的所有家族中。糖醛酸脱氢酶(EC1.1.1.203)家族的酶(例如，参见步骤7)也将具有此活性。可使用具有醇和醛氧化活性的其他酶，包括醛醇氧化酶家族中的酶(参见，步骤19和6)。其他广泛的底物氧化酶包括可溶性和膜结合的PQQ-依赖性醇/醛氧化酶。更具体地说，属于I型(EC1.1.9.1)和II型(EC1.1.2.8)家族的可溶性周质PQQ氧化酶及其同源物以及属于EC1.1.5.X家族的膜结合的PQQ氧化酶是适用的。在其他实施方案中，可使用作用于DTHU的醛脱氢酶/氧化酶。步骤5也可使用来自醋酸细菌属如葡糖杆菌属和醋酸杆菌属及葡糖酸醋酸杆菌属等的脱氢酶进行。通过就DTHU的氧化筛选微生物来鉴定全细胞活性。鉴定活性并克隆一种或多种酶。还筛选在步骤7和7B中所述的具有糖醛酸脱氢酶活性的酶并且发现具有此活性。还克隆可溶性周质和膜结合的PQQ依赖性酶的文库并且发现若干酶具有此活性。发现其中具有活性的一些酶是NAD(P)-或PQQ-依赖性脱氢酶，而其他是FAD依赖性醛脱氢酶。SEQIDNO：71-72是NADP依赖性脱氢酶的实例，并且其中的任一个或组合都可用于进行步骤5。SEQIDNO：73-84是合适的PQQ依赖性脱氢酶的实例，并且其中的任一个或组合都可用于进行步骤5。步骤6和6A：葡糖酸转化为古罗糖醛酸(6)且3-脱氢-葡糖酸(DHG)转化为4-脱氧-5-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(6A)。在步骤5中所述的酶适用于这些转化。其他有用的酶包括EC1.1.1.XX家族中的NAD(P)-依赖性脱氢酶且更具体地说葡糖醛酸脱氢酶(EC1.1.1.19)、葡糖醛酸内酯还原酶(EC1.1.1.20)。另外，大量具有包括糖的宽底物范围的O2依赖性醇氧化酶将是有用的(EC1.1.3.XX)，包括山梨醇/甘露醇氧化酶(EC1.1.3.40)、己糖氧化酶(EC1.1.3.5)、醇氧化酶(EC1.1.3.13)以及香草醛氧化酶(EC1.1.3.38)。PQQ依赖性酶及在氧化细菌中存在的酶也可用于这些转化。步骤7和7B：古罗糖醛酸转化为D-葡糖二酸(7)且L-艾杜糖醛酸转化为艾杜糖二酸(7B)。这些步骤可用糖醛酸脱氢酶家族的酶(EC1.1.1.203)或如本文所述的氧化酶完成。糖醛酸脱氢酶的实例包括SEQIDNO：1-6，并且其中的任一个或任何组合都可用于进行步骤7和7B。步骤7A：4-脱氧-5-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)转化为3-脱氧-D-赤型-2-己酮糖二酸(DDH)。步骤5中所述相同的酶将适用于进行此转化。类似于步骤5，对于步骤7和7B来说，鉴定具有所述活性的酶，其是NAD(P)-或PQQ-依赖性脱氢酶，而其他是FAD依赖性醛脱氢酶。NADP依赖性葡糖酸-5-脱氢酶的实例包括SEQNO：71-72且PQQ依赖性脱氢酶的实例包括SEQIDNO：73-84，并且其中的任一个或任何组合都可用于进行步骤7和7B。步骤8和8A：D-葡糖二酸转化为5-脱氢-4-脱氧-葡糖二酸(DDG)(步骤8)和艾杜糖二酸转化为DDG(步骤8A)。葡糖二酸脱水酶家族的酶(EC4.2.1.40)可用于进行这些步骤。此家族的酶已被克隆并且已显示葡糖二酸有效地转化为DDG。如以下克隆的葡糖二酸脱水酶的表中所示克隆两种D-葡糖二酸脱水酶(EC4.2.1.40)。两种酶对于葡糖二酸脱水为DDG展示极高活性，使用氨基脲测定，如步骤2中所述。克隆的葡糖二酸脱水酶步骤9和9A：D-葡萄糖转化为α-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖(9)且D-半乳糖转化为D-半乳糖-己二醛糖(9A)。氧化酶，如半乳糖氧化酶家族的那些(EC1.1.3.9)，可用于此步骤。突变半乳糖氧化酶也被工程化以对葡萄糖具有活性且已有描述(Arnold，F.H.等人ChemBioChem，2002，3(2)，781)。步骤9A可用类别EC1.1.3.9的酶进行。步骤10：α-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖转化为α-D-葡吡喃糖醛酸(步骤10)且D-半乳糖-己二醛糖转化为半乳糖醛酸(10A)此步骤可使用醛脱氢酶家族的酶进行。同样，由步骤5的那些所鉴定的酶将适用于这两个转化。步骤11和11A：α-D-葡吡喃糖醛酸转化为葡糖醛酸1，5-内酯。如步骤5中所述的醛脱氢酶和氧化酶将适用于进行此步骤。在步骤7和7B中所述的糖醛酸脱氢酶也可适用于进行此步骤。步骤11A是半乳糖醛酸转化为半乳糖酸。糖醛酸脱氢酶(EC1.1.1.203)，例如在步骤7和7B中所述的那些，将适用于进行此步骤。步骤12：果糖转化为葡萄糖。葡萄糖和果糖异构酶(EC5.3.1.5)将适用于进行此步骤。步骤13：半乳糖酸转化为5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸(DDG)。半乳糖酸脱氢酶家族的酶(EC4.2.1.42)可用于进行此步骤，且额外的酶可被工程化用于进行此步骤。步骤14：葡糖酸转化为5-酮葡糖酸(5-KGA)。NAD(P)-依赖性脱氢酶家族(EC1.1.1.69)的许多酶已被克隆并对葡糖酸的氧化或5KGA的还原具有活性。举例来说，合成来自葡糖杆菌属(ExpasyP50199)的NADPH依赖性葡糖酸5-脱氢酶用于如本文所示在大肠杆菌中的最佳表达并且在pET24(pSGI-383)中进行克隆。表达所述酶并显示其具有所需活性。适用于进行此步骤的额外的酶包括存在于葡糖杆菌属中的PQQ依赖性酶家族中的那些(Peters，B.等人Appl.MicrobiolBiotechnol.，(2013)，97，6397)以及在步骤6中所述的酶。来自这些家族的酶也可用于从葡糖酸合成5KGA。步骤15：5-KGA转化为L-艾杜糖醛酸。此步骤可用来自不同异构酶家族的各种酶进行，如在实施例4中进一步描述。实例包括SEQIDNO：7-19的异构酶或与SEQIDNO：7-19的异构酶具有至少70％序列同一性的同源物；或由SEQIDNO：20-32的核酸编码的异构酶或其中任一个的同源物。步骤16：5-KGA转化为(4S)-4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。此脱水可用葡糖酸脱水酶家族中的酶(EC4.2.3.39)，如实施例5或步骤17中的所述的那些进行。可用于步骤16的葡糖酸脱水酶的实例包括SEQIDNO33-35(由SEQIDNO：36-38编码，且其中的任一个或任何组合都可用于进行步骤16或其同源物。步骤17和17A：L-艾杜糖醛酸转化为4-脱氧-5-苏型-己酮糖糖醛酸(DTHU)且古罗糖醛酸转化为4-脱氧-赤型-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)。鉴定可用于进行此步骤的脱水酶家族的酶。来自葡糖酸或葡糖二酸脱水酶家族的酶将具有进行这些步骤的所需活性。此外，许多脱水酶家族(EC4.2.1.X)适用于进行这些步骤。具体说来，对1，2-二羟酸脱水以选择性地产生2-酮酸的酶将是有用的，如以下家族的酶：EC4.2.1.6(半乳糖酸脱水酶)、EC4.2.1.8(甘露糖酸脱水酶)、EC4.2.1.25(阿拉伯糖酸脱水酶)、EC4.2.1.39(葡糖酸脱水酶)、EC4.2.1.40(葡糖二酸脱水酶)、EC4.2.1.67(岩藻糖酸脱水酶)、EC4.2.1.82(木糖酸脱水酶)、EC4.2.1.90(鼠李糖酸脱水酶)以及二羟酸脱水酶(4.2.1.9)。由于已知的酶选择性是α-酮酸的产生，所以鉴定的酶将分别产生DEHU和DTHU作为反应产物。步骤19：1，5-葡糖酸内酯转化为古罗糖醛酸内酯。此步骤可通过醛醇氧化酶家族的酶(EC1.1.3.41)或在步骤6中所述的酶进行。可用于步骤19的醛醇氧化酶的实例包括SEQIDNO39-54或其任一个的同源物，或由SEQIDNO：47-54的核酸编码的醛醇氧化酶或其任一个的同源物；并且其中的任一个或任何组合都可用于进行。步骤19.DDG转化为FDCA以及制造酯化的DDG和FDCA的方法。本发明还提供DDG转化为FDCA和FDCA酯的新型方法。FDCA的酯包括二乙酯、二丁酯及其他酯。所述方法包括通过DDG与醇、无机酸及任选的助溶剂接触以产生DDG的衍生物来将DDG转化为DDG酯。醇可为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇、二十醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、聚乙二醇、甲基异丁基酮、或任何C1-C20醇。无机酸可为硫酸、磷酸、高氯酸、硝酸、盐酸、氢氟酸、氢溴酸及氢碘酸。助溶剂可为以下任一种或任何混合物：THF、丙酮、乙腈、醚、乙酸丁酯、二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。醇、无机酸及助溶剂的任何组合都可用于反应中。酯化的DDG可随后转化为酯化的FDCA，例如通过将其与酸催化剂接触而实现。DDG纯化用于脱水或酯化的DDG纯化是通过酸化DDG，例如通过借助于添加浓HCl将反应的pH降至pH～2.5来进行。在此pH下，通过过滤除去蛋白质和任何残余的葡糖二酸沉淀并且对混合物进行冻干以得到由DDG和反应盐组成的白色粉末。在通过过滤除去酶之后，可在中性pH下冻干混合物。在没有进一步纯化的情况下，DDG可随后被脱水以得到2，5-FDCA，或在脱水之前被酯化成二丁基DDG(或二乙基DDG)。纯化或酯化DDG的一个或多个步骤可添加到本文所公开的产生DDG的任何方法和途径中。也可使用从含水混合物中纯化DDG的其他方法。这些方法包括使用捕获盐或DDG等的膜或离子交换树脂进行分离。因此，本发明提供一种纯化DDG的方法，其包括在溶液中酸化DDG，经由滤膜过滤溶液，并且从溶液中(例如通过冷冻干燥或喷雾干燥)除去水。含有DDG的溶液可被酸化至2.5-3.5的pH或3.0-4.0的pH或3.5-4.5的pH或4.0-5.0的pH或4.5-5.5的pH或5.0-6.0的pH或5.5-6.5的pH或6.0-7.0的pH或6.5-7.5的pH或7.0-8.0的pH或7.5-8.5的pH或约8的pH。除去的水量可大于80％或大于85％或大于87％的水或大于90％的水或大于95％的水或大于97％或大于98％或大于99％来自包含DDG的溶剂的水。可获得大于25摩尔％或30摩尔％或35摩尔％或40摩尔％或45摩尔％的产率。在一个实施方案中，所述方法不包括离子交换色谱步骤。用于合成FDCA和FDCA衍生物的方法本发明还提供合成FDCA的各种方法。用于合成FDCA的一种方法包括将DDG与醇、无机酸在高温下接触以形成FDCA。醇可为任何醇(例如，如上所述的那些中的任一种)，并且实例包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇及丁醇。也可使用二醇。高温可为大于70℃或大于80℃或大于90℃或大于100℃或大于110℃或大于120℃或大于130℃或大于140℃或大于150℃的温度以形成FDCA。可实现大于20％或大于30％或大于35％或大于40％的反应产率。本发明还提供用于合成FDCA衍生物的方法。所述方法包括将DDG的衍生物与无机酸接触以产生FDCA的衍生物。无机酸可为例如硫酸或任何无机酸，如以上所述的那些。任选地，可在其与第二无机酸接触之前纯化DDG的衍生物。DDG或FDCA的衍生物的非限制性实例包括但不限于：甲基DDG、乙基DDG、丙基DDG、丁基DDG、异丁基DDG、二甲基DDG、二乙基DDG、二丙基DDG、二丁基DDG。所产生的FDCA的衍生物可为但不限于甲基FDCA、乙基FDCA、丙基FDCA、丁基FDCA、二甲基FDCA、二乙基FDCA、二丙基FDCA、二丁基FDCA以及异丁基FDCA。所产生的FDCA的衍生物对应于方法中使用的DDG的衍生物。FDCA的衍生物可随后被去酯化以产生FDCA。所述方法也可在气相中，例如使用如下所述的参数进行。用于合成FDCA或FDCA衍生物的另一种方法包括将DDG或DDG衍生物(任何本文所述的)与无机酸在气相中接触，这可在以下短停留时间下完成，例如小于10秒或小于8秒、或小于6秒或小于5秒或小于4秒或小于3秒或小于2秒或小于1秒。停留时间是指样品存在于高温流过型反应器的反应区中的时间。所述方法也可在高温下进行，例如在大于150℃、大于200℃、大于250℃、大于300℃或大于350℃的温度下。可获得大于25摩尔％或大于30摩尔％或大于40摩尔％或大于45摩尔％或大于50摩尔％的产率。用于合成FDCA的另一种方法包括将DDG与无机酸在超过80℃或90℃或100℃或110℃或120℃的温度下接触。用于合成FDCA的另一种方法包括将DDG与无机酸在无水反应条件下接触。在不同实施方案中，无水条件可通过在本文所公开的合成FDCA的任何方法中冻干DDG以使得DDG含有以下含量的水来建立：小于10重量％或小于9重量％或小于8重量％或小于7重量％或小于6重量％或小于5重量％或小于4重量％或小于3重量％水或小于2重量％的水。如本文所述用于合成FDCA及其衍生物的本发明方法提供比已经可利用的明显更高的产率。在不同的实施方案中，可获得以下FDCA(对DDG)的摩尔产率：大于10％或大于15％或大于20％或大于25％或大于30％或大于35％或大于40％或大于45％或大于50％或大于60％或大于65％、或约40％至约70％、或约45％至约65％、或约50％至约60％。实施例实施例1-步骤2，葡糖酸转化为3-脱氢-葡糖酸(DHG)具有用于葡糖酸脱水的天然活性的酶适用于本发明中(EC4.2.1.39)。来自这个家族的三种酶如表1所示被克隆。酶pSGI-365被克隆并且被证明是具有宽底物范围的脱水酶，其对于葡糖酸的脱水具有强活性(Kim，S.Lee，S.B.Biotechnol.BioprocessEng.2008，13，436)。表1：在此实验中使用的酶及同一性同源性。所有都在荧光假单胞菌中表达359_无色杆菌属365_E3HJU7pSGI-360_不动杆菌属(SGI)7879pSGI-359_无色杆菌属(SGI)95pSGI-365_气单胞菌属蛋白359、360及365(分别为SEQIDNO33-35)对于葡糖酸的脱水合成(凝胶未示出)展示每mg为2-5μmol/min的粗酶裂解物活性。将pSGI-359通过用硫酸铵沉淀并重新溶解于缓冲液中来分离并且通过氨基脲测定进行分析。由氨基脲测定图计算出针对葡糖酸脱水的46.2U/mL或5.3U/mg(1单位＝μmol/min)的活性。将含有Kpi10mMpH8.0且具有2mMMgCl2和3.5gr(0.016摩尔)葡糖酸钠的反应缓冲液(93mL)与7mL先前的葡糖酸脱水酶溶液混合。将反应物在45℃下培养16h，之后通过HPLC-MS分析一个等分试样(图4)。如图4所示，产生具有DHG的分子量的一种新的主要产物。该产物还显示具有DHG脱水酶的活性。所有蛋白质都在pRANGERTM(Lucigen，Middleton，WI)表达载体上克隆并在荧光假单胞菌菌株中表达。pRANGERTM是广泛的宿主可商购获得的质粒载体，其含有pBBR1复制子、卡那霉素抗性及用于基因的诱导型表达的pBAD启动子。对于酶测定，将用于量化α酮酸的氨基脲测定的修改版本用于计算每种酶的活性(Kim，S.；Lee，S.B.BiochemJ.2005，387，271)。SEQIDNO：30-32和33-35显示分别为葡糖酸脱水酶#0385、#0336及E3HJU7的氨基酸及核苷酸序列。实施例2-步骤3-3-脱氢-葡糖酸(DHG)转化为(4S)-4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。酶家族(EC1.1.1.127)可用于进行此步骤。两个实例是2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸5-脱氢酶和DHG脱氢酶。来自此家族的五种酶如下表2中所示进行克隆。pRANGERTM载体用于每个情况。表2：DHG氧化还原酶(或2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸5-脱氢酶)的克隆由步骤2中的葡糖酸的脱水制备的产物被用作分析表2的裂解物的底物。如下表3中所示，在测量NADH形成的测定中鉴定对于DHG的氧化显示活性的酶(在340nm下吸光度提高)。表3：使用DHG氧化还原酶的DHG氧化为2，5-DDH的活性计算。单位＝μmol/min的NADH通过这些酶形成2，5-DDH的进一步验证示于步骤16中，其中显示在酸性pH下用pSGI-395还原2，5-DDH(通过5KGA的脱水制得)。实施例3-步骤7和7B-古罗糖醛酸转化为D-葡糖二酸(7)且L-艾杜糖醛酸转化为艾杜糖二酸(7B)。为了证明步骤7和7B，进行以下研究。糖醛酸脱氢酶(EC1.1.1.203)是氧化葡糖醛酸和半乳糖醛酸的酶。从表4和5中所示的菌株克隆与已知糖醛酸脱氢酶具有序列相似性的三种酶(Expasy：Q7CRQ0；Prather，K.J等人，J.Bacteriol.2009，191，1565)。表4-克隆的糖醛酸脱氢酶生物体pSGI(pET28)基因ID表达土壤杆菌#474#8807BL21DE3根瘤菌#475#8958BL21DE3假单胞菌#476#1770BL21DE3表5-序列同一性#475#476Q7CRQ0474_土壤杆菌734990475_根瘤菌5174476_假单胞菌50用来自pET28的His标签表达每种蛋白并且在其筛选之前进行纯化。粗裂解物和纯化酶的蛋白质凝胶示于图1的凝胶中。在纯化之后，关于针对葡糖醛酸盐的活性以及针对古罗糖醛酸盐和艾杜糖醛酸盐的活性对所有酶进行测试。在不同的底物浓度下进行动力学测量并且为每种酶计算的活性和Km值示于表6中。所有酶都显示针对葡糖醛酸盐以及针对L-艾杜糖醛酸和古罗糖醛酸的良好活性。表6：纯化的糖醛酸脱氢酶的活性和Km值。表4中所示的每个质粒都在BL21DE3大肠杆菌细胞中转化。将澄清的裂解物与等体积(25mL)的平衡缓冲液混合并在NiNTA柱上纯化。通过将0.050mL每种纯化酶的各种稀释液与0.95mL反应缓冲液(100mMTrisHCl，pH8.0、50mMNaCl、0.75mMNAD+)混合来测量每种纯化酶的活性。通过在340nm下监测NADH的形成来测量反应进程。图6a和6b提供葡糖醛酸盐和艾杜糖醛酸盐的氧化的Lineweaver-Burk绘图，其中所有三种酶都示于图6中。在给出上表所示活性的所有酶的情况下都获得了明显的正斜率。糖醛酸脱氢酶的蛋白质序列显示为SEQIDNO：1-3且基因显示为SEQIDNO：4-6。吡咯并喹啉(PQQ)依赖性醛脱氢酶也显示对于古罗糖醛酸盐和艾杜糖醛酸盐的氧化的良好活性。这些是可溶性周质酶，在它们的周质靶序列除去之后在大肠杆菌胞质液中表达。以每毫克总裂解物蛋白质的单位(μmol/min)计的粗裂解物的活性示于下表6A中。如果纯化的话，每种酶的实际活性是至少2-5倍高(参见图3中的表达)。表6A：在艾杜糖醛酸和古罗糖醛酸下PQQ依赖性脱氢酶的活性(单位＝μmol/min)酶艾杜糖醛酸U/mg古罗糖醛酸U/mgP75804(SEQIDNO：73)8.73.29522(SEQIDNO：74)7.36.16926(SEQIDNO：75)9.24.17510(SEQIDNO：76)7.33.77215(SEQIDNO：77)14.28.38386(SEQIDNO：78)4.31.5根据以下方案，使用人工电子受体DCPIP(2，6-二氯靛酚)测量表6A中所示的活性：在0.95mL含有0.2mMDCPIP、0.2mMPMS(phnazineethosulffate)及底物(10-40mM)的20mM三乙醇胺(pH8.0)中，添加0.050mL酶(作为粗裂解物或用缓冲液10-100x稀释)并且反应进展是根据在600nm下DCPIP吸光度的变化。因为在其自然状态下这些酶在膜电子传递链中将电子转移给其他蛋白质或辅因子，所以使用人工电子受体测量体外活性，其中DCPIP是最常见的。表6A中的酶针对许多其他醛有活性，包括丁醛、丁醛及甘油(而非葡萄糖)。因此，这些酶将氧化艾杜糖醛酸盐和古罗糖醛酸盐的醛基以分别得到艾杜糖醛酸和葡糖二酸。为了证实此选择性，这些酶中的两个，#403和#412，通过将其与#403(天然大肠杆菌酶)的周质靶序列融合而在大肠杆菌的周质中表达。两种蛋白质都在周质中表达，但与胞质液相比水平较低。之前的重组细胞以良好的产率将苯甲醛氧化为安息香酸且以较低产率由古罗糖醛酸盐和艾杜糖醛酸盐产生葡糖二酸和艾杜糖二酸。实施例4-步骤-15：5-酮葡糖酸(5-KGA)转化为L-艾杜糖醛酸(15)或古罗糖醛酸(15A)。此实施例说明了能够将5-KGA异构化为艾杜糖醛酸(步骤15)或古罗糖醛酸(步骤15A)的酶的鉴定。来自三个不同异构酶家族的十三种酶如表7所示被克隆，而其序列同一性％示于表8中。表7：所克隆的异构酶表8：异构酶的同一性％如表8所示，选择每个家族内具有中等同源性(加下划线)的酶进行克隆。数据证明来自所有家族的酶对于5-KGA的异构化(得到L-艾杜糖醛酸盐作为主要产物)都显示活性。来自5.3.1.17家族的两种酶(433和434)也在实施例中使用，显示从5-酮葡糖酸(5KGA)形成DDG。使用酶促方法测量使用表7的酶对于5KGA和艾杜糖醛酸的异构化的活性，该方法通过其针对两种不同酶的活性检测产物的形成。举例来说，5KGA的异构化是通过使用糖醛酸脱氢酶(pSGI-476)测量产物艾杜糖醛酸盐的活性来检测。艾杜糖醛酸的异构化是通过测量产物5KGA的5KGA还原酶(pSGI-383，EC1.1.1.69)活性来检测。还通过GC-MS检测产物的存在。来自所有家族的酶显示出针对5KGA和艾杜糖醛酸盐的异构化的变化活性将来自EC5.3.1.12的两种酶用于无细胞的反应中以便异构化5KGA且最终产生如实施例中所述的DDG。将酶纯化并且通过凝胶电泳显示出单个条带。将纯化的异构酶用于使用含有5KGA或艾杜糖醛酸的裂解物和缓冲液的反应中。使用HPLC和先前所述的酶促方法证明产物形成。使用HPLC和酶测定的培养17h的结果示于图7a中。所有酶都对5KGA和艾杜糖醛酸的异构化显示良好活性。通过pSGI433、pSGI434、pSGI435及pSGI436的艾杜糖醛酸异构化的产率当酶促测量时分别是56％、48％、42％(436未测量)且当通过HPLC测定测量时分别是78.8％、78.5％、73.3％及76.6％。通过相同酶的5KGA异构化的16h之后的产率当通过酶促测定测量时分别是18％、17％及19％(436未测量)，且当通过HPLC测定测量时分别是16.6％、17.8％、16.3％及16.9％。EC5.3.1.12酶来自EC5.3.1.12家族的酶(葡糖醛酸异构酶)也通过凝胶电泳纯化，分离，并通过与含有5mM的5KGA或艾杜糖醛酸的缓冲液(50mMHEPES、1mMZnCl2，pH8.0)混合制备反应物。将反应物在30℃下培养并且使用HPLC和酶促法分析产物形成。结果示于图7b中。5.3.1.17酶酶pSGI-478和pSGI-479(5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖醛酸异构酶)显示了针对5KGA和艾杜糖醛酸两者的异构化活性。此活性同样用如上的酶促测定来证实。通过pSGI-478和-479的艾杜糖醛酸的异构化产率当酶促测量时分别是50％和37％，且当通过HPLC测量时分别是20％和18％。5KGA异构化的产率当酶促测量时分别是23％和26％，且当通过HPLC测量时分别是24％和16％。结果示于图7a中。5.3.1.n1酶通过凝胶电泳纯化此家族中的酶。使用如上所述的酶促测定测量产物形成且结果示于图8中。在此家族中克隆的所有酶都显示对于5KGA和艾杜糖醛酸的异构化具有活性。在每个情况下，将质粒在BL21DE3中转化并且在NiNTA柱上纯化蛋白质。实施例5：步骤16-5-酮葡糖酸(5KGA)转化为(4S)-4，6-二羟基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。在步骤2(实施例1)中所述的三种葡糖酸脱水酶如实施例1中所述表达，连同来自步骤8的纯化的葡糖二酸脱水酶一起。进行针对活性的酶促反应并且HPLC-MS分析显示2，5-DDH的形成(图9)，其还通过以下事实来证实：新产物的形成伴随有仅在含有葡糖酸脱水酶的样品中的5-KGA的还原，并且还通过用DHG脱水酶(pSGI-395)的酶促测定。在340nm下的良好斜率表示当混合NADH、pSGI-395裂解物及先前反应物的等分试样时获得较大的酶活性(数据未示出)。此结果联合HPLC分析证明所检查的葡糖酸脱水酶将5KGA脱水为2，5-DDH。实施例6：步骤19-1，5-葡糖酸内酯转化为古罗糖醛酸δ-内酯。1，5-葡糖酸内酯氧化是来自醛醇氧化酶(EC1.1.3.41)家族的酶的副活性。这些酶氧化各种醛醇，如山梨糖醇、木糖醇、甘油等。鉴定对1，5-葡糖酸内酯的氧化具有活性的酶，如下表6中所示。表6.对1，5-葡糖酸内酯具有活性的醛醇氧化酶。*粗裂解物使用表6中所示的所有纯化酶的裂解物制备反应物。在50mM具有0.5mg/mL过氧化氢酶的K-磷酸盐缓冲液pH7.0中制备反应物并在30℃下培养。通过HPLC-MS分析观察新产物，在与可信标准比较之后展示与古罗糖醛酸相同的保留时间(图10)。这是通过GC-MS证实，其中产物还具有与古罗糖醛酸相同的MS指纹。因此，很明显在表中所述的醛醇氧化酶氧化1，5-葡糖酸内酯的6-OH以产生古罗糖醛酸内酯。在具有HisTag的pET28a中克隆所有的醛醇氧化酶并且在BL21DE3中表达并在NiNTA柱上纯化。实施例7-FDCA及其他中间体的合成纯化的DDG单钾盐被用于脱水成2，5-FDCA。添加硫酸到DDG中并且在60℃下搅拌反应。(通过HPLC-MS)计算的原位产率是～24％和～27％。合并反应溶液，然后通过倒入冰中(以中和热)来稀释。添加大致相等体积的THF，并且将溶液转移至分液漏斗。添加氯化钠盐直到实现分离。在添加之间搅动溶液以便最佳可能的溶解。除去水层，并且用NaCL饱和溶液洗涤THF层3x。添加硫酸钠并将溶液静置过夜。再次形成两层过夜。丢弃水层，然后添加硅胶到溶液中。随后经由旋转蒸发器将其浓缩成固体。将固体装载到二氧化硅快速柱中，然后经由色谱法分离。浓缩并干燥级分。分离产率是173.9mg。校正产率：24.9％。1H和13CNMR及HPLC-MS分析证实产物。DDG二丁基-2，5-FDCA在BuOH/H2SO4中的脱水使用Dean-Stark装置完成含有在BuOH中的脱水盐的非衍生化的冻干DDG的脱水。在这些条件下，添加DDG到BuOH中，然后添加H2SO4并在140℃下加热反应。在搅拌4h之后，HPLC-MS分析显示DDG消失并形成二丁基2，5-FDCA。(通过HPLC-MS)计算的原位产率是36.5％。.将混合物用水、1％NaOH及再次用水提取。随后浓缩有机层至37.21g的最终质量。除去此质量的一部分(3.4423g)并且使用HPLC纯化0.34g的二丁基-2，5-FDCA。将分离产物的产率外推至由反应分离的化合物的总量(37.21g)并且考虑到存在于原始DDG中的盐量(～60重量％纯的)，反应产率经计算为42％。1H和13CNMR及HPLC-MS分析证实产物。二丁基DDG的合成另一方面，本发明提供一种用于合成DDG衍生物的方法。所述方法包括将DDG与醇、无机酸及任选的助溶剂接触以产生DDG的衍生物。任选地，可纯化DDG的衍生物。反应可具有以下DDG衍生物的产率：至少10摩尔％产率或至少15摩尔％产率或至少20摩尔％产率或至少25摩尔％或至少30摩尔％或至少35摩尔％产率或至少40摩尔％产率。无机酸可为硫酸且醇可为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇或任何C1-C20醇。在不同实施方案中，助溶剂可为以下任一种：THF、丙酮、乙腈、醚、乙酸丁酯、二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。当醇为乙醇时，DDG衍生物将为DDG一乙酯和/或DDG二乙酯。当醇为丁醇时，DDG衍生物将为DDG一丁酯和/或DDG二丁酯。DDG单钾盐用于根据以下方案进行的衍生化。在配备有机械搅拌器和加热套的1L莫顿型凹入的反应容器中装入60∶40DDG∶KCl(31.2mmol)、BuOH及庚烷。在单独的小瓶中，添加硫酸到水中，并且允许在溶解之后冷却。随后添加溶液到烧瓶中。将溶液保持在30℃下。将沉淀滤掉，浓缩。将剩余的凝胶溶于EtOAc中，然后用溶液点样TLC板并且用磷钼酸混合物对板喷雾，接着在热板上加热至至少150℃以鉴定DDG-DBE级分。分离产率：4.62g(15.2mmol，47％产率)，＞98％纯度。1H和13CNMR及HPLC-MS分析证实产物。不同溶剂可用于DDG酯的合成中，如BuOH(5％-95％v/v)与以下助溶剂的混合物如THF、丙酮、乙腈、醚(二丁醚、二乙醚等)、酯如乙酸丁酯、1，6-二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。反应催化剂如酸(硫酸、盐酸、多磷酸或固定化酸如DOWEX)或基质(吡啶、乙胺、二乙胺、三氟化硼)或其他催化剂通常用于羧酸类的酯化。在n-BuOH/H2SO4中二丁基DDG脱水为二丁基FDCA在丁醇中制备DDG-DBE(二丁基酯)的储备溶液并转移到清洁的、干燥的100mL圆底烧瓶中，该烧瓶配备有搅拌棒。向烧瓶中添加25mL浓硫酸。密封烧瓶，接着在60℃下搅拌2小时。原位产率经计算为～56％。浓缩反应溶液并且将残余物溶于MTBE中并转移到分液漏斗，然后用水洗涤。浓缩回收的有机层，然后经由HPLC分离，分离产量：250.7mg(～90％纯度)和分离产率：35％(针对纯度来校正)。1C和13CNMR及HPLC-MS分析证实产物。实施例8-从5-KGA无细胞合成DDG和FDCA及衍生物(路线2A)此实施例说明了根据方案6(2B的子方案)使用纯化酶将5KGA酶促转化为DDG，并且还说明了使用化学步骤将所产生的DDG脱水为FDCA。所述方案包括以下步骤：5KGA的异构化(步骤15)且接着氧化为艾杜糖二酸(步骤7B)。DDG还在不同化学条件下脱水为FDCA。使用来自大肠杆菌的葡糖二酸脱水酶进行最后一步(步骤8A)。方案6示于图11中。所述方案使用从5-KGA开始的DDG的无细胞酶促合成进行。所述方案包括执行步骤15、7B及8A(参见图2d)。使用两种额外的蛋白质来完成反应路径，第一种为NADH氧化酶(步骤A)，其在氧的存在下将NAD+辅因子再循环；和过氧化氢酶(步骤B)，其分解由NADH氧化酶的作用产生的过氧化物。酶示于以下表7中。所有酶都含有HisTag并且使用Ni-NTA柱来纯化。DDG合成的产率经计算为至少88-97％。表7：针对反应的每种异构酶纯化500mL液体培养物。除表7中所示的酶之外，每个反应还含有50mMTrisHCl(pH8.0)、50mMNaCl、1mMZnCl2和2mMMgCl2、1mMMnCl2和1mMNAD+。在培养16h之后通过HPLC分析反应并且图12呈现色谱图。对于脱水为FDCA，将两个样品的反应混合物合并并且冻干成白色粉末，将其分成两个样品并将每个溶于具有0.25MH2SO4的AcOH中或具有0.25MH2SO4的4.5mLBuOH中。在120℃下，在密封小瓶中加热两个反应2-4h反应产物示于图13中。样品1和2分别代表可信标准和来自AcOH/H2SO4中的反应的3h时间点。用样品1对样品2进行掺加得到单峰，进一步证实了FDCA产物。样品1和3(图13)分别代表可信标准和来自BuOH/H2SO4中的反应的4h时间点。由酶促反应形成FDCA进一步证实了DDG在这些样品中的存在。实施例9-由葡萄糖和葡糖酸合成DDG此实施例显示葡萄糖和葡糖酸酶促转化为DDG。用纯化酶进行反应，且粗裂解物作为催化剂。如下表中所示在生物反应器中合并酶和底物：1.来自具有质粒的重组大肠杆菌的500mL液体培养物的裂解物2.来自BL21DE3/pSGI-434的2L液体培养物的裂解物3.纯化酶，～30个单位的活性(或3mg纯化的GlucD)4.来自250mL培养物的裂解物在35℃下培养反应物并且溶解氧和pH分别保持在20％和8。通过HPLC-MS分析时间点并且结果示于图17b中提取的色谱图验证DDG质量(未示出)和相应的MS片段。结果清楚地显示在用葡萄糖或葡糖酸进行的酶培养期间DDG的产生。实施例10-用于重组葡糖二酸脱水酶的表达盒的构建下列实施例描述含有D-葡糖二酸脱水酶活性(GDH，EC4.2.1.40)的编码序列的重组核酸构建体的形成用于在大肠杆菌细胞中异源表达。将编码来自大肠杆菌的D-葡糖二酸脱水酶(Expasy：P0AES2；)、不动杆菌属ADP1(Expasy：P0AES2)以及专有的假单胞菌菌株(#8114)的基因由基因组DNA进行PCR扩增。随后将每个PCR扩增基因克隆到细菌转化载体pET24a(+)中，其中每个GDH基因的表达都位于T7启动子的控制下。还通过测序确认证实每个PCR扩增插入物的核苷酸序列。实施例11-表达重组葡糖二酸脱水酶的大肠杆菌菌株将如实施例9中所述构建的每个表达载体通过热激介导的转化引入NovaBlue(DE3)大肠杆菌中。在补充有卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂上选出推定的转化体。将适当的PCR引物用于集落-PCR测定中以确定含有每个表达载体的阳性克隆。对于每个表达载体，从转化板中挑取菌落并允许其在30℃下在补充有卡那霉素(50μg/ml)的液体LB培养基中生长两天。随后将培养物转移到含有15％甘油的小瓶中并作为冷冻的纯培养物保存在-80℃下。实施例12-通过使用表达GDH酶的重组大肠杆菌细胞的细胞裂解物体外合成DDG的示范此实施例描述了如何使用在大肠杆菌细胞中产生的重组葡糖二酸脱水酶(GDH)实现DDG中间体的体外合成。细胞裂解物的制备：在30℃下，在转速预设为250rpm的旋转振荡器上将如先前在实施例2中所述构建的重组菌株单独在3mL补充有卡那霉素(50μg/ml)的液体LB培养基中生长1天。此预培养物被用于接种100mL含有卡那霉素(50ug/ml)的TB培养基，然后在30℃下在预设为250rpm的旋转振荡器上培养2-3小时直到早期对数期(OD600～0.5-0.6)，之后添加异丙基D-1硫代半乳糖苷(IPTG；0.25mM最终浓度)以诱导蛋白质表达。允许细胞在30℃下再生长18小时，之后将其通过离心收获，再悬浮于15mL溶解缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液pH7.8，2mMMgCl2)中并且通过超声处理来溶解。使用标准预制的SDS-PAGE凝胶系统(BioRad)量化重组酶在大肠杆菌细胞中的产生，并且根据Gulick等人(Biochemistry39，4590-4602，2000)所述的工序测量比放射性。随后测试粗细胞裂解物或纯化酶(使用HisTag)将一定克数的葡糖二酸转化为DDG的能力，如下文中更详细地描述。葡糖二酸的酶促脱水制备使用葡糖二酸脱水酶的葡糖二酸的大规模氧化。将350mL水、25g葡糖二酸钠盐(0.1摩尔)及4.5克KOH(0.8摩尔)在锥形烧瓶中混合。通过减缓添加5MKOH溶液(～3mL)溶解残留的固体葡糖二酸并且调节pH至7.4。在此溶液中添加100mg纯化的葡糖二酸脱水酶和2mMMgCl2，并且在30℃下将混合物置于轨道振荡器中20h。次日，通过过滤除去沉淀。反应的pH基本上未改变。反应分析展现在溶液中仅DDG存在，指示＞95％产率。来自酶促反应的DDG产物的纯化：通过使用如下两项技术中的任一种纯化经由酶促脱水产生的DDG。用6MHCl将酶促脱水反应酸化至pH～3.0，过滤以除去沉淀，且随后冻干以产生由DDG和盐组成的白色粉末。如果反应经由10KDa膜过滤以除去蛋白质然后冻干，可获得相同的DDG纯度(但较低量的盐)。在没有更进一步纯化的情况下，可将先前两个冻干粉末脱水成FDCA(或其酯)或可酯化为二丁基DDG，如本申请的其他实施例中所示。HPLC-MS分析的结果指示DDG产物构成由两项纯化技术的任一项获得的样品中收物的至少95％。实施例13-在一步化学反应中由DDG体外合成FDCA的示范申请者已发现FDCA(即游离酸形式)的合成可通过在H2SO4存在下DDG化学转化为FDCA而实现。反应如下进行。将大约20mgDDG酸(如实施例3中所述先前被纯化的含有盐的粗冻干粉末)和0.25MH2SO4添加到含有1mL水和1mLDMSO的气密的密封管中。发现DDG完全溶于此溶液中。在105℃下搅拌反应18小时小时。对粗反应样品进行的HPLC-MS分析结果指示形成FDCA游离酸(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物以及微量的一些其他未鉴定的副产物。在HPLC-MS分析中作为对照，在相同条件下分析商用的FDCA。实施例14-FDCA酯(二甲基酯、二乙基酯、二丁基酯及异丙基酯)的体外合成的示范由纯化的DDG合成二乙基-2，5FDCA：在气密的密封管中，添加18mLEtOH、0.2克(1毫摩尔)DDG酸(先前如实施例11中所述纯化的)以及0.25MH2SO4。DDG酸并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。粗反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基-FDCA作为主要产物。作为对照，将真正的FDCA在化学上合成，酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。实施例15-由纯化的DDG合成二丁基2，5FDCA在气密的密封管中，添加18mLn-BuOH、0.2克(1毫摩尔)DDG酸(先前如实施例11中所述纯化的)以及0.25MH2SO4。DDG酸并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。如图15所示，反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物。作为对照，将真实FDCA在化学上合成，酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。实施例16-由粗DDG合成二丁基2，5FDCA(未纯化的)：将0.2克(1毫摩尔)粗DDG酸添加到含有18mLn-BuOH的气密密封管中，然后添加0.25MH2SO4，粗DDG酸是直接由实施例11中所述的葡糖二酸的酶促脱水获得的未纯化的冻干粉末。粗DDG酸并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。粗反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物。GC-MS结果显示污染物盐在粗的/未纯化的冻干粉末中的存在不会显著影响反应结果。作为对照，将真实FDCA在化学上合成酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。实施例17-使用固定化酸的FDCA和/或酯的体外产生在工业实践中，固定化酸为脱水的进行提供许多优点，这是由于其通常在几种类型的溶剂(含水、有机或混合等)中操作。另外，其可容易再循环并重新使用。遵循一些实施例，使用固定化的15(RohmandHaas，Philadelphia，PA)和50WX8(DowChemicalCo，Midland，MI)合成FDCA的酯。通过使用50WX8由粗DDG合成二丁基FDCA在一个气密密封管中，将2mL正丁醇、20mg粗DDG酸(含有盐的未纯化的冻干粉末)及200mg50WX8合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。粗反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物。此GC-MS结果显示污染物盐(磷酸盐和NaCl)在粗的/未纯化的冻干粉末中的存在不会显著影响反应结果。作为对照，将真实FDCA在化学上合成酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。通过使用15由粗DDG合成二丁基FDCA在一个气密密封管中，将2mL正丁醇、20mg粗DDG酸(含有盐的粗冻干粉末)及200mg15(RohmandHaas，Philadelphia，PA)合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。粗反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物。此GC-MS结果显示污染物盐(磷酸盐和NaCl)在粗的/未纯化的冻干粉末中的存在不会显著影响反应结果。作为对照，将真实FDCA在化学上合成酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。通过使用15由粗DDG合成乙基FDCA在一个气密密封管中，将2mL乙醇、20mg粗DDG酸(含有盐的未纯化的冻干粉末)及200mg15(RohmandHaas，Philadelphia，PA)合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。粗反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物。此GC-MS结果显示污染物盐(磷酸盐和NaCl)在粗的/未纯化的冻干粉末中的存在不会显著影响反应结果。作为对照，将商用的FDCA在化学上酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。通过使用50WX8由粗DDG合成二乙基FDCA在一个气密密封管中，将2mL乙醇、20mg粗DDG酸(含有盐的未纯化的冻干粉末)及200mg50WX8合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下温和地搅拌反应物18小时。粗反应样品的GC-MS分析结果显示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作为主要产物。此GC-MS结果显示污染物盐(磷酸盐和NaCl)在粗的/未纯化的冻干粉末中的存在不会显著影响反应结果。作为对照，将商用的FDCA在化学上酯化为二乙基-FDCA并在相同的条件下分析。实施例18-FDCA衍生物的产生许多高值FDCA衍生物的合成描述于图16中，其中DTHU脱水产生糠醛-5-甲酸，即FCA，其随后被化学或酶促氧化成FDCA，还原成FCH，或转氨(使用化学还原胺化或氨基转移酶)成氨基酸-AFC。实施例19-二丁基FDCA在气相反应中的产生在此实施例中，GC的入口被用作高温反应器以便将二丁基DDG脱水为二丁基FDCA。将生成的产物进行色谱分离，通过质谱法来检测。将二丁基DDG(10mM)和硫酸(100mM)在丁醇中的溶液置于GC小瓶中。将小瓶注入GC中并且观察FDCA二丁酯。反应在300℃入口中发生(停留时间＝4秒)。6次注入的平均产率为54％。GC设置：直接液体注入/MS检测器入口：300℃，总流量29.51ml/min，分流比10∶1，分流量24.1ml/min，隔膜清洗液流量3mL/minGC衬管：4mm，玻璃棉(P/N5183-4647)柱流量：2.41ml/minHe恒压控制烘箱程序：在40℃下保持2min，然后以25℃/min升温至275℃，然后以40℃/min升至325℃，保持2min柱：HP-5MS，AgilentTechnologies，30mx0.25mmx0.25um总运行时间：14.65分钟MSD传输管线：290℃MS源：250℃MSQuad：150℃保留时间：2，3-FDCA二丁酯：9.3min2，5-FDCA二丁酯：9.7min本说明书中提到的所有公布和专利申请均引入本文以供参考，其程度就如同每个单独的公布或专利申请被具体和单独地指明引入以供参考。并不承认任何参考文献构成现有技术。参考资料的论述说出了其作者的论断，申请人保留质疑引用文件的准确性和适当性的权利。显然可以理解，尽管本文参考了许多现有技术公开文献，但是这种参考并不构成对这些文献中的任意一篇形成本领域中公知常识的组成部分的许可。还应理解，提供以上实施例来说明，而非限制本发明。当前第1页1 2 3