本申请要求美国临时申请系列61/968,763(2014年3月21日申请)的权益，本文以引证的方式结合其全部内容。
本发明的领域
本发明涉及新的化合物，包括它们的盐，它们具有抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性，并且用于治疗HCV感染。本发明还涉及组合物以及制备和使用这些化合物的方法。
本发明的背景
丙型肝炎病毒(HCV)是主要的人类病原体，在世界范围内，估计有一亿七千万人感染，大约为人类免疫缺陷性病毒I型感染数量的五倍。这些HCV感染个体的相当大的部分发展成为严重的渐进性肝疾病，包括肝硬化和肝细胞癌(Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. 2001, 345, 41-52)。
HCV是正链RNA病毒。基于推断的氨基酸序列的对比和在5'-非翻译区的广泛相似性，把HCV归类为黄病毒科中的独立的属。黄病毒科的所有成员具有包膜的病毒体，通过单一、连续、开放读框的转译，其含有编码所有已知病毒特异性蛋白的正链RNA基因组。
在整个HCV基因组的核苷酸以及编码的氨基酸序列内，发现了显著的异质性。已经表征了至少六个主要基因型，并且已经描述了超过50个亚型。HCV的主要基因型在它们的世界范围内分布存在差别，尽管进行了基因型对于病理和治疗的潜在效果的大量研究，但HCV的遗传异质性的临床意义仍然难以捉摸。
单链HCV RNA基因组的长度为大约9500个核苷酸，并且具有编码大约3000个氨基酸的单个大多蛋白的单一开放读框(ORF)。在受感染的细胞中，通过细胞和病毒蛋白酶，使这种多蛋白在多个位点断裂，产生结构和非结构(NS)的蛋白。在HCV的情况下，成熟非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响。认为第一种是金属蛋白酶，并且在NS2-NS3接合点断裂；第二种是包含在NS3的N端域内的丝氨酸蛋白酶(还称为NS3蛋白酶)，并且介导NS3的下游所有随后的断裂，在NS3-NS4A断裂位点的顺式，和在剩余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点的反式两者。NS4A蛋白似乎具有多功能，充当NS3蛋白酶的辅因子，并且可能帮助NS3及其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白与NS4A的复合物形成似乎对于所有位点的活动进程、增加解朊效果都是必需的。NS3蛋白还显示出核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B(还称为HCV聚合酶)是涉及HCV复制的依赖于RNA的RNA聚合酶。HCV NS5B蛋白描述在下列文献中：“Structural Analysis of the Hepatitis C Virus RNA Polymerase in Complex with Ribonucleotides”(Bressanelli; S.等人， Journal of Virology 2002, 3482-3492; 和Defrancesco and Rice, Clinics in Liver Disease 2003, 7, 211-242)。
目前，最有效的HCV治疗使用α-干扰素和利巴韦林的联用药，在40%的患者中产生持续效果(Poynard, T.等人， Lancet 1998, 352, 1426-1432)。新的临床结果表明，作为单一治疗，PEG化的α-干扰素优于未修饰的α-干扰素(Zeuzem, S.等人，N. Engl. J. Med. 2000, 343, 1666-1672)。然而，即使对于涉及PEG化的α-干扰素和利巴韦林的联用药的实验性治疗方案，相当大部分的患者在病毒载量方面没有持续降低。由此，对于发展HCV感染的有效治疗，还有明显和重要的需求。
作为HCV NS5B抑制剂的HCV-796，已经显示出降低患者HCV RNA水平的能力。当用该化合物作为单一药剂来治疗时，在给药期间，病毒RNA水平短暂地降低，而后复原，但当与标准护理(干扰素和利巴韦林的形式)联用时，病毒RNA水平降低得更强烈。由于在延长剂量联用药方案期间观察到肝脏毒性，所以，停止了这种化合物的研发。美国专利7,265,152和相应的PCT专利申请WO2004/041201描述了HCV-796类别的化合物。已经公开了其它化合物；参见，例如，WO2009/101022，以及WO 2012/058125。
因此，本领域需要新的并且有效抗丙型肝炎的其它化合物。另外，这些化合物应该提供药物使用的优点，例如，在它们的一或多种作用机理、结合性、抑制效果、靶向选择性、溶解度、安全性或生物利用率方面的优点。还需要使用这些化合物的新的制剂和治疗方法。
本发明概述
本发明的一个方面是式I的化合物，包括其可药用盐∶
其中
Z是C-R5或N；
R0是氢；
R1是甲基；
R2是独立地被0-2个卤素或甲氧基取代的苯基，或是对位被W-Ar取代的苯基；
W是-O-或-NH-；
Ar是苯基或对卤代苯基；
R3是氢、氟或氯，
R4、R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基和全氘代烷氧基；
R7a、R7b各自独立地选自氢、烷基、环烷基和Ar1，或
R7a和R7b一起形成3-7元碳环；
R8是氢，
Ar1是苯基、5元杂芳环或6元杂芳环；
R9选自氢、卤素、R201、OR202和NR203R204；
R201是烷基、烯基或一个至所有氢被氟替代的C1-C4烷基；
R202是C1-C3烷基或一个至所有氢被氟替代的C1-C3烷基；
R203是氢；
R204是C1-C3烷基、C1-C3羟烷基，或是一个至所有氢被氟替代的C1-C3烷基。
本发明还涉及药物组合物，其包含式I的化合物，包括其可药用盐，以及可药用载体、赋形剂和/或稀释剂。
另外，本发明提供了一或多种治疗丙型肝炎感染的方法，所述方法包括：给予患者治疗有效量的式I的化合物。
作为本发明的一部分，本发明还提供了一或多种制备式I化合物的方法。
本发明涉及这些，以及下文所描述的其它重要方面。
实施方案的详细说明
本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数参考，除非另外明显地规定。
除非在本申请的其它地方另外具体地阐述，否则，本文可以使用下列术语，并且具有下列含义∶“氢”或“H”是指氢，包括它的同位素，例如，氘，本文用字母“D”表示。“卤素”是指氟、氯、溴或碘。“烷基”是指由1至6个碳组成的直链或支链烃基。“烯基”是指由2至6个碳与至少一个双键组成的直链或支链烃基。“环烷基”是指由3至7个碳组成的单环系统。“羟烷基”、“烷氧基”及带有取代的烷基部分的其它术语包括由1至6个碳原子组成的烷基部分的直链和支链异构体。在用卤素所定义的取代基中，“卤素”包括所有的卤代的异构体，从单卤素取代至全卤素取代，例如，“卤代烷基”和“卤代烷氧基”、“卤代苯基”、“卤代苯氧基”。“芳基”是指具有6至12个碳原子的单环或双环芳香烃基团，或其中一个或两个环是苯基的双环稠环系统。双环稠环系统由与4至6元芳族或非芳族碳环稠合的苯基组成。芳基的代表性的例子包括但不局限于：茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。“杂芳基”是指具有1-5个杂原子的5至7元单环或8至11元双环芳香环系统，杂原子独立地选自氮、氧和硫。括弧和多括弧术语是为了使本领域技术人员弄清楚键的连接关系。例如，术语例如((R)烷基)是指进一步被取代基R取代的烷基取代基。通过化学绘画举例说明的、在多环系统(例如，双环系统)的可变位置上键接的取代基意味着与它们被画出的附加的环键接。
本发明包括所述化合物的所有可药用盐形式。可药用盐是反离子不会显著地影响化合物的生理活性或毒性并因此起到药理学等效物作用的那些盐。可以按照常规有机技术，使用商业购买的试剂来制备这些盐。一些阴离子型盐包括：乙酸盐、醋硬脂酸盐、苯磺酸盐、溴化物、右旋樟脑磺酸盐、氯化物、柠檬酸盐、富马酸盐、葡糖醛酸盐(glucouronate)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、碘化物、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和昔萘酸盐(xinofoate)。一些阳离子盐形式包括铵、铝、苯乍生、铋、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、锂、镁、葡甲胺、4-苯基环己胺、哌嗪、钾、钠、氨基丁三醇和锌盐。
一些本发明的化合物具有不对称碳原子。本发明包括所有的立体异构形式，包括对映异构体和非对应异构体以及立体异构体的混合物，例如，外消旋体。可以使用本领域已知的方法，制备一些立体异构体。可以按照本领域熟知的方法，将该化合物和相关中间体的立体异构混合物分离为单一异构体。在下面反应路线和表中的分子结构描述中，使用楔形或点划线（hashes）只是表示相对立体化学，不应该解释为绝对立体化学归属。
本发明包括出现在本发明化合物中的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。作为普通实例并且不限于这些实例，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。通常可以利用本领域技术人员已知的传统技术，或类似于本文所描述的工艺，使用恰当的同位素标记的试剂来代替所另外使用的非标记的试剂，制备同位素标记的本发明化合物。这种化合物可以具有各种潜在用途，例如，在测定生物活性过程中作为标准和试剂。在稳定同位素的情况下，这种化合物可以具有有利地改变生物学、药理学或药物动力学性能的潜力。
如上所述，本发明涉及一或多种式I的化合物，包括其可药用盐∶
其中
Z是C-R5或N；
R0是氢；
R1是甲基；
R2是独立地被0-2个卤素或甲氧基取代的苯基，或是对位被W-Ar取代的苯基；
W是-O-或-NH-；
Ar是苯基或对卤代苯基；
R3是氢、氟或氯，
R4、R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基和全氘烷氧基；
R7a、R7b各自独立地选自氢、烷基、环烷基和Ar1，或
R7a和R7b一起形成3-7元碳环；
R8是氢；
Ar1是苯基、5元杂芳环或6元杂芳环；
R9选自氢、卤素、R201、OR202和NR203R204；
R201是烷基、烯基或一个至所有氢被氟替代的C1-C4烷基；
R202是C1-C3烷基或一个至所有氢被氟替代的C1-C3烷基；
R203是氢；
R204是C1-C3烷基、C1-C3羟烷基，或是一个至所有氢被氟替代的C1-C3烷基。
优选，在上面式I的化合物中，R2是对氟苯基。
还优选，R3是氢。
另外，优选，R4、R5和R6各自独立地选自氢、氟、-OCH3和-OCD3。
进一步优选，R7a选自氢、甲基、氟甲基和环丙基。
还优选，R7b选自氢、甲基、氟甲基、环丙基和Ar1。
在某些实施方案中，还优选，R7a和R7b一起形成环丙基或环丁基环。
进一步优选，Ar1是苯基或嘧啶基。
还优选，R9是R201或NR203R204。
另外，优选，R201是-CH2CH2CF3或乙烯基。
还优选，R204是-CH2CF3、-CH2CF2CF3或-CH2CH2OH。
在本发明的进一步实施方案中，优选，R2是对氟苯基，R3是氢，R4、R5和R6各自独立地选自氢、氟、-OCH3和-OCD3，
R7a选自氢、甲基、氟甲基和环丙基，
R7b选自氢、甲基、氟甲基、环丙基和Ar1，
或R7a和R7b一起形成环丙基或环丁基环；
Ar1是苯基或嘧啶基，
R9是R201或NR203R204；
R201是-CH2CH2CF3或乙烯基；和
R204是-CH2CF3、-CH2CF2CF3或-CH2CH2OH。
在本发明的进一步实施方案中，优选 ，R4是氢，
R5是氢或氟，R7b选自氢、甲基、氟甲基和环丙基，或R7a和R7b一起形成环丙基或环丁基环；
R201是-CH2CH2CF3。
在上面式I化合物的某些实施方案中，优选 ，Z是N。
还优选的是其中Z是N、R4是氢、R6是-OCD3的化合物。
在上面式I化合物的某些实施方案中，优选，Z是CR5。
其它优选的化合物包括其中Z是CR5、R4是氢、R5是氢或氟、R6是氢、氟或-OCH3的化合物，
R7a选自氢、甲基、氟甲基或环丙基，
R7b选自氢、甲基、氟甲基或环丙基，
或R7a和R7b一起形成环丙基或环丁基环；和
R201是-CH2CH2CF3。
还优选的是其中R5是氢、R6是氟、R7a是甲基、R7b是环丙基、R9是R201的式I的化合物。
其它优选的化合物包括其中化合物以单一对映异构体形态存在的化合物，其是∶(R)-5-(3-((1-氰基-1-环丙基乙基)氨基甲酰基)-4-氟苯基)-2-(4-氟苯基)-N-甲基-6-(3,3,3-三氟丙基)呋喃并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺，或另一个单一对映异构体，其是∶(S)-5-(3-((1-氰基-1-环丙基乙基)氨基甲酰基)-4-氟苯基)-2-(4-氟苯基)-N-甲基-6-(3,3,3-三氟丙基)呋喃并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺。
甚至更加优选的是选自上面两个纯对映异构体的化合物，其中，化合物以单一对映异构体形态存在，当利用旋光计通过标准方法测定旋光度时，显示出负旋转。
优选的本发明的化合物，包括其可药用盐，选自下列化合物∶
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还优选的是选自下列的化合物，包括其可药用盐∶
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进一步优选的是选自下列的化合物，包括其可药用盐∶
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更优选的是选自下列的化合物，包括其可药用盐∶
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其它更优选的是选自下列的化合物，包括其可药用盐∶
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进一步优选的是下列化合物，包括其可药用盐，鉴定为∶
。
另外，下列化合物，包括其可药用盐，鉴定为∶
。
药物组合物和治疗方法
按照本文列出的各个实施方案的化合物表现出了抗HCV NS5B的活性，并且可有效用于治疗HCV和HCV感染。因此，本发明的另一个方面是组合物，其含有式I的化合物，包括其可药用盐，以及药用载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明的另一个方面是进一步含有具有抗HCV活性的其它化合物的组合物。
本发明的另一个方面是组合物，在这种组合物中，具有抗HCV活性的其它化合物是干扰素或利巴韦林。本发明的另一个方面是其中干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A、干扰素λ和类淋巴母细胞干扰素tau。
本发明的另一个方面是组合物，其中，具有抗HCV活性的其它化合物是环孢菌素。本发明的另一个方面是，其中，环孢菌素是环孢菌素A。
本发明的另一个方面是组合物，其中，具有抗HCV活性的其它化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增加1型辅助性T细胞应答的形成的化合物、干扰性RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、肌苷5'-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
本发明的另一个方面是组合物，其中，具有抗HCV活性的其它化合物可有效抑制靶向的功能，靶向选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV入口、HCV组装、HCV出口、HCV NS5A蛋白、IMPDH和治疗HCV感染的核苷类似物。
本发明的另一个方面是组合物，其包含式I的化合物，或其可药用盐，以及药用载体、干扰素和利巴韦林。
本发明的另一个方面是抑制HCV复制子的功能的方法，所述方法包括：使HCV复制子与式I的化合物或其可药用盐接触。
本发明的另一个方面是抑制HCV NS5B蛋白的功能的方法，所述方法包括：使HCV NS5B蛋白与式I的化合物或其可药用盐接触。
本发明的另一个方面是治疗患者的HCV感染的方法，所述方法包括：给予患者治疗有效量的式I的化合物或其可药用盐。在另一个实施方案中，所述化合物有效抑制HCV复制子的功能。在另一个实施方案中，所述化合物有效抑制HCV NS5B蛋白的功能。
本发明的另一个方面是治疗患者的HCV感染的方法，所述方法包括：与具有抗HCV活性的另一个化合物(在给予式I的化合物或其可药用盐之前、之后或同时给予)结合给予患者治疗有效量的式I的化合物或其可药用盐。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，具有抗HCV活性的其它化合物是干扰素或利巴韦林。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A、干扰素λ和类淋巴母细胞干扰素tau。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，具有抗HCV活性的其它化合物是环孢菌素。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，环孢菌素是环孢菌素A。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，具有抗HCV活性的其它化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增加1型辅助性T细胞应答的形成的化合物、干扰性RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、肌苷5'-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，具有抗HCV活性的其它化合物可有效抑制靶向的功能，靶向选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV入口、HCV组装、HCV出口、HCV NS5A蛋白、IMPDH和治疗HCV感染的核苷类似物。
本发明的另一个方面是所述方法，其中，具有抗HCV活性的其它化合物在HCV生命周期中可有效抑制非HCV NS5B蛋白的靶向的功能。
“治疗有效量”是指为患者提供有意义的益处所需要的药剂数量，例如，当应用于这种感染的个体时，正如肝炎和HCV感染领域的医师所理解的那样，能够抑制、改善或治愈HCV感染所引起的急性病症，和/或，抑制、改善或治愈HCV感染本身。
“患者”是指感染上HCV病毒并且适合于肝炎和HCV感染领域的医师所理解的治疗的人。
“医治”、“治疗”、“方案”、“HCV感染”和相关的术语按照肝炎和HCV感染领域的医师所理解的那样来使用。
通常以药物组合物形式给予本发明的化合物，所述药物组合物由治疗有效量的化合物或它的药用盐以及药用载体组成，并且可以含有常规的赋形剂。药用载体通常是具有可接受的安全性的已知的载体。组合物包括所有常规固体和液体形式，包括，例如，胶囊剂、片剂、糖锭和粉剂，以及液体混悬剂、糖浆剂、酏剂和溶液剂。使用常规制剂技术来制备组合物，并且组合物通常使用常规赋形剂(例如，粘合与润湿剂)和载体(例如，水和醇)。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17th edition, 1985。
通常将固体组合物配制为剂量单位形式，优选，每个剂量提供大约1至1000 mg活性成分的组合物。剂量的一些例子是1 mg、10 mg、100 mg、250 mg、500 mg和1000 mg。通常，其它药剂所存在的单位范围与临床上使用的该类药剂相似。通常是0.25-1000 mg/单位。
液体组合物通常是剂量单位范围。通常，液体组合物的单位剂量范围为1-100 mg/ml。剂量的一些例子是1 mg/ml、10 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml和100 mg/ml。通常，其它药剂所存在的单位范围与临床上使用的该类药剂相似。通常是1-100 mg/mL。
本发明包括所有常规的给药模式；优选口服和肠胃外方法。通常，给药方案与临床上使用的其它药剂相似。通常，日剂量为每天1-100 mg/kg体重。通常，口服方式需要更多的化合物，而胃肠外方式需要的较少。然而，具体给药方案由医生利用可靠的医学判断来确定。
本发明还包括以联合治疗形式给予化合物的方法。即，该化合物可以与治疗肝炎和HCV感染所使用的其它药剂结合使用，但独立于其它药剂。在这些联用方法中，与其它药剂结合，该化合物通常每天给予日剂量1-100 mg/kg体重。通常给予治疗所使用数量的其它药剂。然而，具体给药方案由医生利用可靠的医学判断来确定。
适合于组合物和方法的一些化合物的例子列于表1中。
合成方法
利用本领域合适方法，以及下述那些方法，可以制备该化合物。本领域可得到一些试剂和中间体。其它试剂和中间体可以利用本领域合适方法、使用商业购买的原料来制备。用于描述该化合物合成的变量(例如，编号“R”取代基)仅仅说明如何构成和不与权利要求或说明书的其它部分所使用的变量相混淆。反应路线中使用的缩写通常遵循本领域使用的惯例。
反应路线中使用的缩写通常遵循本领域使用的惯例。说明书和实施例中使用的化学缩写定义如下:“NaHMDS”代表二(三甲基甲硅烷基)胺化钠；“DMF”代表N,N-二甲基甲酰胺；“MeOH”代表甲醇；“NBS”代表N-溴代琥珀酰亚胺；“Ar”代表芳基；“TFA”代表三氟乙酸；“LAH”代表氢化铝锂；“DMSO”代表二甲亚砜；“h”代表小时；“rt”代表室温或保留时间(上下文会表明)；“min”代表分钟；“EtOAc”代表乙酸乙酯；“THF”代表四氢呋喃；“EDTA”代表乙二胺四乙酸；“Et2O”代表二乙醚；“DMAP”代表4-二甲基氨基吡啶；“DCE”代表1,2-二氯乙烷；“ACN”代表乙腈；“DME”代表1,2-二甲氧基乙烷；“HOBt”代表1-羟基苯并三唑水合物；“DIEA”代表二异丙基乙胺。
对于0000系列中的化合物部分，所有的液相色谱(LC)数据记录在Shimadzu LC-10AS或LC-20AS液相色谱上，使用SPD-10AV或SPD-20A UV-Vis检测器，用Micromass Platform for LC(电喷射模式)测定质谱(MS)数据。
HPLC方法(即，化合物分离)。将制备HPLC纯化的化合物稀释在甲醇(1.2 mL)中，并使用Shimadzu LC-8A或LC-10A或Dionex APS-3000或Waters AcquityTM自动制备HPLC系统纯化。
实施例:
制备化合物10001:
步骤1 :向化合物1(5 g)、5-二羟硼基-2-甲氧苯甲酸(3.07 g)和Cs2CO3(8.49 g)的二噁烷(120 mL)和水(20 mL)的混合物中加入Pd(PPh3)4(1.51 g)。将该混合物用氮气吹扫，然后在85℃下加热16小时。将该混合物用水稀释，并用1N HCl酸化至～pH3，然后用EtOAc(2 x 150 mL)提取。将有机层合并，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用EtOAc滴定，使残余物纯化，得到化合物2。
步骤2 :向化合物2(300 mg)、2-氨基-2-甲基丙腈(66.6 mg)和HATU(376 mg)的DMF(5 mL)溶液中加入iPr2NEt(0.46 mL)。将该混合物在室温下搅拌4小时。将该混合物用EtOAc(200 mL)稀释，用水(50 mL)、盐水(50 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用EtOAc滴定，使残余物纯化，得到化合物10001。
制备化合物10002:
利用与化合物10001相同的方法，使用1-氨基环丁烷甲腈作为起始原料，制备化合物10002。
制备化合物10003：
利用与化合物10001相同的方法，使用1-氨基环戊烷甲腈盐酸盐作为起始原料，制备化合物10003。
制备化合物10004：
利用从化合物1开始制备化合物10001相同的方法，在步骤1中使用3-二羟硼基-苯甲酸作为起始原料，制备化合物10004。
制备化合物10005：
利用从化合物1开始制备化合物10002相同的方法，在步骤1中使用3-二羟硼基-苯甲酸作为起始原料，制备化合物10005。
制备化合物10006：
利用从化合物1开始制备化合物10003相同的方法，在步骤1中使用3-二羟硼基-苯甲酸作为起始原料，制备化合物10006。
制备化合物11001：
将化合物10004(30 mg)、CF3CH2CH2BF3K(43.6 mg)、碳酸铯(59.7 mg)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(11.41 mg)和二乙酰氧基钯(2.74 mg)在甲苯(3 mL)和水(0.3 mL)中的混合物、在80℃下加热16小时。用EtOAc(20 mL)稀释该混合物，用水(20 mL)、盐水(20 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用制备HPLC系统纯化残余物。
制备化合物11002：
利用与化合物11001相同的方法，使用化合物10005作为起始原料，制备化合物11002。
制备化合物11003 :
利用与化合物11001相同的方法，使用化合物10006作为起始原料，制备化合物11003。
制备中间体5：
步骤1 :向化合物1(100 mg)，(3-(甲氧羰基)苯基)硼酸(46.9 mg)和Cs2CO3(170 mg)的二噁烷(4 mL)和水(1 mL)的混合物中加入Pd(PPh3)4(30.1 mg)。将该混合物用氮气吹扫，然后在85℃下加热4小时。将该混合物用水稀释，并用EtOAc(2 x 10 mL)提取。将有机层合并，用盐水(2 x 10 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用EtOAc滴定，使残余物纯化，得到化合物3。
步骤2 :将化合物3(1g)、CF3CH2CH2BF3K(1.63 g)、Cs2CO3(2.23 g)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(0.43 g)和二乙酰氧基钯(0.10 g)在甲苯(50 mL)和水(5.0 mL)中的混合物、在90℃下加热16小时。用EtOAc(250 mL)稀释该混合物，用水(100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用硅胶柱纯化残余物(己烷:EtOAc=1:1至1:2)，得到化合物4。
步骤3 :将化合物4(400 mg)和NaOH(4.0 mL，1N)在THF(30 mL)和水(15 mL)中的混合物、在80℃下加热6小时。将该混合物用1N HCl酸化至～pH5，并用EtOAc(2 x 50mL)提取。将有机层合并，用盐水(2 x 50 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩，得到化合物5，可直接使用。
制备化合物11004、11005、11008、11011、11012和11013：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物5(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备化合物11006和11007：
化合物11006和11007是从样品11005中分离出来的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备化合物11009和11010：
化合物11009和11010是从样品11008中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备化合物12001：
利用与化合物11001相同的方法，使用化合物10001作为起始原料，制备化合物12001。
制备化合物12002：
利用与化合物11001相同的方法，使用化合物10002作为起始原料，制备化合物12002。
制备化合物12003：
利用与化合物11001相同的方法，使用化合物10003作为起始原料，制备化合物12003。
制备中间体6：
利用与化合物11001相同的方法，使用中间体2作为起始原料，制备中间体6。
制备化合物12004和12005：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物6(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备中间体9：
步骤1：向化合物1(1 g)、(4-氟-3-(甲氧羰基)苯基)硼酸(0.62 g)和Cs2CO3(1.70 g)的二噁烷(40 mL)和水(4 mL)的混合物中加入Pd(PPh3)4(0.30 g)。将该混合物用氮气吹扫，然后在85℃下加热16小时。将该混合物用水稀释，然后用EtOAc(2 x 100 mL)提取。将有机层合并，用盐水(100 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用EtOAc滴定，使残余物纯化，得到化合物7。
步骤2：将化合物7(270 mg)、三氟(3,3,3-三氟丙基)硼酸钾(422 mg)、碳酸铯(578 mg)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(110 mg)和二乙酰氧基钯(26.5 mg)在甲苯(10 mL)和水(1.0 mL)中的混合物、在80℃下加热16小时。用EtOAc(20 mL)稀释该混合物，用水(20 mL)、盐水(20 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩，得到化合物8，可直接使用。
步骤3：向化合物8(50 mg)的丙酮(3 mL)和水(1 mL)悬浮液中加入NaOH(1.93 mL，1N)。将该混合物在80℃下加热4小时。将该混合物用1N HCl酸化至～pH3。过滤收集沉淀，得到化合物9，可直接使用。
制备化合物11004、11005、11008、11011、11012和11013：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物9(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备化合物13004和13005：
化合物13004和13005是从样品13003中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备化合物13007和13008：
化合物13007和13008是从样品13006中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
化合物13007和13008的手性分离和纯度分析：
Chiralcel OD-H制备柱, 30 x 250mm, 5mm
移动相∶10% MeOH(0.1%DEA)，在CO2中，150bar
温度∶35℃
流速∶70.0 mL/min，22 min
UV监测@ 316nm
注射：0.5ml的～40mg/mL溶液，在1:1 MeOH:CHCl3中
保留时间：15.25分钟(化合物13007)和17.68分钟(化合物13008)。
两个分析LC/MS注射液用于测定最终纯度。注射1条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0% B，0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。注射2条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0% B，0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测：UV，220 nm。
将化合物13308从EtOH和水的混合溶液中进一步重结晶出来，得到白色固体。
化合物13308的特征：
a.旋光度
结果：=-33.48°(3.435mg/ml, CHCl3)
b.质谱：
质量范围：m/z 120-1200
电离和模式：电喷射离子化，阳离子模式
结果：ES+=597.3
c.元素分析：%组成差异(Δ)=实验值-理论值(接受标准：Δ ≤ ±0.4)
结果：C31H25F5N4O3·0.06 H2O: ΔC=-0.09%; ΔH=-0.19%; ΔN=+0.06%
d.质子谱：
实验：将7.3 mg样品溶于600ml DMSO-d6中，4次扫描，32K点，在室温下。1H化学位移以0.0 ppm下的TMS作为参考。
1H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 9.06(s, 1H), 8.54(q, J=4.4 Hz, 1H), 8.07(dd, J=9.0, 5.5 Hz, 2H), 7.97(s, 1H), 7.69(m, 1H), 7.66(m, 1H), 7.48(t, J=8.5Hz, 1H), 7.43 (dd, J=8.8, 7.3 Hz, 2H), 3.03(dd, J=9.1, 6.6 Hz, 2H), 2.83(d, J=4.7 Hz, 3H), 2.79(m, 2H), 1.67(s, 3H), 1.50(m, 1H), 0.64(m, 3H), 0.53(m, 1H)
e.碳谱∶
实验：将7.3 mg样品溶于600ml DMSO-d6中。碳共振频率是125.73 MHz。1024次扫描，32K点，在室温下。13C化学位移以0.0 ppm下的TMS作为参考。
13C NMR(125.73MHz, DMSO-d6) δ 163.4, 162.4, 163.0(d, J=248.9 Hz), 158.8, 158.7(d, J=250.7 Hz), 152.0, 151.4, 135.0(d, J=3.6 Hz), 133.6(d, J=8.2 Hz), 131.9, 131.8, 130.8, 129.9(d, J=9.1 Hz), 127.5(q, J=277.0 Hz), 125.2(d, J=2.7 Hz), 123.9(d, J=15.4 Hz), 118.8, 117.5, 116.4(d, J=22.7 Hz), 116.1(d, J=22.7 Hz), 112.6, 52.2, 31.3(q, J=27.3 Hz), 27.1, 26.2, 23.8, 18.6, 2.9, 1.7.
f.氟谱
实验：将7.3 mg样品溶于600ml DMSO-d6中，氟共振频率是470.45 MHz，16次扫描，64K点，在室温下。19F化学位移在0.0 ppm处以CFCl3作为参考。
19F NMR(470.45 MHz, DMSO-d6)δ-64.74,-109.85,-115.68。
制备中间体10：
利用与中间体9相同的方法，在步骤1中，使用3-氟-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸甲酯作为起始原料，制备中间体10。
制备化合物14001和14002：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物10(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备中间体14：
步骤1：向化合物1(500 mg)，3-二羟硼基-4-氟苯甲酸(264 mg)和Cs2CO3(849 mg)的DMF(15 mL)和水(1.5 mL)的混合物中加入Pd(PPh3)4(151 mg)。将该混合物用氮气吹扫，然后在85℃下加热6小时。将该混合物用水稀释，然后用EtOAc(2 x 50 mL)提取。将有机层合并，用盐水(50 mL)洗涤，并真空浓缩。用EtOAc滴定，使残余物纯化，得到化合物11。
步骤2：在密封管中，将化合物2(70 mg)、碘甲烷(0.049 mL)和Cs2CO3(103 mg)在MeOH(3 mL)中的混合物、在80℃下加热6小时。将该混合物用MeOH稀释。过滤取出固体。浓缩滤液，得到残余物，将残余物用制备HPLC系统纯化。
步骤3：将化合物12(25 mg)、三氟(3,3,3-三氟丙基)硼酸钾(39.1 mg)、碳酸铯(53.5 mg)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(10.21 mg)和二乙酰氧基钯(2.46 mg)在甲苯(2 mL)/水(0.2 mL)中的混合物脱气，并在80℃下加热16小时。用EtOAc(10 mL)稀释该混合物，然后用水(10 mL)和盐水(10 mL)洗涤。分离有机层，并真空浓缩。用EtOAc滴定，使残余物纯化，得到化合物13。
步骤4：向化合物13(15 mg)的THF(3 mL)和水(0.3 mL)悬浮液中加入NaOH(0.5 mL，1N)。将该混合物在80℃下加热4小时。将该混合物用1N HCl酸化至～pH3。真空除去所有的溶剂，得到化合物14，可直接使用。
制备化合物15001和15002：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物14(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备中间体15：
利用与中间体9相同的方法，在步骤1中，使用2,3-二氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸甲酯作为起始原料，制备中间体15。
制备化合物16001：
向化合物15(8 mg)、2-氨基-2-甲基丙腈(2.424 mg，0.029 mmol)和HATU(8.22 mg，0.022 mmol)的DMF(1 mL)溶液中加入iPr2NEt(10.06 µl)。将该混合物在室温下搅拌4小时。用制备HPLC系统分离出产物。
制备中间体16：
利用与中间体9相同的方法，在步骤1中，使用(3,4-二氟-5-(甲氧羰基)苯基)硼酸作为起始原料，制备中间体16。
制备化合物17001：
制备化合物18001：
向化合物17(15 mg)、2-氨基-2-环丙基丙腈(9.52 mg)和HATU(16.44 mg)的DMF(1 mL)溶液中加入iPr2NEt(0.02 mL)。将该混合物在室温下搅拌4小时。用制备HPLC系统分离出产物。
制备中间体19：
步骤1：将化合物3(800 mg)和NaOH(9.12 mL，1N)在THF(30 mL)和水(15 mL)中的混合物、在80℃下加热6小时。将该混合物用1N HCl酸化至～pH5，并用EtOAc(2 x 50mL)提取。将有机层合并，用盐水(50 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩，得到化合物18。
步骤2：将化合物18(175 mg)、氯[2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三-异丙基-1,1'-联苯][2-(2-氨乙基)苯基]钯(II)(28.2 mg)和2-甲基丁-2-醇化钠(194 mg)在二噁烷(10 mL)中的混合物、在90℃下加热30分钟。用EtOAc(20 mL)稀释该混合物，用水(20 mL)、盐水(20 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用制备HPLC系统纯化残余物。
制备化合物20001、20002、20005和20006：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物19(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备化合物20003和20004：
化合物20003和20004是从样品20002中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备化合物20007和20008：
化合物20007和20008是从样品20006中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备中间体20：
利用与化合物18制备中间体19相同的方法，使用化合物2作为起始原料，制备化合物20。
制备化合物21001：
向化合物20(20 mg)、2-氨基-2-甲基丙腈盐酸盐(9.32 mg，0.077 mmol)和HATU(22.05 mg)的DMF(2 mL)溶液中加入iPr2NEt(0.027 mL)。将该混合物在室温下搅拌4小时。用制备HPLC系统分离出产物。
制备中间体21：
利用与中间体19相同的方法，在步骤1中，使用化合物7作为起始原料，制备化合物21。
制备化合物22001和22004：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物21(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备化合物22002和22003：
化合物22002和22003是从样品22001中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备化合物22005和22006：
化合物22005和22006是从样品22004中分离出的两个对映体。没有测定绝对立体化学。
制备中间体23：
步骤1：利用与中间体7相同的方法，使用3-氟-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸甲酯作为起始原料，制备中间体22。
步骤2：将化合物22(50 mg)、2,2,2-三氟乙胺(54.2 mg)、氯[2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三-异丙基-1,1'-联苯][2-(2-氨乙基)苯基]钯(II)(17.49 mg)和2-甲基丁-2-醇化钠(48.2 mg)在二噁烷(3 mL)中的混合物、在65℃下加热20分钟。用EtOAc(20 mL)稀释该混合物，并用1N HCl(20 mL)和盐水(20 mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，并真空浓缩。用制备HPLC系统纯化残余物，得到化合物23。
制备化合物23001和23002：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物23(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备中间体26：
步骤1：利用与中间体7相同的方法，使用2,3-二氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸甲酯作为起始原料，制备中间体24。
步骤2：向化合物24(40 mg)的THF(3 mL)和水(1 mL)的悬浮液中加入NaOH(1 mL，1N)。将该混合物在80℃下加热4小时。将该混合物用1N HCl酸化至～pH3。过滤收集固体，得到化合物25。
步骤3：将化合物25(37 mg)、2,2,2-三氟乙胺(37.1 mg)、氯[2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三-异丙基-1,1'-联苯][2-(2-氨乙基)苯基]钯(II)(11.97 mg)和2-甲基丁-2-醇化钠(33.0 mg)在二噁烷(5 mL)中的混合物、在80℃下加热20分钟。用EtOAc(20 mL)稀释该混合物，并用1N HCl(20 mL)和盐水(20 mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，并真空浓缩。用制备HPLC系统纯化残余物，得到化合物26。
制备化合物24001：
向化合物26(15 mg)、2-氨基-2-甲基丙腈(4.08 mg)和HATU(13.82 mg)的DMF(2 mL)溶液中加入iPr2NEt(0.017 mL)。将该混合物在室温下搅拌4小时。用制备HPLC系统分离出产物。
制备中间体27：
将化合物2(460 mg)、2,2,3,3,3-五氟丙-1-胺(781 mg)、氯[2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三-异丙基-1,1'-联苯][2-(2-氨乙基)苯基]钯(II)(84 mg)和2-甲基丁-2-醇化钠(577 mg)在二噁烷(25 mL)中的混合物、在85℃下加热30分钟。将该混合物用EtOAc(100 mL)稀释，用水(100 mL)和盐水(100 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩，得到化合物27。
制备化合物30001-30003：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物27(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备中间体28：
利用与化合物2制备中间体20相同的方法，使用2,2,3,3,3-五氟丙-1-胺作为起始原料，制备中间体28。
制备化合物31001和31002：
将iPr2NEt或Et3N(2 eq)和HATU或HCTU或DEBPT(1.3 eq)加入到化合物28(1 eq)和胺(1.3 eq)的DMF或THF溶液中。将该反应在室温下或85℃下搅拌30分钟至72小时。用制备HPLC系统分离目标产物。
制备中间体29：
利用与化合物18制备中间体19相同的方法，使用2-氨基乙醇作为起始原料，制备中间体29。
制备化合物40001：
向化合物29(10 mg)、2-氨基-2-甲基丙腈(3.74 mg)和HATU(12.69 mg)的DMF(1.5 mL)溶液中加入iPr2NEt(0.016 mL)。将该混合物在室温下搅拌4小时。用制备HPLC系统分离出产物。
制备化合物50001：
将化合物10004(80 mg)、乙烯基三氟硼酸钾(76 mg)、碳酸铯(159 mg)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(30.4 mg)和二乙酰氧基钯(7.32 mg)在甲苯(8 mL)和水(0.8 mL)中的混合物、在80℃下加热16小时。将该混合物用EtOAc(20 mL)稀释，用水(20 mL)和盐水(20 mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空浓缩。用制备HPLC纯化残余物。
制备化合物K1001-K1003的一般方法
将iPr2NEt(3 eq)和HATU(1.5 eq)加入到2-氟-5-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-(3,3,3-三氟丙基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)苯甲酸(1 eq)和胺(2 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K1001
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。LCMS：注射1条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶2.90 min,(M+H)+：569。注射2条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶3.91 min,(M+H)+: 569。
化合物K1002
胺亲核体=1-氨基环丁烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶2.11 min，(M+H)+：583。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶4.01 min，(M-H)+：581。1H NMR(500MHz, DMSO-d6)δ 9.43(s, 1H), 8.54-8.48(m, 1H), 8.06(dd, J=8.9, 5.5 Hz, 2H), 7.97(s, 1H), 7.74-7.65(m, 2H), 7.49(t, J=9.3 Hz, 1H), 7.41(t, J=8.9 Hz, 2H), 3.05-2.97(m, 2H), 2.85-2.64(m, 7H), 2.47(d, J=11.3 Hz, 2H), 2.11-2.00(m, 2H)。
化合物K1003
胺亲核体=2-氨基-2-甲基丙腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.75分钟；流速：1.11 mL/min。保留时间∶4.06 min，(M+H)+：571。注射2条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有0.05% TFA；流动相B：95:5，乙腈:水，含有0.1% TFA；温度：50℃；梯度：0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.75分钟；流速：1.11 mL/min。保留时间∶3.08 min，(M+H)+: 571。1H NMR(500MHz, DMSO-d6)δ 8.98(s, 1H), 8.54-8.45(m, 1H), 8.06(dd, J=8.4, 5.6 Hz, 2H), 7.96(s, 1H), 7.69-7.63(m, 2H), 7.47(s, 1H), 7.41(t, J=8.7 Hz, 2H), 3.06-2.98(m, 2H), 2.85-2.72(m, 5H), 1.73-1.65(m, 6H)。
制备化合物K2001-K2005的一般方法：
将iPr2NEt(8 eq)和HATU(1.5 eq)加入到2-氟-5-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-((2,2,2-三氟乙基)氨基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)苯甲酸(1 eq)和胺(1 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K2001
胺亲核体=2-氨基-2-甲基丙腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测∶UV，220 nm。保留时间∶2.92 min，(M+H)+：572。注射2条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测∶UV，220 nm。保留时间∶3.86 min，(M+H)+：572。
化合物K2002
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测∶UV，220 nm。保留时间∶2.86 min，(M+H)+：570。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶3.81 min，(M+H)+：570。
化合物K2003
胺亲核体=1-氨基环丁烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶2.96 min，(M+H)+：584。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶3.90 min，(M+H)+：584。
化合物K2004
胺亲核体=1-氨基环戊烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.05 min，(M+H)+：598。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟； 流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.98 min，(M+H)+：598。
化合物K2005
胺亲核体=2-氨基-2,3-二甲基丁腈。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.10 min，(M+H)+：600。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟； 流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶ 4.02 min，(M+H)+：600。
制备化合物K3001的一般方法：
将iPr2NEt(3 eq)和HATU(1.5 eq)加入到3-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-(3,3,3-三氟丙基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)苯甲酸(1 eq)和胺(2 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K3001
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶ 2.87 min，(M+H)+：551。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶ 3.93 min，(M+H)+：551。1H NMR(500MHz, DMSO-d6)δ 9.43(s, 1H), 8.54-8.44(m, 1H), 8.10-8.00(m, 2H), 7.97(s, 2H), 7.90(s, 1H), 7.74-7.60(m, 2H), 7.42(s, 2H), 3.05-2.96(m, 2H), 2.84-2.69(m, 5H), 1.63-1.52(m, 2H), 1.34-1.26(m, 2H)。
制备化合物K4001-K4003的一般方法：
将iPr2NEt(8 eq)和HATU(1.5 eq)加入到3-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-((2,2,2-三氟乙基)氨基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)苯甲酸(1 eq)和胺(1 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K4001
胺亲核体=1-氨基环戊烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶ 2.94 min,(M+H)+: 580. .注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.98 min，(M+H)+：580。
化合物K4002
使用的胺是1-氨基环丁烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶ 2.86 min，(M+H)+：566。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟； 流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶3.91 min，(M+H)+：566。
化合物K4003
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶2.99 min，(M+H)+：552。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟； 流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶3.78 min，(M+H)+：552。
化合物K4004
胺亲核体=2-氨基-2,3-二甲基丁腈。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.18 min,(M+H)+: 582. .注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟； 流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶3.97 min，(M+H)+：582。
制备化合物K5001-K5004的一般方法：
将iPr2NEt(8 eq)和HATU(1.5 eq)加入到5-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-((2,2,2-三氟乙基)氨基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)-2-甲氧苯甲酸(1 eq)和胺(1 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K5001
胺亲核体=1-氨基环丁烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.15 min，(M+H)+：596。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶ 3.88 min，(M+H)+：596。
化合物K5002
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶2.91 min，(M+H)+：582。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟； 流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶3.81 min，(M+H)+：582。
化合物K5003
胺亲核体=1-氨基环戊烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶3.01 min，(M+H)+：610。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min； 检测：UV，220 nm。保留时间∶3.98 min，(M+H)+：610。
化合物K5004
胺亲核体=2-氨基-2,3-二甲基丁腈。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶3.20 min，(M+H)+：612。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶4.03 min，(M+H)+：612。
制备化合物K6001的一般方法：
将iPr2NEt(8 eq)和HATU(1.5 eq)加入到5-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-(3,3,3-三氟丙基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)-2-甲氧苯甲酸(1 eq)和胺(1 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K6001
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶ 2.95 min，(M+H)+：581。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶ 3.93 min，(M+H)+：581。
制备化合物K7001-K7005的一般方法：
将iPr2NEt(8 eq)和HATU(1.5 eq)加入到5-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-(3,3,3-三氟丙基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)-2-甲氧基烟酸(1 eq)和胺(1 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K7001
胺亲核体=2-氨基-2-甲基丙腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶3.17 min，(M+H)+：584。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶ 4.09 min，(M+H)+：584。
化合物K7002
胺亲核体=1-氨基环丁烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min. 保留时间∶ 3.20 min，(M+H)+：596。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶4.11 min，(M+H)+：596。
化合物K7003
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶2.94 min，(M+H)+：582。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶3.99 min，(M+H)+：582。
化合物K7004
胺亲核体=1-氨基环戊烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶3.18 min，(M+H)+：610。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶4.16 min，(M+H)+：610。
化合物K7005
胺亲核体=2-氨基-2,3-二甲基丁腈。注射1条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.75分钟；流速：1.11 mL/min。保留时间∶3.33 min，(M+H)+：612。注射2条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有0.05% TFA；流动相B：95:5，乙腈:水，含有0.1% TFA；温度：50℃；梯度：0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.75分钟；流速：1.11 mL/min。保留时间∶4.31 min，(M+H)+：612。
制备化合物K8001-K8005的一般方法：
将iPr2NEt(8 eq)和HATU(1.5 eq)加入到5-(2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)-6-((2,2,2-三氟乙基)氨基)呋喃并[2,3-B]吡啶-5-基)-2-甲氧基烟酸(1 eq)和胺(1 eq)的DMF溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。通过制备HPLC纯化全部反应混合物，获得目标产物。
化合物K8001
胺亲核体=2-氨基-2-甲基丙腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶2.92 min，(M+H)+：585。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶3.88 min，(M+H)+：585。
化合物K8002
胺亲核体=1-氨基环丁烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶ 3.05 min，(M+H)+：597。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶3.87 min，(M+H)+：597。
化合物K8003
胺亲核体=1-氨基环丙烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶2.82 min，(M+H)+：583。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶3.83 min，(M+H)+：583。
化合物K8004
胺亲核体=1-氨基环戊烷甲腈盐酸盐。注射1条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：50℃；梯度：0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.75分钟；流速：1.11 mL/min。保留时间∶3.14 min，(M+H)+：611。注射2条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有0.05% TFA；流动相B：95:5，乙腈:水，含有0.1% TFA；温度：50℃；梯度：0-100% B经过3分钟，然后100% B保持0.75分钟；流速：1.11 mL/min。保留时间∶4.15 min，(M+H)+：611。
化合物K8005
胺亲核体=2-氨基-2,3-二甲基丁腈。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min。保留时间∶3.11 min，(M+H)+：613。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min。保留时间∶4.04 min，(M+H)+：613。
制备化合物K9001：
将氯[2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯][2-(2-氨乙基)苯基]钯(II)(4.5 mg，5.6 µmol)、5-(3-((2-(1,2,4-噁二唑-3-基)丙-2-基)氨基甲酰基)苯基)-6-氯-2-(4-氟苯基)-N-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(30 mg，0.056 mmol)、二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3-甲氧基-6-甲基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(2.6 mg，5.6 µmol)、2-甲基丁-2-醇化钠(30 mg，0.28 mmol)的混合物在三氟乙醇中混合，并加热到65℃，保持2小时，然后在90℃下加热16小时。用反相制备HPLC在C18柱上纯化该反应混合物，使用合适缓冲的水/CH3CN梯度，并浓缩。利用LCMS和NMR，副产物一致于：5-(3-((2-氰基丙-2-基)氨基甲酰基)苯基)-2-(4-氟苯基)-N-甲基-6-(2,2,2-三氟乙氧基)呋喃并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(1.0 mg，1.7 µmol，产率3.0%)。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ 8.31-8.28(m, 1H), 7.96-7.89(m, 4H), 7.77-7.73(m, 1H), 7.61-7.55(m, 1H), 7.26-7.21(m, 2H), 6.22-6.17(m, 1H), 5.88-5.80(m, 1H), 4.95-4.86(m, 2H), 3.01(d, J=5.0 Hz, 3H), 1.85(s, 6H)。LC-MS保留时间：1.76 min；m/z(M+H)+：555。LC数据记录在Shimadzu LC-10AS液相色谱仪上，配备有Phenomenex-Luna 3u C18 2.0x30mm柱，使用SPD-10AV UV-Vis检测器，检测器波长220 nm。使用的洗脱条件：流速：1 mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：2 min，保留时间：1 min，分析时间：3 min，其中，溶剂A是10%乙腈/90%水/0.1%三氟乙酸，溶剂B是10%水/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用电喷射模式的LC的Micromass Platform测定MS数据。
制备化合物K10001：
在室温下，将Pd/C(9.0 mg，8.5µmol)加入到(E)-5-(3-((2-(1,2,4-噁二唑-3-基)丙-2-基)氨基甲酰基)苯基)-2-(4-氟苯基)-N-甲基-6-(丙-1-烯-1-基)呋喃并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(23 mg，0.043 mmol)的MeOH(853 µl)搅拌溶液中。将该反应混合物放置在Parr弹中，充入25 PSI的H2(g)，并将该反应混合物搅拌4小时。LCMS表明没有转化。加入Pd/C(9.0 mg，8.5 µmol)，将该反应混合物放置在Parr弹中，充入50 PSI的H2(g)，并将该反应混合物搅拌16小时。过滤该反应混合物，用反相制备HPLC在C18柱上纯化，使用合适缓冲的水/CH3CN梯度，浓缩，得到5-(3-((2-氰基丙-2-基)氨基甲酰基)苯基)-2-(4-氟苯基)-N-甲基-6-丙基呋喃并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺(2.5 mg，4.7 µmol，产率11%)，与LCMS和NMR一致。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ 8.01-7.95(m, 2H), 7.94(s, 1H), 7.82(d, J=7.5 Hz, 1H), 7.70(s, 1H), 7.56-7.45(m, 2H), 7.22(t, J=8.7 Hz, 2H), 6.58(s, 1H), 6.09-6.01(m, 1H), 2.99(d, J=5.0 Hz, 3H), 2.74-2.67(m, 2H), 1.86(s, 6H), 1.71-1.65(m, 2H), 0.85(t, J=7.4 Hz, 3H)。LC-MS保留时间：2.05 min；m/z(M+H)+：499。LC数据记录在Shimadzu LC-10AS液相色谱仪上，配备有Phenomenex-Luna 3u C18 2.0x30mm柱，使用SPD-10AV UV-Vis检测器，检测器波长220 nm。使用的洗脱条件：流速：1 mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：2 min，保留时间：1 min，分析时间：3 min，其中，溶剂A是10%甲醇/90%水/0.1%三氟乙酸，溶剂B是10%水/90%甲醇/0.1%三氟乙酸。使用电喷射模式的LC的Micromass Platform测定MS数据。
制备化合物K11001和K11002：
在室温下，将2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-B]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基异脲六氟磷酸盐(V)(45 mg，0.12 mmol)加入到3-(6-(仲丁基)-2-(4-氟苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)呋喃并[2,3-b]吡啶-5-基)苯甲酸(35 mg，0.078 mmol)、N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(41μl，0.24 mmol)和2-氨基-2-甲基丙腈盐酸盐(11 mg，0.094 mmol)的DMF(0.8 µl)搅拌溶液中。在室温下搅拌该混合物30分钟。通过制备LC/MS纯化全部反应混合物，条件如下：柱∶XBridge C18，19 x 200 mm，5-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；梯度：40-80% B经过20分钟，然后100% B保持7分钟；流速：20 mL/min。将含有目标产物的级分合并，并通过离心蒸发进行干燥。进一步通过手性分离来纯化该物质。
第一个洗脱的异构体：产物的产率是8.9 mg，它的纯度是100%。两个分析LC/MS注射液用于测定最终纯度。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶2.99 min，(M+H)+：513。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶4.04 min，(M+H)+：513。1H NMR(500MHz, DMSO-d6) d 8.86(s, 1H), 8.55-8.47(m, 1H), 8.10-8.02(m, 2H), 7.98-7.94(m, 1H), 7.90(s, 2H), 7.66-7.61(m, 1H), 7.59-7.55(m, 1H), 7.43-7.36(m, 1H), 2.93-2.86(m, 1H), 2.81(d, J=4.3 Hz, 3H), 1.83-1.74(m, 1H), 1.71(s, 6H), 1.58-1.47(m, 1H), 1.19(d, J=6.7 Hz, 3H), 0.65(s, 3H)。
第二个洗脱的异构体：产物的产率是9.5 mg，它的纯度是100%。两个分析LC/MS注射液用于测定最终纯度。注射1条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，乙腈:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：1 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶2.99 min，(M+H)+：513。注射2条件：柱：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7-μm微粒；流动相A：5:95，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；流动相B：95:5，甲醇:水，含有10 mM乙酸铵；温度：40℃；梯度：0% B保持0.5分钟，0-100% B经过4分钟，然后100% B保持0.5分钟；流速：0.5 mL/min；检测：UV，220 nm。保留时间∶4.04 min，(M+H)+：513。1H NMR(500MHz, DMSO-d6) d 8.82(s, 1H), 8.50-8.45(m, J=4.3 Hz, 1H), 8.06(dd, J=8.9, 5.5 Hz, 2H), 7.96(d, J=7.9 Hz, 1H), 7.92-7.85(m, 2H), 7.67-7.60(m, 1H), 7.60-7.54(m, 1H), 7.41(t, J=8.9 Hz, 2H), 2.93-2.86(m, 1H), 2.81(d, J=4.6 Hz, 2H), 1.84-1.75(m, 1H), 1.71(s, 6H), 1.58-1.49(m, 1H), 1.20(d, J=6.7 Hz, 3H), 0.66(t, J=7.3 Hz, 3H)。
生物学方法
在下面HCV RdRp试验的测定中，化合物表现出了抗HCV NS5B活性。
HCV NS5B RdRp克隆、表达和纯化
将编码HCV基因型1b(Con1)、基因型1b变体(带有从半胱氨酸突变至天冬酰胺的氨基酸316)和基因型2a(JFH-1)的NS5B蛋白的cDNA克隆到pET21a表达载体上。为了提高溶解度，利用18氨基酸C端截断，表达每个未标记的蛋白。大肠杆菌(E. coli)感受态细胞系BL21(DE3)用于蛋白的表达。使培养物在37℃下生长～4小时，直到培养物在600 nm下达到2.0的吸光度为止。将培养物冷却至20℃，并用1 mM IPTG诱导。加入新鲜的氨苄西林，达到50 g/mL的最后浓度，并使细胞在20℃下生长过夜。
使细胞团(3L)溶解，用于纯化，得到15-24 mg的纯的NS5B。溶解缓冲剂由20 mM Tris-HCl(pH7.4)、500 mM NaCl、0.5% triton X-100、1 mM DTT、1 mM EDTA、20%甘油、0.5 mg/mL溶菌酶、10 mM MgCl2、15 mg/mL脱氧核糖核酸酶I和完全TM蛋白酶抑制剂片(Roche)组成。加入溶解缓冲剂之后，使用组织匀浆器，将冷冻的细胞团再悬浮。为了降低样品的粘度，使用与Branson超声波仪连接的微头(microtip)，在冰上超声处理溶胞产物的等分样品。在4℃，将超声处理的溶胞产物在100,000 x g下离心30分钟，并通过0.2 mm过滤装置(Corning)过滤。
使用两个连续的色谱步骤来纯化蛋白：肝素琼脂糖CL-6B和polyU琼脂糖4B。色谱缓冲剂与溶解缓冲剂相同，但不包含溶菌酶、脱氧核糖核酸酶I、MgCl2或蛋白酶抑制剂，并且根据向柱上装载蛋白的要求，调节缓冲剂的NaCl浓度。用NaCl梯度洗脱每个柱，根据柱型，长度变化为5-50个柱体积。在最后的色谱步骤之后，基于SDS-PAGE分析，所得到的酶的纯度>90%。将酶等分，并在-80℃下保存。
HCV NS5B RdRp酶活性测定
在384孔板中，使用微粒上的固相均匀试验，评价NS5B抑制剂(WangY-K, Rigat K, Roberts S, 和Gao M(2006)Anal Biochem, 359: 106-111)。通过引物和微粒在1X缓冲液中的混合，将生物素化的低聚dT12引物收集在链亲和素结合的成像微粒(GE，RPNQ0261)上，并在室温下培养三小时。离心之后，除去未结合的引物。将引物结合的微粒再悬浮在3X反应混合物(20 mM Hepes缓冲液(pH7.5)、dT引物结合的微粒、多聚腺苷酸模板、3H-UTP和RNAse抑制剂(Promega N2515))。将化合物连续在DMSO中稀释(1:3)，并等分到试验板中。在试验板上，将相同体积(5mL)的水、3X反应混合物和酶(在3X试验缓冲液(60 mM Hepes缓冲液，pH7.5，7.5 mM MgCl2，7.5 mM KCl，3 mM DTT，0.03 mg/mL BSA，6%甘油)中)加入到稀释的化合物中。在384孔试验中，组分的最后浓度：0.36 nM模板，15 nM引物，0.29 mM 3H-UTP(0.3 mCi)，1.6 U/mL RNAse抑制剂，7 nM NS5B酶，0.01 mg/mL BSA，1 mM DTT，以及0.33 mg/mL微粒，20 mM Hepes缓冲剂(pH7.5)，2.5 mM MgCl2，2.5 mM KCl，0.1% DMSO。
在30℃，使反应进行24小时，并加入50 mM EDTA(5 mL)，使反应停止。培养至少15分钟之后，将板在Amersham LEADseeker多模态成像系统上读数。
使用十个不同的[I]，测定化合物的IC50值。使用四参数逻辑公式y=A +((B-A)/(1+((C/x)^D)))，由抑制来计算IC50值，其中，A和B分别表示最小和最大%抑制，C是IC50值，D是峰丘斜率，x表示化合物浓度。
细胞系
用于评价化合物的细胞系由人类肝细胞衍生的细胞系(Huh-7)组成，它结构性地表达基因型1b(Con-1)HCV复制子或基因型1b(Con-1)HCV复制子(在氨基酸316位置，天冬酰胺替代半胱氨酸)或含有Renilla荧光素酶指示基因的基因型2a(JFH-1)复制子。这些细胞保存在含有10% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素和1.0 mg/mL G418的Dulbecco's改进的Eagle培养基(DMEM)中。
HCV复制子荧光素酶试验
为了评价化合物效果，将滴定的化合物转入到无菌的384孔组织培养物处理的板中，并用HCV复制子细胞(在含有4% FBS的DMEM中，最终DMSO浓度为0.5%)将板播种(50mL，密度为2.4 x 103个细胞/孔)。在37℃下培养3天之后，按照生产商的指导，使用EnduRen底物(Promega cat #E6485)，分析细胞的Renilla荧光素酶活性。简要地说，将EnduRen底物稀释在DMEM中，然后加入到板中，最终浓度达到7.5mM。将板在37℃下培养至少1小时，然后使用荧光方案，在Viewlux成像仪(PerkinElmer)上读数。使用上面提到的四参数逻辑公式，计算50%有效浓度(EC50值)。
为了评价化合物的细胞毒性，将Cell Titer-Blue(Promega)加入到含有EnduRen的板中，并在37℃下培养至少4小时。使用Viewlux成像仪，读出每个孔的荧光信号。使用四参数逻辑公式，计算所有的CC50值。
化合物的EC50值数据表示如下：A：<100 nM；B=100-1000 nM；C>1000 nM。化合物的代表性数据报道于表2中。
本领域技术人员可以理解，本公开不局限于上述例证性的实施例，并且在不背离本公开实质特性的条件下，其可以通过其它具体形式来具体表现。为此，期望在各方面都认为这些实施例是说明性的实施例，并且没有限制性，应该依据附加的权利要求，而不是上述实施例，并因此在该权利要求的等效含义和范围内的所有变化包括在其中。