电化学测量方法以及电化学测量装置与流程

本公开涉及用于对细胞或者组织等的活动状态进行测量、解析的电化学测量方法以及电化学测量装置。

背景技术：

细胞、组织通过输送、消耗各种物质而活动。例如，胚胎一边消耗周围的氧一边进行细胞分裂。因而，能够通过测量细胞、组织等样本的周围的环境来对该样本的活动状态进行解析。

作为测量样本的周围的环境的方法，例如有利用设有作用电极的电化学测量设备来进行包含样本的溶液的电化学测量的方法。

另外，作为与本申请关联的在先技术文献，例如已知专利文献1。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2010/055942号

技术实现要素：

本公开的电化学测量方法是利用电化学测量设备来测量生物体样本的方法，该电化学测量设备具有阱和被设置在阱内的作用电极，并且在阱内填充测量液以使得与作用电极接触。

电化学测量方法包括：向作用电极施加测量电压并测量作用电极中流动的第一电流值的步骤；之后向作用电极施加非测量电压的步骤；之后在阱内投入生物体样本的步骤；之后向作用电极施加测量电压并测量作用电极中流动的第二电流值的步骤。

此外，本公开的电化学测量装置是利用具有阱和被设置在阱内的作用电极的电化学测量设备来测量生物体样本的电化学测量装置。

电化学测量装置具备：载置部，载置电化学测量设备；端子，与电化学测量设备的作用电极电连接；以及控制部，控制向作用电极施加的电压。

控制部向作用电极施加测量电压，测量投入生物体样本之前的作用电极中流动的第一电流值，之后，向作用电极施加非测量电压，之后，在生物体样本被投入到所述电化学测量设备之后，向作用电极施加测量电压，测量作用电极中流动的第二电流值。

附图说明

图1是本实施方式1中的电化学测量设备的立体图。

图2是本实施方式1中的电化学测量装置的立体图。

图3是本实施方式1中的电化学测量设备的剖面示意图。

图4是本实施方式1中的电化学测量设备的俯视示意图。

图5是表示本实施方式1中的电化学测量方法的流程图。

图6是表示本实施方式1中的电压施加协议的图表。

图7是表示本实施方式1的变形例1中的电压施加协议的图表。

图8是表示本实施方式1的变形例2中的电化学测量方法的流程图。

图9是表示本实施方式1的变形例2中的电压施加协议的图表。

图10是本实施方式2中的电化学测量设备的俯视图。

图11是表示本实施方式2中的电化学测量方法的流程图。

图12是表示本实施方式2中的电压施加协议的图表。

图13是表示本实施方式2中的电压施加协议的区间11的一例的图表。

图14是表示本实施方式2中的电压施加协议的区间11的另一例的图表。

具体实施方式

在现有的电化学测量中，生物体样本的投入或者回收在施加了测量电压的状态下进行。因而，作用电极中流动与生物体样本的投入以及回收相伴的电流噪声。产生的电流噪声有可能妨碍准确的电化学测量。

以下，利用附图来详细地说明本公开的实施方式所涉及的电化学测量方法以及电化学测量装置。另外，以下说明的实施方式均表示本公开的优选的一具体例。因此，以下的实施方式所示的数值、形状、材料、构成要素、构成要素的配置以及连接方式等只是一例，并非限定本公开的宗旨。由此，以下的实施方式中的构成要素之中，表示本公开的最上位概念的独立权利要求中未记载的构成要素作为任意的构成要素来说明。

此外，各图为示意图，并非是被严格地图示的图。在各图中，对于实质上相同的构造赋予相同的符号，并省略或者简化重复的说明。

(实施方式1)

图1是本实施方式中的电化学测量设备10的立体图。图2是本实施方式中的电化学测量装置30的立体图。图3是本实施方式中的电化学测量设备10的剖面示意图。图3表示图1的线3-3处的剖面图。图4是本实施方式中的电化学测量设备的俯视示意图。

电化学测量设备10是用于对胚胎等细胞或者组织等生物体样本101的活动状态进行测量的设备。

电化学测量设备10具备容器11和电极芯片12。容器11具有上部容器11a和下部容器11b。

容器11具有被安装于容器11的内部的电极芯片12。容器11具有用于积存测量液102的积存部13。在积存部13的底面设置有多个倒圆锥形状的阱14。生物体样本101被配置在阱14的内部。容器11例如通过树脂成型等来制作。

电极芯片12具有区域15以及作用电极16。区域15是用于配置生物体样本101的场所。作用电极16用于生物体样本101的电化学测量。

区域15例如是被设置于电极芯片12的上表面的凹部。另外，区域15并不限于电极芯片12的凹部。例如，区域15也可以为电极芯片12的平面的一部分。

多个作用电极16被设置为包围区域15的周围。通过采用这种构成，从而能够将配置于区域15的生物体样本101与作用电极16之间的距离确保为恒定。

另外，作用电极16可以配置有多个，使得距区域15的中心的距离不同。由此，电化学测量设备10能够在距生物体样本101的距离不同的多个位置处进行电化学测量。

在电化学测量设备10中，依次层叠有下部容器11b、电极芯片12和上部容器11a。在阱14的底部形成有贯通孔53，贯通孔53贯通了上部容器11a的下部。通过该构成，在阱14的底部露出了电极芯片12的作用电极16。

在容器11的周围的台阶部分的下表面，设置有连接端子17。连接端子17与作用电极16电连接。连接端子17与电化学测量装置30等计测设备连接。

在容器11与电极芯片12之间，为了抑制测量液102的漏出而设置有密封件18。

另外，作用电极16可以被设置在区域15中。此外，连接端子17只要与作用电极16电连接即可，也可以形成在容器11的任何位置。

此外，在电化学测量设备10中，可以不形成在阱14的底面所形成的贯通孔53而是阱14的底面被堵塞的状态。而且，区域15以及作用电极16可以不设置在电极芯片12上，而是直接设置在容器11的阱14的底面。在该情况下，无需利用电极芯片12。

电化学测量装置30利用电化学测量设备10来进行生物体样本的电化学测量。电化学测量装置30例如进行电压向作用电极16的施加、作用电极16中流动的电流的测量。

电化学测量装置30具有台31、载置部32、端子33、控制部34以及覆盖件35。

电化学测量设备10被载置于台31上的载置部32。载置部32例如具有在台31的上表面所设置的凹部。电化学测量设备10被固定于载置部32的凹部。

在台31设置有端子33。端子33与电化学测量设备10的连接端子17接触。由此，作用电极16与端子33电连接。此外，端子33与控制部34电连接。

控制部34控制向作用电极施加的电压的大小以及施加的定时。控制部34包含电源电路以及电压施加电路等。由此，控制部34能够进行施加电压的指令信号的生成、电压向作用电极的施加。

此外，电化学测量装置30也可以具有测量部36以及运算部37。测量部36例如测量由于施加的电压而在作用电极16中流动的电流。运算部37基于测量出的电流值来计算例如生物体样本101的活性度。

如图2所示，控制部34、测量部36以及运算部37可以分别由独立的电路构成。或者，控制部34、测量部36和运算部37也可以由一个IC构成。

覆盖件35是为了将生物体样本101的测量环境保持为适当的环境而设置的。即，覆盖件35形成与外部气体隔离的测量环境。通过设置覆盖件35，从而电化学测量装置30能够在适当的环境下测量生物体样本101。

覆盖件35被设置于台31的上方。载置于载置部32的电化学测量设备10被覆盖件35完全覆盖。

在此，生物体样本101的测量中的适当的环境，例如是在37℃下在空气中具有5％的二氧化碳的环境。为了维持该环境，电化学测量装置30可以具备供给二氧化碳的供给口、温度传感器、加热器等。

以下，参照图3、图4来说明测量生物体样本101时的电化学测量设备10的动作。

生物体样本101例如为胚胎。胚胎包含未分化以及进行了卵裂的受精卵。

胚胎一边消耗周围的氧一边在卵泡内部进行分裂。电化学测量装置30能够利用作用电极16来计测在胚胎周边溶解的氧量。然后，能够根据计测出的氧量来确认胚胎的氧消耗的活动状态。

在积存部13设置有参照电极23以及对电极24。

测量液102被填充至积存部13以及阱14内，使得与作用电极16、参照电极23和对电极24接触。

作用电极16、参照电极23以及对电极24与电化学测量装置30电连接。

电化学测量装置30的控制部34以及测量部36例如为恒电位仪。恒电位仪是使作用电极16相对于参照电极23的电位为恒定的装置。

生物体样本101被配置于在电极芯片12的上表面所形成的区域15。

对在生物体样本101的周边溶解的氧量进行计测时，利用恒电位仪向作用电极16施加氧化还原电位。由此，在作用电极16的周边溶解的氧被还原。通过氧被还原，从而作用电极16中流动电流。作用电极16中流动的电流由恒电位仪来测量。

作用电极16中流动的电流值与在作用电极16的周边溶解的氧量相关。因而，通过计测在生物体样本101的周围所配置的作用电极16的电流值，从而能够估计作为生物体样本101的周边的物质浓度的溶解氧浓度(溶解氧量)。

另外，也可以不设置对电极24。即，参照电极23除了具有作为参照电极23的作用之外，还可以具有作为对电极24的作用。

图5是本实施方式中的电化学测量方法的流程图。图6是表示向作用电极16施加的电压的施加定时的一例的电压施加协议。

以下，参照图5以及图6来说明胚胎等单个生物体样本101的氧消耗量的电化学测量方法。在此，单个生物体样本101为一个细胞、一个细胞块以及一个组织。测量液102中以分散的状态包含的多个细胞不包含于单个生物体样本101。

在电极芯片12的上表面，设置有被配置在距区域15的中心不同的距离处的多个作用电极16。

本实施方式中的电化学测量方法构成为包括：向容器11注入测量液102的步骤(S010)；向作用电极16施加测量电压Vm并测量投入生物体样本101之前的空置(blank)状态的第一电流值I₁的步骤(S020)；向作用电极16施加非测量电压Vn的步骤(S025)；投入生物体样本101的步骤(S030)；向作用电极16施加测量电压Vm并测量投入了生物体样本101之后的第二电流值I₂的步骤(S040)；向作用电极16施加非测量电压Vn的步骤(S045)；回收生物体样本101的步骤(S050)；向作用电极16施加测量电压Vm并测量回收了生物体样本101之后的空置状态的第三电流值I₃的步骤(S060)；以及根据测量出的电流值I₁、I₂、I₃来计算作为测量液102中的物质浓度的溶解氧浓度(溶解氧量)的步骤(S070)。通过该溶解氧浓度的变化来计测生物体样本101的活性。

在步骤S010中，向容器11的积存部13以及阱14注入测量液102。测量液102与作用电极16、参照电极23以及对电极24接触。然后，将电化学测量设备10载置于电化学测量装置30的载置部32。此时，连接端子17与端子33接触。另外，在本实施例中，作为作用电极16以及对电极24而利用铂电极来进行说明。此外，作为参照电极23而利用银/氯化银电极来进行说明。不过，电极材料并不限定于这些。

在此，在预先填充有测量液102的容器11中，可以从步骤(S020)开始。

在步骤S020中，向作用电极16施加测量电压Vm并测量投入生物体样本101之前的第一电流值I₁。测量电压Vm在图6所示的区间1中被施加。测量电压Vm为氧化还原电位。在本实施方式中，测量电压Vm例如为-0.6V。此外，区间1是120秒～240秒之间的区间。区间1优选为10秒钟以上且120秒钟以下。另外，在缩短电化学测量的测量时间的目的下，也可以将区间1设为5秒以上且10秒以下。

在区间1之前的区间内，被施加非测量电压Vn。在此，测量电压Vm是在进行测量时施加的电压。非测量电压Vn是施加为在电极中不会流动电流的电压。

测量电压Vm被施加于作用电极16，从而作用电极16的周边的溶解氧被还原，因此在作用电极16中流动氧还原电流。测量部36测量作用电极16中流动的第一电流值I₁。

如此，在步骤S020中，能够测量不受生物体样本101影响的空置状态的测量液102中所含的溶解氧浓度(溶解氧量)引起的第一电流值I₁。

在步骤S025中，向作用电极16施加非测量电压Vn。然后，在步骤S030中，投入生物体样本101。非测量电压Vn在图6所示的区间2内被施加。非测量电压Vn为电化学测量装置30的开路电压。在本实施方式中，非测量电压Vn例如为0.2V。此外，区间2为240秒～360秒之间的区间。区间2优选为30秒钟以上且120秒钟以下。

生物体样本101在作用电极16被施加了非测量电压Vn的状态下被配置于区域15。在区域15配置一个生物体样本101。由于在作用电极16中未流动电流，因此能够抑制将生物体样本101配置于区域15时的电流噪声。

此外，即便是生物体样本101与作用电极16接触了的情况，在生物体样本101中也不会流动电流，因此能够防止生物体样本101受到损伤。

在步骤S040中，测量投入了生物体样本101之后的第二电流值I₂。

测量电压Vm在图6所示的区间3内被施加。测量电压Vm为氧化还原电位。在本实施方式中，测量电压Vm例如为-0.6V。此外，区间3为360秒～480秒之间的区间。区间3优选为10秒钟以上且120秒钟以下。另外，在缩短电化学测量的测量时间的目的下，优选将区间1设为5秒以上且10秒以下。

如此，在步骤S040中，能够测量受到生物体样本101的呼吸活动的影响的溶解氧浓度(溶解氧量)引起的第二电流值I₂。

放置于区域15的生物体样本101随着呼吸活动而消耗测量液102中的周围的溶解氧。因而，在测量液102中的生物体样本101的附近，成为氧少的状态。此外，越远离生物体样本101，测量液102中的溶解氧越接近测量液102的饱和溶解氧的状态。

生物体样本101的呼吸活动越活跃，在生物体样本101的附近消耗的氧越多。即，在生物体样本101的周边形成的氧浓度梯度的大小由作为生物体样本101的受精卵的呼吸活动量来决定。

在步骤S045中，向作用电极16施加非测量电压Vn。在步骤S050中，回收生物体样本101。非测量电压Vn在图6所示的区间4内被施加。非测量电压Vn为包含与电化学测量设备10连接的计测设备在内的电化学测量装置30整体的开路电压。此时，在电化学测量设备10中填充有测量液102。在本实施方式中，非测量电压Vn例如为0.2V。此外，区间4为480秒～600秒之间的区间。区间4优选为30秒钟以上且120秒钟以下。

生物体样本101在作用电极16被施加了非测量电压Vn的状态下从测量液102取出。此时，由于在作用电极16中未流动电流，因此能够抑制取出生物体样本101时的电流噪声。

此外，即便是生物体样本101与作用电极16接触了的情况，在生物体样本101中也不会流动电流，因此能够防止生物体样本101受到损伤。

在步骤S060中，向作用电极16施加测量电压Vm并测量回收生物体样本101之后的第三电流值I₃。测量电压Vm在图6所示的区间5内被施加。测量电压Vm为氧化还原电位。在本实施方式中，测量电压Vm例如为-0.6V。此外，区间5为600秒～720秒之间的区间。区间5优选为10秒钟以上且120秒钟以下。另外，在缩短电化学测量的测量时间的目的下，也可以将区间1设为5秒以上且10秒以下。

测量电压Vm被施加于作用电极16，从而作用电极16的周边的溶解氧被还原，因此在作用电极16中流动氧还原电流。测量部36测量作用电极16中流动的第三电流值I₃。

如此，在步骤S060中，能够测量不直接受生物体样本101影响的空置状态的测量液102中所含的溶解氧浓度引起的第三电流值I₃。

另外，优选步骤S020、步骤S040以及步骤S060的测量电压Vm为相同的值。此外，优选步骤S030以及步骤S050的非测量电压Vn为相同的值。

进而，优选区间1、区间3以及区间5为相同的时间。此外，优选区间2以及区间4为相同的时间。

在步骤S070中，利用测量出的第一电流值I₁、第二电流值I₂以及第三电流值I₃来计算溶解氧浓度(溶解氧量)。

以下，利用在步骤S040中计测出的第二电流值I₂来说明步骤S040中的生物体样本101的周围的溶解氧浓度的计算方法。

首先，如式(1)所示，各作用电极16的第二电流值I₂除以由各作用电极16测量出的第一电流值I₁，由此来求出各作用电极16的电流变化率I^*₂。

【数学式1】

I^*₂＝I₂/I₁ (式1)

如此一来，即便多个作用电极16中流动的第一电流值I₁以及第二电流值I₂的绝对值不同，也能够标准化为电流变化率I^*₂。

如前所述，在步骤S040中，伴随生物体样本101的氧消耗，在生物体样本101的附近成为溶解氧浓度低的状态。此外，越远离生物体样本101，生物体样本101给测量液102中的溶解氧带来的影响越小。

由此，在步骤S040中，生物体样本101的附近的作用电极16的电流变化率I^*₂变大。此外，距离生物体样本101越远，作用电极16的电流变化率I^*₂越小。

各作用电极16中的电流变化率I^*₂与各作用电极16距生物体样本101的距离成反比例。

因此，相对于距生物体样本101的距离的倒数，绘制各作用电极16中的电流变化率I^*₂所得到的直线的斜率表示伴随生物体样本101的氧消耗而形成的氧浓度梯度。

伴随生物体样本101的氧消耗而形成的氧浓度梯度由(式2)来表示。

【数学式2】

ΔC＝C₀×(I₁-I₂)/I₁×r/R

＝C₀×(1-I^*₂)×r/R (式2)

在此，C₀为体积的溶解氧浓度。体积的溶解氧浓度是指，不含生物体样本101的状态的测量液102中所含的溶解氧浓度。此外，r为生物体样本101的半径。R为从生物体样本101的中心至作用电极16的中心为止的距离。另外，生物体样本101的中心可以设为区域15的中心。

在胚胎等球形的生物体样本101中，考虑由于呼吸活动而从生物体样本101的中心呈球面状形成氧浓度梯度。因而，向球形的生物体样本101的表面的氧流束的总和遵循Fick的第一定律，因此由(式3)来表示。

【数学式3】

F＝4πrDΔC (式3)

在此，D为测量液102中的溶解氧的扩散系数。

在本实施方式中，由于生物体样本101被配置于区域15，因此考虑从区域15的中心呈半球面状扩散。因此，本实施方式中的生物体样本101的氧消耗量由(式4)来表示。

【数学式4】

F＝2πrDΔC (式4)

步骤S020以及步骤S060中的溶解氧浓度梯度以及氧流束也与上述同样地求出。即，利用第一电流值I₁、第二电流值I₂以及第三电流值I₃来计算各步骤中的溶解氧浓度梯度以及氧流速，根据步骤S040的氧流速的大小来计测生物体样本101的活性。

另外，实际上，由于作用电极16的表面的附着物等，各作用电极16中流动的氧还原电流的值随时间减少。

此外，由于阱14的内部的对流的影响，有时在空置状态下也会在阱14的内部形成氧流束。

因而，为了提高生物体样本101的氧消耗量的精度，也可以用步骤S020以及步骤S060的空置状态下的氧流束来修正在步骤S040中求出的氧流束。

另外，计算的物质浓度并不限于溶解氧浓度。例如，物质浓度可以为表示生物体样本101的活性的物质的浓度。

此外，生物体样本101的电化学测量可以通过本实施方式中的电化学测量方法的一部分的步骤来进行。例如，可以仅测量第一、第二电流值，此外，也可以不测量第一电流值而测量第二、第三电流值。

如前所述，电化学测量装置30的控制部34为了进行本实施例中的电化学测量方法，执行：向作用电极16施加测量电压Vm并测量投入生物体样本101之前的第一电流值I₁的步骤；在将生物体样本101投入电化学测量设备10之前的定时，向作用电极16施加非测量电压Vn的步骤；向作用电极16施加测量电压Vm并测量投入生物体样本101之后的第二电流值I₂的步骤；在将生物体样本101从电化学测量设备10回收之前的定时，向作用电极16施加非测量电压Vn的步骤；以及向作用电极16施加测量电压，并测量回收生物体样本101之后的第三电流值I₃的步骤。

(变形例1)

图7是表示本实施方式中的电压施加协议的变形例1的图表。

本变形例与前述的实施方式不同在于，区间1、区间3以及区间5中的测量电压Vm的施加方法。

以下，说明本变形例。

在本变形例中，测量电压Vm以脉冲状的波形被施加。即，例如，在步骤S020的区间1内，交替重复测量电压Vm和非测量电压Vn地向作用电极16施加。在区间3以及区间5中也是相同的。在各区间内，1脉冲中的测量电压Vm的施加时间优选为1秒以上且10秒以下。此外，在各区间内，至少赋予两次脉冲波形。在图7所示的例子中，在区间1内施加三次的测量电压Vm。测量电压Vm的施加时间为5秒。

此外，测量电压Vm之间的非测量电压Vn的施加时间为1秒以上且25秒以下。

非测量电压Vn的施加时间可以与测量电位Vm的施加时间相等。例如，在将测量电位Vm的施加时间设为5秒的情况下，非测量电位Vn的施加时间也可为5秒。

另外，优选在区间1、区间3以及区间5内施加的电压的脉冲波形相等。即，优选图6所示的电压波形的脉冲宽度以及周期相等。

通过施加脉冲状的电压，从而被测量的电流的波形也成为脉冲状的波形。此时，例如，可以利用区间1的最初的脉冲所得到的电流值来标准化其他电流值。由此，能够获得被标准化的氧还原电流值。

通过使施加电压为脉冲状，从而能够缩短生物体样本101被配置于区域15的状态下的电压施加的累积时间。

通过缩短电压施加的累积时间，从而能够抑制由于氧的还原而产生的还原物在作用电极16的表面蓄积。由此，能够抑制作用电极16中流动的电流值的随时间减少。此外，也能够减小生物体样本101能受到还原物的影响。

(变形例2)

图8是本变形例中的电化学测量方法的流程图。图9是表示本实施方式中的电压施加协议的变形例2的图表。

本变形例与实施方式不同点在于，在区间1之前还设置有施加测量电压Vm的区间10。

以下，说明本变形例。

本变形例中的电化学测量方法在测量第一电流值I₁的步骤S020之前具有使作用电极16中流动的电流值稳定化的步骤S015。

在向容器11注入测量液的步骤S010之后进行步骤S015。

在步骤S015中，向作用电极16施加测量电压Vm。测量电压Vm在区间10内被施加。

在进行步骤S015之后，依次进行步骤S020以后的测量。

区间10是为使作用电极16稳定化而需的时间。此外，可以一边监控作用电极16中流动的电流的值一边决定测量电压Vm的施加时间。

在向电化学测量设备10注入测量液之后，当最初施加电压时，根据计测设备、作用电极16的状态，有时会流动较大的瞬态电流。

在步骤S020中的测量第一电流值I₁之前，预先施加测量电压Vm，从而能够在步骤S020的测量中降低瞬态电流的影响。

此外，关于作用电极16中流动的电流的值，通过在短暂的期间内向作用电极16施加电压，从而电流的值减少某种程度之时，成为稳定化状态。如此，能够使作用电极16的状态稳定化。

因此，预先将测量电压Vm施加于作用电极16，从而能够减小在步骤S020中计测的第一电流值I₁的电流变动。

此外，通过设置步骤S015，从而能够在进行步骤S020的测量之前检测作用电极16以及计测设备的异常。而且，在产生了异常的情况下，能够基于在步骤S015中获得的氧还原电流，将错误显示于显示器(未图示)等。另外，在步骤S015中施加于作用电极16的测量电压Vm可以为恒定的电压，也可以为脉冲状的电压。

(实施方式2)

以下，参照附图来说明本实施方式中的生物体样本101的电化学测量方法。另外，在本实施方式中，对于与实施方式1相同的构成赋予相同的符号，并省略其详细说明。

图10是本实施方式中的电化学测量设备50的俯视图。本实施方式与实施方式1不同点在于，提供一种并行测量被设置于电化学测量设备50的多个生物体样本101的测量方法。

电化学测量设备50在积存部13具有多个阱41、42、43、44。在本实施方式中，将阱41、42、43、44总称为阱14。阱14的数量优选为2个以上且6个以下。在各阱14的下侧配置有电极芯片12。在阱41的内部设置有作用电极61。在阱42的内部设置有作用电极62。在阱43的内部设置有作用电极63。在阱44的内部设置有作用电极64。在本实施方式中，将作用电极61、62、63、64总称为作用电极16。

在各个阱14内的区域15配置各一个生物体样本101。

本实施方式中的电化学测量设备50的动作方法与实施方式1相同。

图11是表示本实施方式中的电化学测量方法的流程图。以下，表示本实施方式2中的测量多个生物体样本101的活性状态的方法。

本实施方式中的电化学测量方法构成为包括：向容器11注入测量液102的步骤(S100)；分别向作用电极16施加测量电压Vm，并测量在各阱14中投入生物体样本101之前的空置状态的第一电流值I_1x的步骤(S200)；分别向作用电极16施加非测量电压Vn的步骤(S250)；将多个生物体样本101各一个地投入到各阱14的步骤(S300)；分别向作用电极16施加测量电压Vm，并测量在各阱14中投入生物体样本101之后的第二电流值I_2x的步骤(S400)；分别向作用电极16施加非测量电压Vn的步骤(S450)；从各阱14回收生物体样本101的步骤(S500)；分别向作用电极16施加测量电压Vm，并测量在各阱14中回收生物体样本101之后的空置状态的第三电流值I_3x的步骤(S600)；以及根据测量出的电流值I_1x、I_2x、I_3x来计算作为各阱14的测量液102中的物质浓度的溶解氧浓度(溶解氧量)的步骤(S700)。通过该溶解氧浓度的变化来计测生物体样本101的活性。

图12是表示本实施方式中的电压施加协议的图表。图13是将图12中的区间11放大表示的图。

在步骤S100中，向容器11注入测量液102。

在步骤S200中，向分别被配置于多个阱14的作用电极16依次施加测量电压Vm，用多个阱14各自的作用电极16来测量投入生物体样本101之前的第一电流值I_1x。在此，第一电流值I_1x表示各阱14中的各自的电流值。测量电压Vm在区间11内被施加于作用电极16。

关于图13所示的电压施加协议，在区间11内，各测量一次各阱14的作用电极16中流动的第一电流值I_1x。

以下，具体说明电压的施加方法。

区间11具有区间A、区间B、区间C和区间D。

在区间A内，向被配置于多个阱14之中的一个阱41的作用电极61施加测量电压Vm。由此，测量阱41内的作用电极61中流动的第一电流值I₁₁。

在区间B内，向被配置于多个阱14之中的一个阱42的作用电极62施加测量电压Vm。由此，测量阱42内的作用电极62中流动的第一电流值I₁₂。

在区间C内，向被配置于多个阱14之中的一个阱43的作用电极63施加测量电压Vm。由此，测量阱43内的作用电极63中流动的第一电流值I₁₃。

在区间D内，向被配置于多个阱14之中的一个阱44的作用电极64施加测量电压Vm。由此，测量阱44内的作用电极64中流动的第一电流值I₁₄。

在各个区间内，施加于作用电极16的测量电压Vm施加的是脉冲状的电压。另外，在各个区间内，施加于作用电极16的测量电压Vm可以为恒定的电压。

如此，通过依次切换施加测量电压Vm的作用电极16，从而能够依次测量各作用电极中流动的第一电流值I_1x。

在步骤S250中，分别向作用电极16施加非测量电压Vn。然后，在步骤S300中，将多个生物体样本101各一个地分别投入到多个阱14。非测量电压Vn在区间12内被施加于作用电极16。

在步骤S400中，向分别被配置于多个阱16的作用电极16依次施加测量电压Vm，用多个阱14各自的作用电极16来测量投入生物体样本101之后的第二电流值I_2x。在此，第二电流值I_2x表示各阱14中的各自的电流值。测量电压Vm在区间13内被施加于作用电极16。

在步骤S400中，测量电压Vm通过与步骤S200相同的电压施加方法而被施加于作用电极16。由此，能够测量第二电流值I_2x。

在步骤S450中，分别向作用电极16施加非测量电压Vn。然后，在步骤S500中，回收多个生物体样本101。非测量电压Vn在区间14内被施加于作用电极16。

在步骤S600中，向分别被配置于多个阱14的作用电极16依次施加测量电压Vm，用多个阱14各自的作用电极16来测量回收生物体样本101之后的第三电流值I_3x。在此，第三电流值I_3x表示各阱14中的各自的电流值。测量电压Vm在区间15内被施加于作用电极16。

在步骤S600中，测量电压Vm通过与步骤S200相同的电压施加方法而被施加于作用电极16。由此，能够测量第三电流值I_3x。

在步骤S700中，根据测量出的电流值I_1x、I_2x、I_3x来计算各阱14的测量液102中的溶解氧浓度(溶解氧量)。

图14是表示本实施方式中的另一个电压施加协议的图表。

如图14所示，在步骤S200、步骤S400以及步骤S600中，反复执行多次向分别被配置于多个阱14的作用电极16依次施加测量电压Vm的操作。由此，测量第一电流值I_1x、第二电流值I_2x以及第三电流值I_3x。即，在各步骤的电流值计测中，区间A～D重复多次。

控制部34按照每一个脉冲切换作用电极16来施加向各阱14的作用电极16施加的测量电压Vm。如此，通过按照每一个脉冲来进行阱的切换，从而能够使步骤S200、S600中的空置测量以及步骤S400中的生物体样本的活性测量之中的各阱14的测量的时间间隔大致相同。另外，在一次操作的各个区间内施加于作用电极16的测量电压Vm并不限于一个脉冲量，也可以具有多个脉冲波形。

脉冲数的总和设为测量的受精卵的个数的倍数。

另外，优选被施加于作用电极61的测量电压Vm的脉冲数以及脉冲宽度与被施加于其他作用电极62、63、64的测量电压Vm的脉冲数以及脉冲宽度相等。

以上，基于实施方式说明了一个或者多个形态所涉及的电化学测量方法以及电化学测量装置，但本公开并不限定于该实施方式。例如，电化学测量方法可以为被执行的程序。

只要不脱离本公开的主旨，在本实施方式中实施本领域技术人员想到的各种变形的方式、组合不同实施方式中的构成要素而构筑的方式，也可以包含在一个或者多个形态的范围内。

本公开所涉及的电化学测量方法以及电化学测量装置能够抑制伴随生物体样本的投入或者回收而产生的电流噪声。

产业上的可利用性

本公开的电化学测量方法以及电化学测量装置在受精卵、细胞等生物体由来物的活性状态的计测中是有用的。

符号说明

10、50 电化学测量设备

11 容器

11a 上部容器

11b 下部容器

12 电极芯片

13 积存部

14、41、42、43、44 阱

15 区域

16、61、62、63、64 作用电极

17 连接端子

18 密封件

23 参照电极

24 对电极

30 电化学测量装置

31 台

32 载置部

33 端子

34 控制部

35 覆盖件

36 测量部

37 运算部

53 贯通孔

101 生物体样本

102 测量液