用于生产短毛动物的材料和方法与流程

文档序号：12070536阅读：586来源：国知局

本申请要求于2014年9月23日递交的美国临时申请62/054,169的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。

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背景技术：

在很多情况下，都期望动物具有短毛的皮毛。一些动物中，这在缓解热应激方面特别有用。也可能存在这样的情况，基于美学和/或引起过敏等原因，短毛是优选的。

耐热性是大的牲畜尤其是牛的重要特征。在美国，每年过热都会杀死数以千计的牛，降低牛的性能，并阻止最高性能的品种在炎热气候中的使用。减少牛的热应激的一个方法是缩短毛发。在牛中，短毛皮毛被称为“光滑”皮毛，相关基因称为SLICK基因，短毛皮毛的表型被称为“光滑表型”。

一些牛生产者在夏天为牛剃毛以提高耐热性；然而这一方法是劳动密集型的和昂贵的，对大群牛是不切实际的。光滑表型天然存在于抽取的西非的一些牛品种中，包括Senepol、Carora和Romosinuano；然而这些品种具有不太优良的性能和胴体品质，这限制了他们在养牛业的应用。

光滑表型的基因基础被认别为是单个显性基因(Olson等(2003),J Anim Sci.；81(1):80-90)。传统的连锁分析定位到负责的基因位于牛染色体20的500万碱基对区域(Mariasegaram等(2007),Anim Genet.；38(1):54-59)。该区域使用全基因组关联研究(GWAS)进一步缩小(Huson等(2014),Front Genet.；Apr 29,Vol.5:101)。但是较窄的区域包含几个基因，它们都不包含突变。因此，变窄可能是一个错误。

在热应激下维持体内平衡的能力对亚热带和热带地区的牛是特别重要的。虽然品种间耐热性的差异已被研究了很多年，但是针对阐明涉及耐热性的遗传模式的研究相对较少。在澳大利亚已经研究了热应激下体温的变化，并且表明具有低至中等的遗传可能性(Turner,1982；1984；Mackinnon等,1991；Burrow,2001)。据报道，Senepol牛与婆罗门牛(Brahman cattle)的耐热性相同(Hammond和Olson,1994；Hammond等,1996)。与温带品种杂交的Senepol F1显示出与婆罗门牛和婆罗门杂交牛相当的耐热性(Hammond和Olson,1994；Hammond等,1996；1998)。

到目前为止，仍不知道是什么突变导致光滑皮毛的表型。

发明简述

本发明提供了用于生产短毛动物的材料和方法。在优选的实施方式中，这通过改变动物中的编码催乳素受体(PRLR)蛋白的核苷酸序列来实现，以产生缩短形式的蛋白质。有利地并且意外地，根据本发明产生的缩短的蛋白质保留了催乳的功能，但导致动物具有短毛皮毛。

在一个实施方式中，本发明提供了用于编码缩短的催乳素受体蛋白质的聚核苷酸序列。聚核苷酸序列可以是用于缩短C-末端的缺失核苷酸，或如果所述核苷酸存在的话，它们与编码N-末端的核苷酸都不在可读框内。

在另一个实施方式中，本发明提供了用于生产短毛动物的方法，其中所述方法包括在动物中表达缩短的催乳素受体蛋白，所述缩短的催乳素受体蛋白具有提供催乳功能但不包含来自与长毛皮毛相关的野生型蛋白的C-末端的氨基酸的氨基酸序列。

在具体实施方式中，本发明提供了基因工程牛，在其基因组内具有编码催乳素受体蛋白的催乳片段的聚核苷酸(如SEQ ID NO：3)但缺乏编码可导致长毛皮毛的氨基酸或至少缺少部分可导致长毛皮毛的氨基酸的核苷酸(如SEQ ID NO：6)。本发明还提供了基因工程牛，其中催乳素受体基因的一个或两个拷贝突变或缩短，使得牛表达缩短的家牛(B.Taurus)催乳素受体蛋白并显示出短毛皮毛表型。

有利的是，动物中动物影响皮毛长度，由此影响热应激的SLICK基因的识别，使得可以将所述特征改造至温带品种中，从而提高在较热气候的牛的产量。根据本发明，可以通过在热应激期间增加胚胎存活率和产生更多的牛奶来实现奶牛的多产。将光滑的毛发导入温带牛科品种中，使得他们在比以前可能更大热应激的条件下成功地增产。

附图说明

专利或申请文件中包含至少一张彩色图。具有彩色附图的专利或专利申请公开的副本在请求和支付必要的费用后由官方提供。

图1示出导致牛的催乳素受体(PRLR)蛋白缩短的突变。从野生型序列中删除C(在SEQ ID NO：2的1382位置的胞嘧啶)引起丙氨酸461突变为缬氨酸，并将以下密码子转变为终止密码子从而产生461个氨基酸的催乳素受体。所述突变表示为A461VfsX1，即，丙氨酸(A)是第一个改变的氨基酸，在位置461，由缬氨酸(V)代替，并且移位框的长度为1，包括终止密码子(X)。

序列简要说明

SEQ ID NO：1是家牛(Bos taurus)催乳素受体的全长mRNA序列。

SEQ ID NO：2是编码全长/野生型家牛催乳素受体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是编码保留催乳活性和产生光滑表型的家牛催乳素受体蛋白的最小390氨基酸部分的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是编码突变的/缩短的家牛催乳素受体蛋白的核苷酸序列的实施例。具体地，是对应于A461VfsX1突变体的牛催乳素受体的mRNA突变体的蛋白质编码部分的序列。

SEQ ID NO：5是编码缩短的家牛催乳素受体蛋白的核苷酸序列的实施例。具体地，是编码缩短的包含氨基酸1-461的家牛催乳素受体的mRNA的序列。

SEQ ID NO：6提供了在编码最小突变的/缩短的家牛催乳素受体蛋白的核苷酸中不存在(不在框内)的聚核苷酸序列。所述序列或其片段可以在编码突变的/缩短的家牛催乳素受体蛋白的核苷酸中出现；然而所述序列或其片段未出现在具有核苷酸编码突变的/缩短的家牛催乳素受体蛋白的蛋白质读取框中，或其编码足够少的氨基酸，使光滑皮毛表型出现。

SEQ ID NO：7是全长家牛催乳素受体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是家牛催乳素受体蛋白用于产奶所需的390氨基酸最小部分的序列，其可以提供光滑表型。

SEQ ID NO：9是突变的/缩短的家牛催乳素受体蛋白的实施例的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是缩短的家牛催乳素受体蛋白的实施例的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是未出现在缩短的家牛催乳素受体蛋白中的家牛催乳素受体蛋白的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是未出现(未在框内)在缩短的家牛催乳素受体蛋白中的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13家牛催乳素受体突变体A461VfsX1的mRNA序列。

发明详述

本发明提供了用于产生短毛动物的材料和方法。在优选的实施方式中，这通过改变动物中的编码催乳素受体(PRLR)蛋白的核苷酸序列来实现，以产生缩短形式的蛋白质。有利地并且意外地，根据本发明产生的缩短的蛋白质保留了催乳的功能，但导致动物具有短毛皮毛。

因此，在一个实施方式中，例如，本发明提供了通过给予动物短毛(光滑)皮毛以提高动物的耐热性的材料和方法。在本文具体例示的优选的实施方式中，动物是牛科动物。

本文具体例示的是牛，其表达赋予牛产奶能力但也导致短毛表型的催乳素受体蛋白。在优选的实施方式中，催乳素受体蛋白包含581氨基酸野生型蛋白的390N-末端氨基酸。除了最小390氨基酸片段之外可以存在为只要与全长蛋白相比表达的蛋白被充分缩短从而获得短毛表型的氨基酸。优选地，全长581氨基酸蛋白的C-末端被缩短至少1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，或120或更多氨基酸。

在具体实施方式中，聚核苷酸包括编码SEQ ID NO：8所示的催乳素受体蛋白的390氨基酸部分，并且其中聚核苷酸不包含编码SEQ ID NO：11(氨基酸391-581)的核苷酸。可替代地，如果编码SEQ ID NO：11的核苷酸全部或部分存在，则其不在与SEQ ID NO：3相同的蛋白的可读框内，或部分存在，和在与SEQ ID NO：3相同的可读框内不编码足够数量的氨基酸以产生正常(非光滑或非短毛的)皮毛。

光滑皮毛的存在可以由本领域技术人员使用例如Olson等在“Evidence of a Major Gene Influencing Hair Length and Heat Tolerance in Bos Taurus Cattle,”J.Anim.Sci.(2003)81:80-90中提出的实验容易地确定，其全部内容以引证的方式并入本文。在优选的实施方式中，短毛皮毛的动物的毛发小于不表现出光滑毛发表型的动物(本文称为“正常”或“长毛”)毛发长度的50％，40％，30％，20％或甚至10％。

为了实现本发明的目的，术语“牛(cattle)”是指术语家牛(B.Taurus)，牦牛(B.mutus)和牛(Bos)类其他成员的动物。本发明用牛举例说明；然而本领域技术人员可以在能够受益于短毛皮毛的其它动物上实践本发明，以改善耐热性、美观性、过敏性和/或清洁性。优选地，动物是非人动物。所述其它动物包括但不限于其他牛科(特别是牛科动物)，猪，马，山羊，猫，小鼠，大鼠，狗，猿，黑猩猩和猩猩。如本领域技术人员将理解的，保持催乳功能所需的催乳素受体部分缩短的精确位置可以随着物种的不同而不同，如实现短毛皮毛所需的C-末端缩短的程度。然而，对于给定动物存在的催乳素受体蛋白的适当部分可以容易地由受益于本申请内容的技术人员确定。

根据本发明，已发现造成光滑表型的突变。突变是在家牛催乳素受体基因中的A461VfsX1突变。突变导致催乳素受体蛋白的羧基末端的120个氨基酸删除。

从催乳素受体蛋白C-末端删除的120个氨基酸基本上在所有哺乳动物中都是保守的。这些氨基酸对于牛奶的生产不是必需的，即缺失所述C-末端氨基酸的催乳素受体可以在牛奶生产过程中发挥其作用。

SEQ ID NO：2是编码全长家牛催乳素受体蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO：4和13是编码家牛催乳素受体蛋白的突变的/缩短的形式的核苷酸序列。所述特定的缩短的蛋白由携带A461VfsX1突变的突变体催乳素受体基因编码。携带这种突变的牛显示出光滑的表型。

因此，本发明提供了包含序列SEQ ID NO：3的聚核苷酸。所述序列SEQ ID NO：3编码缩短的家牛催乳素受体蛋白。其中所述聚核苷酸在与包含SEQ ID NO：3的聚核苷酸相同的蛋白阅读框内不包含核苷酸序列SEQ ID NO：6(或其足够大的部分以导致长毛皮毛)。为了实现本发明的目的，所述聚核苷酸称为“缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸”。

为了实现本发明的目的，如果两个聚核苷酸连接(融合)时，第一聚核苷酸在与第二聚核苷酸相同的蛋白阅读框内，融合的聚核苷酸编码包含由第一和第二聚核苷酸独立编码的多肽的蛋白质。因此，当两个聚核苷酸彼此连接而没有干扰核苷酸时，维持两个聚核苷酸的蛋白阅读框。如果插入在第一和第二聚核苷酸之间的核苷酸个数不是3的整数倍(例如1,2,4,5,7,8,9,11等)和/或在第一聚核苷酸的蛋白阅读框中出现终止密码子，则不能保持阅读框在两个聚核苷酸之间。

因此，在某些具体实施方式中，本发明的缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸包含序列SEQ ID NO：3、4或5，其与包含全部或部分SEQ ID NO：6的聚核苷酸连接，其中插入SEQ ID NO：3、4或5的聚核苷酸和SEQ ID NO：6的聚核苷酸之间的核苷酸数量不是3的整数倍和/或在两个聚核苷酸之间导入了具有SEQ ID NO：3、4或5序列的蛋白阅读框中的终止密码子。这样的聚核苷酸的序列的实例是包含SEQ ID NO：13的聚核苷酸，其是家牛催乳素受体蛋白A461VfsX1突变体的核苷酸序列并且包含在序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6部分序列之间的核苷酸。可选地，SEQ ID NO：6的全部或部分可以完全不存在，只存在序列的一部分，则不足以产生长毛皮毛。

因此，缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸可能包含SEQ ID NO：6的序列，或其片段；然而，在具有缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸序列的蛋白阅读框中SEQ ID NO：6的序列或其片段不能编码足够数量的氨基酸，以产生长毛。

本发明的一个缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸编码了缩短的家牛催乳素受体蛋白，其中缩短的蛋白包含SEQ ID NO：8序列，其中缩短的家牛催乳素受体蛋白不包含足以引起长毛皮毛的SEQ ID NO：11的序列或片段。

因此，根据本发明的有用的缩短的家牛催乳素受体蛋白的实例包括SEQ ID NO：7所示的全长催乳素受体蛋白的片段，其中缩短的蛋白包括SEQ ID NO：7的1-390到1-461氨基酸的氨基酸序列和不含有SEQ ID NO：11的序列或片段的SEQ ID NO：7片段。

表1提供了缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸和由上述聚核苷酸编码的缩短的家牛催乳素受体蛋白的某些实施例。表1中所描述的所有缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸序列都从SEQ ID NO：4或5的位置1开始，表1所描述的缩短的家牛催乳素受体蛋白的序列从SEQ ID NO：7的位置1开始。聚核苷酸的多个终止位置对应于SEQ ID NO：4或5，并且氨基酸的多个终止位置对应于SEQ ID NO：7。

表1

大于461个氨基酸的片段也在本发明的保护范围内，只要他们不大到足以产生非光滑表型。

本发明还提供了缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸和缩短的家牛催乳素受体蛋白的同系物。

为了实现本发明的目的，术语“同系物”指与参考序列具有至少70％到约90％(含)之间的百分比一致性的序列。百分比一致性的上述范围被认为包括并且以1％的间隔为70％至99％之间的任何分数百分比提供书面描述支持。例如，同源序列可以表现出与参考序列70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的百分比一致性。

通常，在整个参考序列上计算百分比一致性。在两个或更多个序列的情况中，术语“相同”或百分比“一致性”是指当通过对比窗口比较和排列最大对应性时，使用序列比较算法或通过手动排列和目视检查测量相同或具有相同的残基的指定百分比的两个或更多个序列或子序列。

本发明还提供了缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸和缩短的家牛催乳素受体蛋白的同系物，其与缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸和缩短的家牛催乳素受体蛋白具有至少70％至约99％(包括99％)的序列一致性。

缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸的同系物的某些实例包括具有与SEQ ID NO：3、4或5序列相比约百分之70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的序列一致性的聚核苷酸。缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸的同系物在同系物的阅读框内还不包括足以产生长皮毛的SEQ ID NO:6的序列或其片段。

缩短的家牛催乳素受体聚蛋白的同系物的某些实例包括具有与SEQ ID NO：8、9或10序列相比约百分之70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的序列一致性的蛋白。缩短的家牛催乳素受体蛋白同系物也不包含足以产生长毛皮毛SEQ ID NO：11的序列或其片段。

根据本发明有用的核酸序列包括例示性核苷酸序列的变体，其中变体编码与例示性聚核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，多个核酸序列编码任一给定的蛋白质。比如，密码子GCA,GCC,GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在由密码子指定的丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核苷酸变化称为沉默突变。本领域技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)可以被改变，但仍然能编码相同的氨基酸序列。所述具有沉默突变体的变体序列在本发明要求保护的范围内，其编码本发明的多肽。

可以使用本领域已知的多种序列比较算法和程序中的任一种来鉴定核酸序列同系物。所述算法和程序包括，但不限于，TBLASTN,BLASTP,FASTA,TFASTA,和CLUSTALW(Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-2448；Altschu等,1990,J.Mol.Biol.215(3):403-410；Thompson等,1994,Nucleic Acids Res.22(2):4673-4680；Higgins等,1996,Methods Enzymol.266:383-402；Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215(3):403-410；Altschul等,1993,Nature Genetics 3:266-272)。通常使用由供应商提供的默认参数或使用在上述参考文献中提出的参数进行序列比较，上述文献以引证的方式全部并入本文。

术语“约”在本申请中用于描述本发明的一些定量方面，比如诱导剂的浓度或核苷酸序列之间的百分比一致性。应当理解的是，本发明的定量方面操作不需要绝对的准确度。当术语“约”用于描述本发明的定量方面时，相关方面可以变化±10％。

如本文所用的“互补”聚核苷酸序列通常指在双链核酸分子(DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA)中特定嘌呤和特定嘧啶之间的氢键产生的序列。主要特异性配对是鸟嘌呤配对胞嘧啶和腺嘌呤配对胸腺嘧啶或尿嘧啶。“互补”聚核苷酸序列也可以称为“反义”聚核苷酸序列或“反义序列”。在本发明的各个方面，序列与参考序列“完全互补”指在其碱基配对中不含错配的序列。

如本文所使用的，“载体”是指用于将核苷酸构建体，如DNA构建体，导入宿主细胞中的DNA分子，如质粒、粘粒或细菌噬菌体。克隆载体通常含有一个或少数的限制性内切核酸酶识别位点，在这些位点外源DNA序列可以确定的方式插入，而不丧失载体的基本生物学功能，以及适用于用克隆载体转化细胞的鉴定和选择的标记基因。标记基因通常包括提供抗生素抗性的基因。可用于实践本发明的选择抗生素的非限制性实施例包括遗传霉素(Geniticin，G-418)、霉酚酸和吉欧霉素。适用于本发明的抗生素的其他实施例是本领域技术人员已知的，并且在本发明的保护范围内。

本发明还提供了用于与靶序列或从靶序列产生的扩增子杂交的检测探针(如，家牛催乳素受体聚核苷酸的片段)。所述检测探针包含家牛催乳素受体聚核苷酸(如，表1中描述的聚核苷酸，SEQ ID NO：3，4，和5)中的至少8，9，10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100或更多核苷酸的连续的/连贯的范围。

标记的探针或用放射性化合物标记的或其他类型标记物，如1)放射性标记、2)酶标记、3)化学发光标记、4)荧光标记、或5)磁性标记，标记的引物。可选地，非标记的核苷酸序列可以直接用作探针或引物；然而序列通常用放射性元素(³²P,³⁵S,³H,¹²⁵I)标记或用如生物素、乙酰氨基芴、地高辛、5-溴-脱氧尿苷或荧光素的分子标记，以提供可用于许多应用的探针。

本文公开的家牛催乳素受体聚核苷酸可用于在细胞或动物(如，牛和其他牛科动物)中表达缩短的家牛催乳素受体蛋白。这可以通过用包含家牛催乳素受体聚核苷酸的DNA构建体(转基因的基因构建体)转化目标细胞，并产生表达缩短的家牛催乳素受体蛋白的转化细胞来实现。

在其他实施方式中，本发明涉及包含编码缩短的催乳素受体蛋白的缩短的家牛催乳素受体聚核苷酸的转染载体、表达载体、宿主细胞和转基因动物。

在其他实施方式中，本发明涉及分离的缩短的家牛催乳素受体蛋白，以及包含所述分离的缩短的家牛催乳素受体蛋白的融合的多肽。

本文公开的各种方法包括将核苷酸(DNA)构建体导入细胞。术语“导入”在本文中用于指以构建体进入细胞内部的方式向细胞提供核苷酸构建体。这些方法不依赖于用于将核苷酸构建体导入到细胞的特定方法，只是核苷酸构建体进入细胞内部。本领域技术人员已知的用于将核苷酸导入到细胞的方法包括，但不限于，稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒-介导的方法。

本发明还提供了使用缩短的催乳素受体聚核苷酸来遗传性修饰不天然表现出光滑表型的动物以产生呈现光滑表型的动物的方法。为了使任一品种增加光滑表型，任何可以导致缩短的催乳素受体蛋白表达的突变都可以使用。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了产生具有短毛表型的非人类哺乳动物的方法，其中哺乳动物表达缩短的催乳素受体蛋白，其包含SEQ ID NO：7所示序列的至少1-390氨基酸，并且不包含SEQ ID NO：7所示序列的所有氨基酸391-581。本发明的方法包括：

a)获得能够发育成非人哺乳动物的细胞，和

b)将编码缩短的催乳素受体蛋白的聚核苷酸导入到细胞或控制细胞的基因组DNA，使得基因组DNA包括编码缩短的催乳素受体蛋白的聚核苷酸，和

c)从所述细胞繁殖非人类哺乳动物细胞。

编码缩短的催乳素受体蛋白的聚核苷酸可能包括SEQ ID NO：3的序列或与SEQ ID NO：3序列具有至少90％序列一致性的同系物，并且聚核苷酸不包含SEQ ID NO：6的全部核苷酸序列或在SEQ ID NO：3聚核苷酸的蛋白阅读框中不包含SEQ ID NO：6的全部核苷酸序列。可用于本发明方法的聚核苷酸的实例是包含SEQ ID NO：3，4，5或13的序列的聚核苷酸。为非人类哺乳动物提供短毛的缩短的催乳素受体蛋白的一个实例是具有SEQ ID NO：8序列的蛋白。

在一个实施方式中，能够发育成非人类哺乳动物的细胞是全能细胞。全能细胞具有发育成完整的生物体或分化成其任一种细胞或组织的能力。可用于本发明的方法的全能细胞的非限制性实例是干细胞、胚胎细胞、受精卵和合子。可用于本发明的全能细胞的其它实例对本领域技术来说是已知的，并且这样的实施例在本发明的范围内。

在某些实施方式中，非人类哺乳动物是牛科动物、牛、猪、马、山羊、猫、小鼠、绵羊、大鼠、狗、猿、黑猩猩或猩猩。根据本发明使用的催乳素受体蛋白的非限制性实例的UniProt蛋白质数据库登录号为Q28172，Q08501，P14787，O46561，P05710，Q58DZ7，Q6JTA8，C7T4Z0，Q3HNA7，D0VFV2，C7T4V8，C7T4W1，C7T4W4，C7T4X8，Q2PBP0，B3GDH0，C7T4X9，E7BKJ5，G3UVW6，Q58DZ7，E7CHC7，E5KXH8，D3ZV73，D0VFV3，F2XX66，I7FI71，E9MW50，Q28172，F1N4H8，Q2PBN9，C7F8W7，G1DE70，S5TFK4，Q28235，O46561，Q08501，Q99JZ1，U6CXL9，P05710，F1M137，P14787，F7HIV1，Q865V4，Q6JTA8，D9IWB8，Q9XS92，和K7GKV2。

基因工程动物可以通过本领域已知的用于产生基因工程动物，尤其是哺乳动物的方法产生。这种技术的非限制性实例包括产生表达缩短的家牛催乳素受体蛋白的转基因牛，用缩短的蛋白替换牛类中的野生型蛋白的同源重组，在牛类基因组中导致缩短的蛋白产生的碱基对缺失，或任何其他基因组编辑的方法。其他实例包括涉及重组逆转录病毒、原核注射、精子介导的DNA转移、生殖细胞移植和细胞核移植克隆的方法。根据本发明的方法生产基因改造的哺乳动物的其它方法是本领域技术人员已知的，并且这些方法在本发明的保护范围内。

本文使用的术语“基因工程牛”包括转基因牛和在催乳素受体基因的一个或两个拷贝中携带突变的牛，其中突变导致缩短的催乳素受体蛋白的表达。

转基因牛是指通过将一个或多个拷贝的缩短的催乳素受体多核苷酸整合到牛基因组中表达缩短的催乳素受体蛋白的牛。在催乳素受体基因的一个拷贝中携带突变或缩短的牛被称为纯合子牛，其中突变或缩短导致缩短的催乳素受体蛋白的表达；而在催乳素受体基因的两个拷贝中都携带突变或缩短的牛被称为杂合子牛，其中突变导致缩短的催乳素受体蛋白的表达。

表达缩短的催乳素受体蛋白的转基因的纯合子牛或杂合子牛可以表现出光滑的表型。

在一个实施方式中，转录激活因子类效应物核酸酶-介导的(TALEN-介导的)同源重组用于产生表现出光滑表型的纯合子牛或杂合子牛。产生TALEN-介导的基因工程生物体的实例由Zu等(2013),TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish,Nature Methods,10:329–331；Katsuyama等(2013),An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila,Nucleic Acids Research,Vol.41,No.17,e163；和Liu等(2014),TALEN-Mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus Monkeys,Cell Stem Cell,Vol.14,Issue 3,pp.323–328提供。

成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关基因(CAS)系统(CRISPR/CAS系统)也可以用于产生表现出光滑表型的纯合子牛或杂合子牛。使用CRISPR/CAS系统产生基因工程的生物体，特别是哺乳动物的实例由Cong等(2013),Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems,Science,Vol.339no.6121pp.819-823和美国专利8,795,965提供。

产生纯合子牛科动物或杂合子牛科动物和其他动物的其他技术是本领域技术人员公知的，并且这样的实施方式在本发明的保护范围内。

用于产生转基因动物的方法是本领域技术人员公知的。可以将转基因基因构建体导入牛的生殖细胞中以制备转基因牛。例如，可以通过标准转基因技术将一个或几个拷贝的构建体整合到哺乳动物胚胎的基因组中。

转基因牛可以通过将编码缩短的家牛催乳素受体蛋白的转基因导入牛的生殖细胞中来产生。在各种发育阶段的胚胎靶细胞可以用于导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段使用不同的方法。选择所使用的任何动物的特定细胞系以具有大致良好的健康，良好的胚胎产量，胚胎中良好的原核可见度和良好的繁殖适应性。

可以通过本领域已知的任何方法，例如显微注射，电穿孔或脂质转染，将转基因导入胚胎。例如但不限于，缩短的催乳素受体蛋白转基因可以通过将构建体显微注射到受精牛卵的原核中而导入动物中，使得一个或多个拷贝的构建体保留在发育中的牛的细胞中。在将转基因构建体导入受精卵中之后，可以将卵在体外培养不同的时间，或重新植入代孕宿主，或两者。包括体外培养至成熟。常见的方法是在体外培养胚胎约1-7天，并将其重新植入代孕宿主。

可以通过设计用于鉴定缩短的催乳素受体聚核苷酸的存在的各种方法测试转基因操作的胚胎的后代中构建体的存在。如果外源克隆构建体的一个或多个拷贝保持稳定整合到所述转基因胚胎的基因组中，则可以建立携带转基因添加构建体的永久转基因系。

可以在转基因改变的动物的后代出生后测定构建体是否整合到了后代的基因组中。优选地，该测定通过将对应于编码期望的缩短的催乳素受体蛋白的DNA序列的探针杂交到来自子代的染色体材料上来实现。发现在后代基因组中含有构建体的至少一个拷贝的那些后代生长至成熟。

本文使用的术语合子是指能够发育成完整生物体的二倍体细胞。通常，合子由含有通过来自一个或多个配子的两个单倍体核的天然或人工融合形成的细胞核的卵组成。因此，配子核必须是天然相容的，即导致活的合子，能够经历分化并发育成功能生物体。通常，优选整倍体合子。如果获得非整倍体合子，则相对于产生配子的生物体的整倍体数目，染色体的数目改变不应多于一个。

添加到合子中的转基因构建体的拷贝数取决于添加的外源遗传物质的总量，并且是能够发生基因转化的量。理论上只需要一个拷贝；然而，通常使用许多拷贝，例如，产生转基因构建体的1,000到20,000个拷贝以确保一个拷贝是功能性的。通常具有每个插入的外源DNA序列的多于一个的功能拷贝以增强外源DNA序列的表型表达是有优势的。

可以使用允许将外源遗传物质添加到核酸遗传物质中的任何技术，只要其不破坏细胞、核膜或其他存在的细胞结构或遗传结构即可。外源遗传物质优选通过显微注射插入核酸遗传物质中。细胞和细胞结构的显微注射是本领域已知和使用的。

再植入通过使用标准方法完成。通常，将代孕宿主麻醉，并将胚胎插入输卵管中。

可以通过任何合适的方法筛选代孕宿主的转基因后代的转基因的存在和/或表达。筛选可以通过Southern杂交或Northern杂交分析，使用与至少一部分转基因互补的探针完成。通常，从组织制备DNA并通过Southern杂交或PCR对转基因进行分析。可选地，测试被认为在最高水平表达转基因的组织或细胞中缩短的家牛催乳素受体蛋白的存在和/或表达，尽管任何组织或细胞类型都可用于所述分析。

转基因动物的子代可以通过将转基因动物与合适的配偶交配或通过从转基因动物获得的卵和/或精子的体外受精来获得。当进行与配偶的交配时，配偶可以是或不是转基因的和/或基因敲除的。当配偶是转基因时，其可以含有相同或不同的转基因，或两者都有。可选地，配偶可以是亲本系的。当使用体外受精时，受精胚可以植入代孕宿主或在体外培养，或两者。使用这些方法，可以使用合适的方法评估后代的转基因的存在。

根据本说明书生产的转基因动物将包括外源遗传物质。如上所述，在某些实施方式中，外源遗传物质将是导致缩短的催乳素受体蛋白产生的DNA序列。此外，在这样的实施方式中，序列将连接到转录控制元件，例如启动子，其优选允许转基因产物在特定类型的细胞中表达，其产生以组织特异性方式表达缩短的催乳素受体蛋白的转基因动物。

胚细胞提供了用于将转基因导入牛(和其他动物)的第二种类型的靶细胞。当发育的转基因牛，牛胚胎，体外培养到囊胚阶段，它可以靶向逆转录病毒感染。卵裂球的有效感染通过酶处理以除去透明带获得(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于导入转基因的病毒载体系统通常是携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒。通过在病毒生产细胞的单层上培养卵裂球容易且有效地获得转染。

可选地，感染可以在稍后阶段进行。病毒或病毒产生细胞可以注射到卵裂球中。大多数所发现的转基因都是嵌合体，因为整合仅发生在形成转基因牛的细胞的子集中。此外，所发现的转基因可以在基因组中的不同位置包含转基因的各种逆转录病毒插入，所述转基因通常在后代中分离。此外，还可能通过妊娠中期胚胎的子宫内逆转录病毒感染将转基因导入生殖细胞系。

用于转基因导入的第三种类型的靶细胞是胚胎干细胞(ES)。胚胎干细胞来自体外培养并与胚胎融合的预植入胚胎。可以通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导将转基因有效地导入胚胎干细胞。这样转化的胚胎干细胞之后可以与来自牛的囊胚组合。然后，胚胎干细胞移植于胚胎中并有助于所得嵌合体动物的生殖细胞系。

还提供了转基因牛科动物和其他动物，其中转基因动物的特征在于光滑表型。基因的改变可以包括导致缩短的催乳素受体蛋白产生的缺失、突变或缩短；或导入外源基因，例如具有缩短的催乳素受体聚核苷酸的基因；或前述的组合。

本发明的另一个实施方式提供了鉴定特定动物是否携带编码缩短的催乳素受体蛋白的突变体催乳素受体基因的方法。鉴定催乳素受体突变的存在和突变体催乳素受体基因的拷贝数的测试还可以改进在生产基因工程牛(和其他动物)的方法中转移的胚胎的选择。

可用于鉴定催乳素受体缩短突变体的非限制性分子生物学技术的实例包括：

(A)DNA或RNA的突变特异性PCR。可以从待测试的动物中分离DNA或RNA(转化为cDNA)。可以设计突变或正常等位基因的特异性的引物，使得PCR指示突变是否存在。基于本文提供的核苷酸序列，本领域技术人员可以从DNA或RNA设计用于突变特异性PCR的合适的引物，并且这些实施方式在本发明的范围内。

(B)限制位点。突变A461VfsX1在基因组DNA-ACATGT中产生了新的回文序列。该回文序列不存在于天然/非突变基因组中。用扩增跨越突变位点的基因组DNA区域的引物产生的PCR产物可以用对该序列特异的限制酶(例如限制性内切核酸酶PciI)切割。能够由作用于回文序列TGTACA的内切核酸酶切割指示突变的存在。

(C)直接测序。突变的区域可以从mRNA(其可以任选地转化为cDNA)或基因组DNA进行PCR扩增。可以对PCR产物进行测序以鉴定催乳素受体突变基因的存在。基于本文提供的核苷酸序列，本领域技术人员可以设计合适的引物对DNA或RNA进行测序，并且这些实施方式在本发明的范围内。

(D)可以设计单链构象多态性(SSCP)和异源双链分析测试以鉴定DNA中的点突变。

(E)使用对催乳素受体蛋白的羧基末端特异性的抗体的Western杂交。在对应于全长催乳素受体蛋白的Western杂交上缺失条带表明存在突变和缩短的催乳素受体蛋白的表达。

本发明还提供了可用于检测牛中突变体的抗体，所述突变体表达家牛催乳素受体蛋白。这些抗体针对位于全长催乳素受体蛋白的C-末端区域中的C-末端氨基区或表位。因此，本发明提供由SEQ ID NO：11的序列或其片段组成的多肽。这些多肽可用于产生用于检测牛中表达缩短的家牛催乳素受体蛋白的突变体的抗体。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开申请在其与本说明书的明确教导不矛盾的程度上以其全部内容，包括所有附图和表格通过引用的方式并入本文。

应当理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且启示本领域技术人员对其进行各种修改或改变，并且这些修改或改变包括在本申请和所附权利要求的精神和范围内。此外，本文所公开的任何发明或其实施方式的任何元件或限制可以与本文所公开的任何和/或所有其他元件或限制(单独地或以任何组合)或任何其他发明或实施方式组合，并且所有这样的组合在本发明的保护范围内而且不限于此。

序列表

<110> Ag遗传学股份有限公司

詹姆士•韦斯特

<120> 用于生产短毛的动物的材料和方法

<130> MWH.106X

<150> 62/054,169

<151> 2014-09-23

<160> 13

<170> PatentIn 版本3.5

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<211> 2389

<212> DNA

<213> 家牛

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