抗TNF化合物的制作方法

相关申请本申请根据35u.s.c.§119要求于2014年10月6日提交的美国临时申请序列号62/060,424的优先权，其内容整体并入本文。本发明涉及抗tnf核酸化合物以及其使用方法和其组合物。
背景技术：
：tnf-α(肿瘤坏死因子-α，tumornecrosisfactor-alpha)是由活化的巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞产生的多效细胞因子，其通常促进导致多种疾病的炎性应答。tnf-α从巨噬细胞、单核细胞和自然杀伤细胞释放并在炎性和免疫应答中发挥重要作用，包括在细菌及其他微生物感染期间以及在用炎性物质刺激之后向受损组织募集白细胞。当以过量存在时，已知tnf-α引起组织损伤，并且已涉及与炎性疾病和自身免疫病相关的病理状况。tnf-α通过序列和分子量不同的两种不同膜蛋白受体tnf-ri和tnf-rii来介导生物作用。据报道，tnf-ri在大多数(如果不是全部的话)人细胞类型中以低水平存在，并且人中tnf-ri基因的表达可以通过感染、干扰素和第二信使调节剂(例如佛波酯)而上调。两种tnf受体的细胞外部分也以可溶性形式存在，其由受体的膜结合形式通过在细胞表面处的蛋白水解切割而获得。可溶性tnf受体保留在溶液中结合tnf-α的能力。已经在来自健康个体的尿和血清中鉴定到可溶性tnf受体，并且已经显示其在一些慢性疾病中和在用诱导tnf-α的药剂接种之后升高。发明概述在一些方面，本发明是包含图7中所示结构的化合物或其盐。在一些实施方案中，所述化合物的长度为18个核苷酸。在另一些实施方案中，所述化合物与载体一起配制在组合物中。在另一些实施方案中，所述化合物是钠盐。在另一些实施方案中，所述化合物是图8中所示结构。在一些实施方案中，所述化合物还在一端包含分子物种(molecularspecies)。在另一些实施方案中，所述化合物还在两端包含分子物种。在又一个实施方案中，所述分子物种选自：间隔物(spacer)、脂质、固醇(sterol)、胆固醇、硬脂基、c16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸(deoxycholate)、油烯基石胆酸(oleyllitocholicacid)、油酰基胆烯酸(oleoylcholenicacid)、糖脂、磷脂、鞘脂、例如类固醇(steroid)的类异戊二烯(isoprenoid)、例如维生素e的维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉(texaphyrine)、德卟啉(texaphyrine)、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红(texas-red)、地高辛配基(digoxygenin)、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(cyaninedye)(例如，cy3或cy576)、hoechst33258染料、补骨脂素(psoralen)和布洛芬。在另一个实施方案中，所述分子物种选自：亲脂性部分(lipophilicmoiety)、叶酸基团、类固醇基团、碳水化合物基团、维生素a基团、维生素e基团或维生素k基团。在另一个实施方案中，所述分子物种通过选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和酰胺连接(linkage)的连接与所述化合物直接连接。在一些实施方案中，所述分子物种通过接头与所述化合物间接连接。在另一些实施方案中，所述接头是选自以下的非核苷酸接头：无碱基残基(dspacer)；低聚乙二醇(oligoethyleneglycol)，例如三乙二醇(间隔物9)或六乙二醇(间隔物18)；以及烷二醇(alkane-diol)，例如丁二醇。本发明的另一个方面是包含mumgmgmgmamgt*a*g*a*t*g*mamgmgmumamc(seqidno.16)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为18个核苷酸，其中m是2’o甲基，并且其中*是硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述寡核苷酸与载体一起配制在组合物中。在另一些实施方案中，所述载体是基于脂质的载体。在另一个实施方案中，所述载体是纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸还在3’或5’端包含分子物种。在一些实施方案中，所述寡核苷酸还在3’和5’两端包含分子物种。在另一些实施方案中，所述分子物种选自：间隔物、脂质、固醇、胆固醇、硬脂基、c16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、例如类固醇的类异戊二烯、例如维生素e的维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉、德卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、地高辛配基、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，cy3或cy576)、hoechst33258染料、补骨脂素和布洛芬。在一些实施方案中，所述分子物种选自：亲脂性部分、叶酸基团、类固醇基团、碳水化合物基团、维生素a基团、维生素e基团或维生素k基团。在另一个实施方案中，所述分子物种通过选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和酰胺连接的连接与所述化合物直接连接。在另一个实施方案中，所述分子物种通过接头与所述化合物间接连接。在一些实施方案中，所述接头是选自以下的非核苷酸接头：无碱基残基(dspacer)；低聚乙二醇，例如三乙二醇(间隔物9)或六乙二醇(间隔物18)；以及烷二醇，例如丁二醇。在另一些方面，本发明是包含5′tgggagtagatgaggtac3’(seqidno.4)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为18至19个核苷酸，其中所述寡核苷酸5’端的4至6个核苷酸和3’端的4至6个核苷酸包含2’o甲基，并且其中4至10个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述寡核苷酸5’端的6个核苷酸和3’端的6个核苷酸包含2’o甲基。在另一些实施方案中，6个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰。在另一个实施方案中，7个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰。在又一个实施方案中，8个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰。在另一些实施方案中，经硫代磷酸酯修饰的核苷酸位于寡核苷酸的中心区域。在另一个实施方案中，与从寡核苷酸5’端的第七、第八、第九、第十、第十一和第十二个核苷酸缔合的核苷酸间连接(internucleotidelinkage)是经硫代磷酸酯修饰的。在另一个实施方案中，每个核苷酸具有2’o甲基修饰或硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方案中，仅一个核苷酸具有2’o甲基修饰和硫代磷酸酯核苷酸间连接二者。在另一些实施方案中，仅一个核苷酸具有2’-修饰的核苷酸。在一些实施方案中，2’-修饰选自：2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、2’-o-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-o-dmaeoe)和2’-o--n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)。本发明的一个方面是稳定的自组装纳米结构，其包含含有tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)的长度为18至19个核苷酸的反义寡核苷酸，其中3’或5’端的疏水性基团在水或其他合适的溶剂中自缔合(self-associate)以形成纳米结构的核心。当寡核苷酸以高于5μm的浓度存在于不含dna酶和rna酶的水或其他合适溶剂中时，通常形成自组装纳米结构。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度为18个核苷酸。在另一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有磷酸二酯核苷酸间连接。在另一个实施方案中，不是所有的核苷酸间连接都是磷酸二酯。本发明的另一方面是稳定的自组装纳米结构，其包含含有tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)的长度为18至19个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与核心缔合。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度为18个核苷酸。在另一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有磷酸二酯核苷酸间连接。在另一个实施方案中，不是所有的核苷酸间连接都是磷酸二酯。在另一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方案中，不是所有的核苷酸间连接都是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有2’o甲基修饰。在另一个实施方案中，不是所有的核苷酸都包含2’o甲基修饰。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸具有17个核苷酸间连接，并且其中6个中心核苷酸间连接是硫代磷酸酯。在另一些实施方案中，所述寡核苷酸5’端的前6个核苷酸间连接是磷酸二酯核苷酸间连接。在又一个实施方案中，所述寡核苷酸5’端的前6个核苷酸是2’o甲基修饰的核苷酸。在另一些实施方案中，所述寡核苷酸3’端的最后5个核苷酸是2’o甲基修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸选自t-g-g-g-a-g-t-a-g-a-t-g-a-g-g-t-a-c(seqidno.4)、mumgmgmgmamgmumamgmamumgmamgmgmumamc(seqidno.10，oligo3742)、t*g*g*g*a*g*t*a*g*a*t*g*a*g*g*t*a*c(seqidno.9，oligo3500)、mumgmgmgmamgt*a*g*a*t*g*mamgmgmumamc(seqidno.16，oligo3534)和mu*mg*mg*mg*ma*mg*t*a*g*a*t*g*ma*mg*mg*mu*ma*mc(seqidno.18，oligo3509)，其中-是指磷酸二酯键，*是指硫代磷酸酯键，并且m是指o甲基。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸与核心的外部连接。在一些实施方案中，所述纳米结构包含2至1,000个拷贝的反义寡核苷酸。在另一些实施方案中，所述纳米结构包含至少一种在结构上与所述反义寡核苷酸不同的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸使其5’端暴露于纳米结构的外表面。在另一些实施方案中，所述反义寡核苷酸使其3’端暴露于纳米结构的外表面。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸侧向(laterally)位于纳米结构的表面上。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸通过接头与核心间接连接。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸通过多于一个接头与核心间接连接。在一些实施方案中，所述核心是实心或空心的核心。在另一些实施方案中，所述核心是惰性的、顺磁性的或超顺磁性的。在另一个实施方案中，所述核心是实心核心。在另一些实施方案中，所述实心核心由以下构成：包括金和银的贵金属、包括铁和钴的过渡金属、包括二氧化硅的金属氧化物、聚合物或其组合。在另一些实施方案中，所述核心是聚合物核心，并且其中所述聚合物核心由以下构成：两亲性嵌段共聚物；疏水性聚合物，包括聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lacticco-glycolicacid))、聚(乙醇酸)、聚(己内酯)；以及其他生物相容性聚合物。在又一个实施方案中，所述核心是脂质体核心。本发明的另一方面是组合物，其包含先前讨论实施方案的化合物、寡核苷酸或纳米结构，所述组合物还包含与纳米结构缔合的用于治疗tnf病症的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂与寡核苷酸连接。本文中所述的组合物和核酸各自可以在多种载体中配制。在一些实施方案中，在表面用载体中配制本发明的化合物。在一些实施方案中，表面用制剂是膏剂。在另一些实施方案中，表面用制剂是凝胶剂。本发明的另一方面是用于治疗tnf病症的方法，其包括向患有tnf病症的对象施用治疗tnf病症有效量的组合物，所述组合物包含前述方面的化合物、寡核苷酸或纳米结构。在另一个实施方案中，所述tnf病症选自：自身免疫病、感染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease)、恶性肿瘤(malignancy)、肺病、肠病、心脏病、脓毒症、脊柱关节病(spondyloarthropathy)、代谢病(metabolicdisease)、贫血、疼痛、肝病、皮肤病、指甲病(naildisorder)、类风湿性关节炎、银屑病、与银屑病关节炎组合的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病(crohn’sdisease)、血管炎、白塞病(behcet’sdisease)、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisorder，copd)、特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，ipf)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩病相关病症、幼年型类风湿性关节炎(juvenilerheumatoidarthritis，jra)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块型银屑病(chronicplaquepsoriasis)。在一些实施方案中，所述自身免疫病选自：类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、变态反应、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾炎综合征。在另一方面，本发明是用于降低体内tnf水平的方法，其包括向对象施用降低体内tnf水平有效量的组合物，所述组合物包含前述实施方案的化合物、寡核苷酸或纳米结构。本发明的每个限定可涵盖本发明的多个实施方案。因此，预期本发明涉及任意一种要素或要素组合的每个限定都可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用方面不限于以下说明中所述或附图中所示结构细节和组件布置。本发明能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。附图简述附图不旨在按比例绘制。在附图中，不同附图中所示的每个相同或几乎相同的组件由相同的附图标记表示。为清楚起见，可以不在每个附图中标出每个组件。在附图中：图1是示出了相对于oligo3495(乱序对照(scrambledcontrol))归一化的几种寡核苷酸(包括oligo3482、3483、3484、3485、3486、3487和3488)在原代人角质形成细胞中对tnf表达的抑制活性的条形图。图2是示出了几种寡核苷酸(包括oligo3485、3472、3508、3500、3496、3526、3607、3534、3514、3509、3516和3495)在原代人角质形成细胞中对tnf表达的抑制活性的条形图。图3是示出了不同化学物质对几种寡核苷酸(包括oligo3660、3743、3661、3657、3669和3652)与其各自对照相比的在原代人角质形成细胞中的抑制活性的作用的条形图。将寡核苷酸配制成球形核酸(sphericalnucleicacid，sna)。图4a至4b示出了经刺激的人角质形成细胞中sna对tnf的百分比基因敲减。在图4a中，图示了oligo3657与其对照oligo3661之间的百分比tnf-αmrna表达。图4b示出了化合物的半最大抑制浓度(ic50)，分别为1.8nm和＞100nm。图5a至5b示出了额外的硫代磷酸酯修饰对oligo3657修饰的sna的作用。在图5a中，图示了具有提高硫代磷酸酯含量的寡核苷酸的百分比相对mrna表达。图5b示出了筛选的每种寡核苷酸的半最大有效浓度(ec50)的表格。图6a至6b示出了空心sna对tnf表达的作用。在图6a中，示出了相对于未经处理归一化的tnf表达，而图6b示出了化合物的ic50值。图7是tnf反义寡核苷酸的游离酸形式的结构。图8是tnf反义寡核苷酸的盐形式的结构。图9示出了经刺激的人角质形成细胞中sna对tnf的百分比基因敲减。图示了oligo6081与其对照oligo6093之间的百分比tnfmrna表达。所示出的数据是相对于仅用tnf刺激的细胞(无寡核苷酸，设定为1.0)的tnfmrna基因表达。图10是示出了不同六(乙二醇)间隔物长度对经刺激的原代人角质形成细胞中tnfmrna表达的抑制活性的作用的条形图。示出了相对于其各自对照oligo6083、6093、6094和6095(设定为100)的用oligo6080、6081、6082和6092处理的细胞的百分比tnfmrna表达。图11是显示l-sna在银屑病离体外植体中敲减tnf的条形图。图12a至12d示出了tnf反义寡核苷酸的s-sna(自组装的sna)和l-sna(脂质体sna)形式在含有炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)的小鼠中的降低的临床和大体病理学评分。在图12a中，示出了载剂、tnbs、不同给药量的s-sna形式的oligo227901的疾病临床评分。在图12b中，示出了载剂、tnbs、不同给药量的l-sna形式的oligo227901的疾病临床评分。在图12c中，示出了载剂、tnbs、不同给药量的s-sna形式的oligo227901的疾病大体病理学评分。在图12d中，示出了载剂、tnbs、不同给药量的l-sna形式的oligo227901的疾病大体病理学评分。*表示使用单因素anova随后进行事后tukey检验相对于载剂组p＜0.05。图13示出了oligo6307自组装sna的cryo-tem。图14a至14b示出了oligo6307自组装sna的cryo-tem的示意图。示出了单独sna(图14a)和sna集合(图14b)的示意图。发明详述本发明在一些方面涉及用于降低tnfα的组合物和使用这些组合物来治疗tnf病症的方法。根据本发明的一些方面，已鉴定到高度有效的tnfα抑制剂。tnfα抑制剂是基于核酸的反义组合物。术语“tnf-α”是指作为17kd的分泌形式和26kd的膜缔合形式存在的细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的17kd分子的三聚体构成。本文中使用的“tnfα抑制剂”是指干扰tnfα活性的基于核酸的药剂。特别地，本发明的tnfα反义抑制剂或tnfα反义寡核苷酸降低tnfα基因的表达。本发明的tnf抑制剂是反义核酸。反义核酸通常包括经修饰或未经修饰的rna、dna或混合的聚合物核酸，并且主要通过与匹配序列特异性结合导致调节肽合成来发挥作用。反义核酸通过watsoncrick碱基配对与靶rna结合，并通过空间阻挡或通过激活rnaaseh酶阻止所结合序列的核糖体翻译来阻断基因表达。反义分子还可以通过干扰rna加工或从细胞核向细胞质中的转运来改变蛋白质合成。本文中使用的术语“反义核酸”或“反义寡核苷酸”描述了这样的核酸：其在生理条件下与包含特定基因(在此情况下为tnfα)的dna或与该基因的mrna转录物杂交，并且由此抑制该基因的转录和/或该mrna的翻译。反义分子被设计成在与靶基因或转录物杂交之后干扰靶基因的转录或翻译。本领域技术人员将认识到，反义寡核苷酸的确切长度及其与其靶标的互补程度将取决于所选择的具体靶标，包括靶标的序列和该序列所包含的具体碱基。“抑制基因表达”是指来自靶基因(例如tnfα基因)的蛋白质和/或mrna产物的水平的不存在或可观察到的降低。“特异性”是指抑制靶基因而对细胞的其他基因没有明显作用的能力。抑制的结果可通过检测细胞或生物体的外部性质或者通过生物化学技术来确定，所述生物化学技术例如rna溶液杂交、核酸酶保护、northern杂交、逆转录、用微阵列进行基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、western印迹、放射免疫测定(radioimmunoassay，ria)、其他免疫测定和荧光激活细胞分析(fluorescenceactivatedcellanalysis，facs)。本发明的反义寡核苷酸抑制tnfα表达。根据测定，与未根据本发明进行处理的细胞相比，基因表达量的量化允许确定大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的抑制程度。例如，抑制效率可以通过评估细胞中基因产物的量来确定。在一些情况下，tnfα抑制剂是具有以下结构的化合物或其生物等效物(包括盐和前药)：本文中使用的术语生物等效化合物(包括可药用盐和前药)是指这样的反义寡核苷酸：其与目的反义寡核苷酸具有相同的一级结构，但包括可被切割或修饰以与目的反义寡核苷酸具有相同类型的生物学效应的盐形式或结构。这旨在涵盖任何可药用盐、酯、或这样的酯的盐、或在施用于动物(包括人)之后能够提供(直接或间接地)其生物活性代谢物或残余物的任何其他化合物。“可药用盐”是本发明的核酸的生理上可接受和可药用的盐：即，保留目的化合物的期望生物活性并且不赋予其不期望的毒理学效应的盐。可药用盐包括但不限于：(a)与阳离子例如钠、钾、铵、镁、钙、例如精胺和亚精胺的多胺等形成的盐；(b)与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；以及(d)由元素阴离子(例如氯离子、溴离子和碘离子)形成的盐。本发明的反义寡核苷酸的盐的实例是例如为具有以下结构的钠盐的化合物：本发明的化合物还可制备成以“前药”形式递送。“前药”是以非活性形式制备的在体内或其细胞内通过内源性酶或其他化学物质和/或条件的作用而转化为活性形式(即，药物)的治疗剂。本发明的反义寡核苷酸是tnfα反义寡核苷酸。反义tnfα寡核苷酸是指具有以下核苷酸碱基序列和亚基至亚基主链(subunit-to-subunitbackbone)的化合物，其允许反义寡核苷酸通常通过watson-crick碱基配对与tnfα靶序列杂交以在靶序列中形成rna：寡聚物异源双链体(heteroduplex)。反义寡核苷酸与其靶核酸tnfα的特异性杂交干扰核酸tnfα的正常功能。与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的这种调节通常被称为“反义的”。待干扰的dna功能包括复制和转录。待干扰的rna功能包括所有重要功能，例如rna向蛋白质翻译位点的转位、由rna翻译蛋白质、产生一个或更多个mrna种类的rna剪接、以及可以涉及rna或由rna促进的催化活性。这样的干扰靶核酸功能的总体效果是调节tnfα蛋白的表达。在本发明的上下文中，“调节”意指降低或抑制基因的表达。如果寡核苷酸在生理条件下与tnfα靶标杂交，则该反义寡核苷酸与靶多核苷酸“特异性杂交”，其中热解链点(tm)基本上大于37℃、优选至少45℃并且通常为50℃至80℃或更高。这样的杂交优选地对应于选择为与特定序列在确定的离子强度和ph下的tm相比低约10℃并且优选低约50℃的严格杂交条件。在给定的离子强度和ph下，tm是靶序列的50％与互补多核苷酸杂交时的温度。当两个单链多核苷酸之间的反平行结构中发生杂交时，多核苷酸被描述为彼此“互补”。如果在第一多核苷酸和第二多核苷酸的一条链之间发生杂交，则双链多核苷酸可与另一多核苷酸”互补”。根据普遍接受的碱基配对规则，互补性(一个多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)可根据预期彼此形成氢键的相对链中碱基的比例来量化。即使两条碱基序列不是100％互补，反义化合物也可以与靶转录物的靶区域互补，只要化合物与转录物之间形成的异源双链体结构具有期望的tm稳定性即可。鉴定靶向特定核酸的反义寡核苷酸可以是多步骤过程。该过程通常开始于鉴定其功能待被调节的核酸序列。这可以是例如其表达与特定tnfα病症或疾病状态相关的细胞基因(或由该基因转录的mrna)。靶向过程还包括确定该tnfα基因内用于发生反义相互作用使得将产生期望效果(例如，检测或调节蛋白质的表达)的位点。在本发明的上下文中，优选的基因内位点是包含seqidno.34的核苷酸序列2283-2300的区域，即gtacctcatctactccca(seqidno.35)。优选的反义寡核苷酸被设计为靶向人tnfα，例如，下文所示的seqidno.34的核苷酸序列。人tnf-αcdna序列已由nedwin，g.e.等(nucleicacidsres.1985，13，6361-6373)公开，并且公开于genbank登录号x02910。本文中所述的纳米结构可以是稳定的自组装纳米结构。例如，所述纳米结构可以是包含tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)的长度为18至19个核苷酸的反义寡核苷酸，其中3’或5’端的疏水性基团在水或其他合适的溶剂中自缔合以形成纳米结构的核心。本文中使用的疏水性基团可包括：胆固醇、胆固醇基或经修饰的胆固醇基残基、金刚烷(adamantine)、二氢睾酮(dihydrotesterone)、长链烷基、长链烯基、长链炔基、油烯基石胆酸、胆烯酸、油酰基胆烯酸、棕榈基、十七烷基、豆蔻基(myrisityl)、胆汁酸、胆酸或牛磺胆酸、脱氧胆酸、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、例如类固醇的类异戊二烯、例如维生素e的维生素、饱和或不饱和的脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉、德卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、地高辛配基、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，cy3或cy5)、hoechst33258染料、补骨脂素或布洛芬。反义寡核苷酸的长度通常为15至20个碱基，其通常足够长以在哺乳动物基因组中具有一个互补序列。另外，长度为至少12个核苷酸，通常长度为至少15个核苷酸的反义化合物与其靶mrna充分杂交。因此，本发明的反义寡核苷酸通常在8至100个核苷酸的大小范围内，更优选地长度为12至50个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为18至19个核苷酸并且其包含tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)。包含seqidno.4的反义寡核苷酸可以在该寡核苷酸的5’和/或3’端包含另外的核苷酸。然而，包含seqidno.4并且长度限于18个核苷酸的反义寡核苷酸在分子的5’或3’端不具有任何另外的核苷酸。这些寡核苷酸的5’和/3’端可共价或非共价连接有其他非核苷酸分子。在一些情况下，反义寡核苷酸是以下寡核苷酸之一：t-g-g-g-a-g-t-a-g-a-t-g-a-g-g-t-a-c(seqidno.4)、mumgmgmgmamgmumamgmamumgmamgmgmumamc(seqidno.10，oligo3742)、t*g*g*g*a*g*t*a*g*a*t*g*a*g*g*t*a*c(seqidno.9，oligo3500)、mumgmgmgmamgt*a*g*a*t*g*mamgmgmumamc(seqidno.16，oligo3534)、和mu*mg*mg*mg*ma*mg*t*a*g*a*t*g*ma*mg*mg*mu*ma*mc(seqidno.18，oligo3509)，其中-是指磷酸二酯键，*是指硫代磷酸酯键，并且m是指o甲基。术语“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，意指多个核苷酸(即，包含与磷酸基团并与可互换有机碱基连接的糖(例如，核糖或脱氧核糖)的分子，所述有机碱基是经取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))或者经取代的嘌呤(例如，腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g)))。本文中使用的术语“核酸”和“寡核苷酸”是指寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。术语“核酸”和“寡核苷酸”应还包括多核苷(即，去掉磷酸的多核苷酸)和任何其他含有机碱基的聚合物。核酸分子优选地是合成的(例如，通过核酸合成产生的)。寡核苷酸可以是可用于产生反义效应的任何大小。在一些实施方案中，其长度为18至23个核苷酸。在另一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为18个核苷酸。术语“核酸”和“寡核苷酸”还可涵盖具有替换或修饰(例如在碱基和/或糖中)的核酸或寡核苷酸。例如，其包括具有以下主链糖的核酸，所述主链糖在2’位与除羟基之外的低分子量有机基团共价连接且在5’位与除磷酸基团或羟基之外的低分子量有机基团共价连接。因此，经修饰的核酸可以包含2’-o-烷基化的核糖基团。此外，经修饰的核酸可以包含例如阿拉伯糖或2’-氟阿拉伯糖的糖而不是核糖。因此，核酸在主链组成方面可以为异质的，从而包含连接在一起的聚合物单元的任何可能的组合，例如肽-核酸(其具有含有核酸碱基的氨基酸主链)。另一些实例在下文中更详细地描述。寡核苷酸可以是dna、rna、pna、lna、ena或包含其任何化学或天然修饰的杂合体。化学和天然修饰是本领域中公知的。这样的修饰包括例如设计用于以下的修饰：提高与靶链的结合(即，提高其解链温度)、帮助鉴定寡核苷酸或寡核苷酸-靶标复合物、提高细胞穿透、针对降解或干扰寡核苷酸的结构或活性的核酸酶及其他酶而稳定化、一旦与靶标序列特异性结合就提供破坏模式(终止事件)、以及改善寡核苷酸的药代动力学特性。修饰包括但不限于：例如，(a)末端修饰，例如5’端修饰(磷酸化去磷酸化、缀合、反向连接等)、3’端修饰(缀合、dna核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用经修饰的碱基、稳定碱基、去稳定碱基、或与配偶体的扩增集合碱基配对的碱基、或缀合的碱基进行置换；(c)糖修饰(例如，在2’位或4’位)或糖替换；以及(d)核苷间连接修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或替代。就这样的修饰干扰翻译的程度(即，例如在体外翻译测定中，相对于缺乏修饰，导致翻译降低50％、60％、70％、80％或90％或更多)来说，所述修饰对于本文中所述的方法和组合物而言可能不是最佳的。经修饰的核苷间连接的非限制性实例包括：具有正常3’-5’连接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯)以及手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯)、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯，这些的2’-5’连接的类似物，以及其中相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接的具有反向极性的那些。还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。其中不包含磷原子的经修饰的核苷间连接具有由短链烷基形成的核苷间连接或环烷基核苷间连接、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或更多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些包括具有以下的那些：吗啉代连接(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的n、o、s和ch2组成部分的其他主链。经取代的糖部分包括但不限于2’位的以下之一：h(脱氧核糖)；oh(核糖)；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或者o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的c1至c10烷基或者c2至c10烯基和炔基。经化学或天然修饰的寡核苷酸可以包含例如至少一个在糖的2’位修饰的核苷酸，最优选2’-o-烷基、2’-o-烷基-o-烷基或2’-氟修饰的核苷酸或端帽(endcap)。在另一些实施方案中，rna修饰包括在rna的嘧啶的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’o-甲基修饰，无碱基残基或3’端的反向碱基。根据本发明可用的寡核苷酸可以包含单个经修饰的核苷。在另一些实施方案中，寡核苷酸可以包含至少两个经修饰的核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个核苷，多至寡核苷酸的整个长度。核苷或核碱基包含天然嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。经修饰的核苷包含其他的合成和天然核碱基，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟嘌呤核苷(isoguanisine)、杀结核菌素(tubercidine)、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲硫基)n6(异戊烯基)腺嘌呤、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、7(去氮杂)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(巯基)腺嘌呤、n6-(异戊基)腺嘌呤、n6(甲基)腺嘌呤、n6，n6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6(甲基)鸟嘌呤、7(烷基)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7(去氮杂)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(巯基)鸟嘌呤、n(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(卤代)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、n4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍烷基)尿嘧啶、5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5氧基乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、n3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)吩嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氮基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)吩嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、7-(胍烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)吩噻嗪-1-基、1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、杀结核菌素、异鸟嘌呤核苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-去氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基(pyrrolopyrizinyl)、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2，4，5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基、并四苯基(tetracenyl)、并五苯基(pentacenyl)、二氟甲苯基(diiluorotolyl)、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2，6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、n2-取代的嘌呤、n6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、经取代的1，2，4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双邻位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基、或者其任何o-烷基化或n-烷基化的衍生物。本发明的反义寡核苷酸可以是嵌合寡核苷酸。本发明的嵌合反义化合物可以形成为如上所述的两种或更多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这样的化合物在本领域中也被称为杂合体或缺口体(gapmer)。特别地，缺口体是具有至少三个离散部分的寡核苷酸，所述离散部分中有两个是相似的(即，包含一个或更多个主链修饰)并且包围独特的区域(即，不包含主链修饰)。寡核苷酸可以在一端或两端(即在3’和/或5’端)包含分子物种。本文中使用的分子物种是指不是天然存在的核苷酸或是非天然存在的核苷酸的任何化合物。分子物种包括但不限于：间隔物、脂质、固醇、例如胆固醇部分的脂质部分、胆酸、例如己基-s-三苯甲基硫醇的硫醚、硫代胆固醇、例如十二烷二醇或十一烷基残基的脂肪族链、例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸酯的磷脂、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分、硬脂基、c16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、例如类固醇的类异戊二烯、例如维生素e的维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉、德卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、地高辛配基、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，cy3或cy576)、hoechst33258染料、补骨脂素或布洛芬。分子物种可以连接在寡核苷酸的多个位置。如上所述，所述分子物种可以与寡核苷酸的3’端或5’端连接，在此其还用于增强寡聚物针对3’-或5’-外切核酸酶的稳定性的目的。或者，其可以与内部核苷酸或分支上的核苷酸连接。所述分子物种可以连接至核苷酸的2’-位。所述分子物种还可以与核苷酸的杂环碱基连接。所述分子物种可以通过接头部分与寡核苷酸连接。任选地，所述接头部分是非核苷酸接头部分。非核苷酸接头是例如无碱基残基(dspacer)；低聚乙二醇，例如三乙二醇或六乙二醇；或者烷二醇，例如丁二醇。间隔物单元优选地通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接。接头单元可以在分子中仅出现一次，或者可以并入数次，例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或酰胺连接并入数次。本发明的寡核苷酸(独立于使核苷酸与分子物种连接的接头)还可以包含非核苷酸接头，特别是无碱基接头(dspacer)、三乙二醇单元或六乙二醇单元。另一些优选的接头是烷基氨基接头，例如c3、c6、c12氨基接头；以及烷基硫醇接头，例如c3或c6硫醇接头。tnfα在很多种tnfα相关病症中发挥作用。本文中使用的tnfα病症是指其中tnfα活性不利于对象中的特定生理功能的病症。本文中使用的术语“其中tnfα活性不利的病症”旨在包括这样的疾病和其他病症：其中患有病症之对象中表达的tnfα的水平在该病症的病理生理学中发挥作用或者作为导致该病症恶化或维持的因素发挥作用。因此，其中tnfα活性不利的病症是预期抑制tnfα活性减轻该病症的至少一种症状和/或发展或恶化的病症。这样的病症可以例如通过患有该病症之对象的生物流体中tnfα浓度的提高(例如，该对象的血清、血浆、滑液等中tnfα浓度的提高)来证实，其可例如使用分别用于检测tnfα信息或蛋白质的tnfα探针或抗tnfα抗体来检测。所述tnfα病症包括但不限于：脓毒症、感染、自身免疫病、癌症、移植排斥和移植物抗宿主病、移植排斥、恶性肿瘤、肺病、肠病、心脏病、脓毒症、脊柱关节病、代谢病、贫血、疼痛、肝病、皮肤病、指甲病、类风湿性关节炎、银屑病、与银屑病关节炎组合的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、血管炎、白塞病、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、特发性肺纤维化(ipe)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩病相关病症、幼年型类风湿性关节炎(jra)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块型银屑病。tnfα在这些疾病中数种中的生物学作用在下文进行描述。抑制这些疾病中的tnfα表达提供了用于所述病症的治疗性治疗。tnfα在脓毒症中发挥作用。生物学效应包括低血压、心肌抑制、血管渗漏综合征、器官坏死、刺激毒性次级介质的释放和激活凝血级联反应。tnfα已涉及自身免疫病，例如通过在类风湿性关节炎中激活组织炎症和引起关节破坏、在糖尿病中促进胰岛细胞死亡和介导胰岛素抗性、在多发性硬化中介导针对少突胶质细胞的细胞毒性和诱导炎性斑块、在多发性硬化中介导针对少突胶质细胞的细胞毒性和诱导炎性斑块、以及涉及克罗恩病的发生。在多种感染性疾病中观察到的生物学效应是由tnfα引起。例如，tnfα已涉及在疟疾中介导脑炎症和毛细血管血栓形成以及梗死；在脑膜炎中介导脑炎症、诱导血脑屏障破坏、触发脓毒性休克综合征和激活静脉性梗死；以及在获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)中诱导恶病质、刺激病毒增殖和介导中枢神经系统损伤。tnfα还被表明为同种异体移植排斥(allograftrejection)和移植物抗宿主病(graftversushostdisease，gvhd)的关键介质，并且涉及介导已在使用针对t细胞受体cd3复合物的大鼠抗体okt3来抑制肾移植物排斥时观察到的不良反应。tnfα已涉及在恶性肿瘤中诱导恶病质、刺激肿瘤生长、增强转移潜能和介导细胞毒性。肺病也与tnfα有关。例如，tnfα在成人型呼吸窘迫综合征(adultrespiratorydistresssyndrome，ards)中发挥作用，包括刺激白细胞-内皮活化、指导针对肺细胞的细胞毒性和诱导血管渗漏综合征。本发明的组合物可用于治疗多种肺病，包括成人型呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺结节病、肺纤维化、硅肺病、特发性间质性肺病和慢性阻塞性气道病。慢性阻塞性气道病的实例包括哮喘和慢性阻塞性肺病(copd)。包括克罗恩病的炎性肠病也与tnf有关。克罗恩病相关病症的实例包括膀胱、阴道和皮肤中的瘘，肠梗阻，脓肿，营养缺乏，来自使用皮质类固醇的并发症，关节炎症，结节性红斑，坏疽性脓皮病，以及眼部病变。tnfα在心脏或冠状动脉病症中(包括心脏局部缺血)发挥作用。其中tnfα活性不利的心脏病旨在包括这样的冠状动脉和心血管疾病：其中患有病症的对象中tnfα的存在已被表明或被怀疑导致该病症的病理生理学或者是导致该病症恶化的因素，所述病症包括例如再狭窄的心血管病。这些病症是指涉及心血管系统(例如，心脏、血管和/或血液)的任何疾病、病症或状态。心血管病的实例包括但不限于冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗死、由心脏停搏引起的心血管组织损伤、由心脏旁路引起的心血管组织损伤、心源性休克、以及高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉痉挛、冠状动脉疾病、瓣膜病、心律失常、以及心肌病。例如脊柱关节病的炎性疾病也因tnfα而加重。脊柱关节病是指影响脊柱关节的数种疾病中的任一种，其中这样的疾病共有共同的临床、放射学和组织学特征。例如糖尿病和肥胖的代谢病已与tnfα相关。术语代谢病是指影响身体如何处理进行生理功能所需的物质的疾病或病症。糖尿病的实例包括1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性神经病、外周神经病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性溃疡、视网膜病性溃疡、糖尿病性大血管病(diabeticmacrovasculopathy)和肥胖。tnfα已涉及贫血的发生。贫血是血液中循环红细胞的数量异常低或血红蛋白的浓度降低。与类风湿性关节炎相关的贫血的实例包括例如慢性病性贫血、缺铁性贫血和自身免疫性溶血性贫血。tnfα还已涉及很多种疼痛综合征。本文中使用的术语“疼痛”是指包括急性和慢性疼痛在内的所有类型的疼痛，例如神经性疼痛和术后疼痛、慢性下背疼痛、丛集性头痛、疱疹性神经痛、幻肢痛、中枢性疼痛、牙痛、抗阿片样物质性疼痛、内脏痛、手术性疼痛、骨损伤疼性痛、分娩痛、由烧伤(包括晒伤)引起的疼痛、产后疼痛、偏头痛、心绞痛、以及包括膀胱炎的泌尿生殖道相关疼痛。该术语还包括伤害性疼痛或伤害感受。肝病还与tnfα有关。肝病包括这样的肝的疾病和其他病症或与肝细胞损伤相关的病症或胆道病症：其中患有病症的对象中tnfα的存在已被表明或被怀疑导致该病症的病理生理学或者是导致该病症恶化的因素。肝病包括与肝细胞损伤相关的病症，包括酒精性肝硬化、α1抗胰蛋白酶缺乏、自身免疫性肝硬化、隐源性肝硬化、暴发型肝炎、乙型和丙型肝炎、以及脂肪性肝炎。胆道病症的实例包括囊性纤维化、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎和胆道梗阻。tnfα已涉及皮肤和指甲病。皮肤病是指涉及炎症的皮肤的除损伤性创伤之外的异常。皮肤病的实例包括但不限于银屑病、寻常型天疱疮、硬皮病、特应性皮炎、结节病、结节性红斑、化脓性汗腺炎、扁平苔藓、sweet综合征(sweet′ssyndrome)和白癜风。tnfα已涉及血管炎，其是一组以血管的炎症为特征的病症。其中tnfα活性不利的血管炎的实例包括但不限于：白塞病，大血管疾病例如巨细胞性动脉炎、风湿性多肌痛和高安病(takayasu’sdisease)或动脉炎，中血管疾病例如经典结节性多动脉炎和川崎病(kawasaki’sdisease)，或者小血管疾病例如白塞综合征(behcet’ssyndrome)、韦格纳肉芽肿病(wegner′sgranulomatosis)、显微镜下多血管炎(microscopicpolyangitis)、超敏性血管炎、小血管性血管炎、henoch-schonlein紫癜、变应性肉芽肿病和血管炎，以及孤立性中枢神经系统血管炎，以及血栓闭塞性血管炎。其中tnfα活性不利的多种其他病症包括但不限于：幼年型关节炎、子宫内膜异位、前列腺炎、脉络膜新血管形成、坐骨神经痛、舍格伦综合征(sjogren’ssyndrome)、葡萄膜炎、湿性黄斑变性(wetmaculardegeneration)、骨质疏松症、骨关节炎、炎性骨病、骨吸收疾病、凝血障碍、烧伤、再灌注损伤、瘢痕疙瘩形成、瘢痕组织形成、发热、牙周病、肥胖、辐射毒性、年龄相关性恶病质、阿尔茨海默病(alzheimer′sdisease)、脑水肿、炎性脑损伤、癌症、慢性疲劳综合征、皮肌炎、例如史-约综合征(stevens-johnsonsyndrome)和雅-赫反应(jarisch-herxheimerreaction)的药物反应、脊髓中和/或脊髓周围的水肿、家族性周期性发热、费尔蒂综合征(felty’ssyndrome)、纤维化、肾小球肾炎(glomerulonephritides)(例如链球菌感染后肾小球肾炎或iga肾病)、假体松动、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病、多发性骨髓瘤、癌症和恶病质、多器官障碍、骨髓增生异常综合征、orchitism骨质溶解、胰腺炎(包括急性、慢性和胰腺脓肿)、多肌炎、进行性肾衰竭、假痛风、坏疽性脓皮病、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、结节病、硬化性胆管炎、卒中、胸腹主动脉瘤修复(thoracoabdominalaorticaneurysmrepair，taaa)、tnf受体相关性周期性综合征(tnfreceptorassociatedperiodicsyndrome，traps)、与黄热病(yellowfever)疫苗接种相关的症状、与耳相关的炎性疾病、慢性耳炎、具有或不具有胆脂瘤的慢性中耳炎、儿科耳炎症、肌炎(myotosis)、卵巢癌、结直肠癌、与治疗相关的诱导性炎性综合征(例如，il-2施用后的综合征)、以及与再灌注损伤相关的病症。寡核苷酸可以单独施用或者与用于治疗tnfα病症的其他治疗剂联合施用。可与本发明的tnfα抑制剂组合的治疗剂的非限制性实例包括以下：非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatorydrug，nsaid)；细胞因子抑制性抗炎药(cytokinesuppressiveanti-inflammatorydrug，csaid)；cdp-571/bay-10-3356(人源化抗tnfα抗体；celltech/baver)；ca2/英夫利昔单抗(嵌合抗tnfα抗体；centocor)；75kdtnfr-igg/依那西普(75kdtnf受体-igg融合蛋白；immunex；55kdtnf-igg(55kdtnf受体-igg融合蛋白；hoffmann-laroche)；idec-ce9/sb210396(非消耗性灵长类源化的抗-cd4抗体；idec/smithkline；dab486-il-2和/或dab389-il-2(il-2融合蛋白；seragen；抗tac(人源化抗il-2rα；proteindesignlabs/roche)；il-4(抗炎性细胞因子；dnax/schering)；il-10(sch52000；重组il-10、抗炎性细胞因子；dnax/schering)；il-4；il-10和/或il-4激动剂(例如，激动剂抗体)；il-1ra(il-1受体拮抗剂；synergen/amgen)；阿那白滞素(kineret/amgen)；tnf-bp/s-tnf(可溶性tnf结合蛋白)；r973401(磷酸二酯酶iv型抑制剂)；mk-966(cox-2抑制剂)；伊洛前列素；甲氨蝶呤；沙利度胺和沙利度胺相关药物(例如，celgen)；来氟米特(抗炎和细胞因子抑制剂)；氨甲环酸(纤溶酶原激活抑制剂)；t-614(细胞因子抑制剂)；前列腺素e1；替尼达普(非甾体抗炎药)；萘普生(非甾体抗炎药)；美洛昔康(非甾体抗炎药)；布洛芬(非甾体抗炎药)；吡罗昔康(非甾体抗炎药)；双氯芬酸(非甾体抗炎药)；吲哚美辛(非甾体抗炎药)；柳氮磺吡啶；硫唑嘌呤；ice抑制剂(酶白介素-1-β-转化酶的抑制剂)；zap-70和/或ick抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或ick的抑制剂)；vegf抑制剂和/或vegf-r抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体的抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如，sb203580)；tnf-转化酶抑制剂；抗il-12抗体；抗il-18抗体；白介素-11；白介素-13；白介素-17抑制剂；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环孢素；环磷酰胺；全淋巴照照；抗胸腺细胞球蛋白；抗cd4抗体；cd5毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(cytokineregulatingagent，cra)hp228和hp466(houghtenpharmaceuticals，inc.)；icam-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(isis2302；isispharmaceuticals，inc.)；可溶性补体受体1(tp10；tcellsciences，inc.)；泼尼松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗il2r抗体；海洋和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟灭酸；静脉内免疫球蛋白；齐留通(zileuton)；阿扎立平(azaribine)；霉酚酸(rs-61443)；他克莫司(fk-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose，therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；甲氨蝶呤；抗病毒剂；以及免疫调节剂。本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效力可在细胞培养物或实验动物中通过标准药物操作来确定，例如用于确定lds0(对群体中的50％致死的剂量)和ed50(在群体中的50％中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为ld50/ed50比。显示出大治疗指数的预防剂和/或治疗剂是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的预防剂和/或治疗剂，但应加以小心以设计将这样的药剂靶向至受影响组织的部位的递送系统以使对未受感染细胞的潜在损害最小化并且从而降低副作用。在配制供人使用的预防剂和/或治疗剂的一系列剂量中可使用由细胞培养测定和动物研究获得的数据。这样的药剂的剂量优选地落在包括ed50且具有很少毒性或没有毒性的循环浓度的范围内。根据所使用的剂型和所利用的施用途径，剂量可以在该范围内变化。对于本发明方法中使用的任何药剂，均可最初由细胞培养物测定评估治疗有效剂量。如在细胞培养物中测定的，可以在动物模型中制定剂量以实现包括ic50(即，实现症状的半最大抑制的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更精确地确定在人中的可用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱来测量。众多研究已对反义寡核苷酸的最佳剂量进行了检测。在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另一些实施方案中，所述活性化合物可以占单位重量的约2％至约75％、或例如约25％至约60％，以及可从其中推导的任何范围。本文中所述的化合物的对象剂量的范围通常为约0.1μg至10,000mg、更通常约1μg/天至8000mg并且最通常约10μg至100μg。根据对象的体重而言，每次施用的通常剂量的范围为约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000mg/kg/体重或更多，以及可从其中推导的任何范围。在可从本文中所列举数值推导的范围的一些非限制性实例中，基于上述数值，可施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。绝对量将取决于多种因素，包括并行治疗、剂量数量和个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型大小和体重)。这些是本领域普通技术人员公知的因素并且仅用常规实验即可解决。一般优选的是，使用最大剂量，即，根据合理医学判断的最高安全剂量。本发明分子的多个剂量也在考虑之内。在一些情况下，当本发明的分子与另一种治疗剂(例如抗炎剂)一起施用时，在治疗患有tnfα病症或处于其发生风险之中的对象中使用所述分子或另一种药剂的亚治疗剂量或者二者的亚治疗剂量。当两类药物一起使用时，可以以亚治疗剂量施用另一种药剂以产生期望的治疗结果。本文中使用的“亚治疗剂量”是指小于如果在不存在另一种药剂下施用在对象中产生治疗结果之剂量的剂量。因此，治疗剂的亚治疗剂量是在不存在施用本发明分子下在对象中不产生期望的治疗结果的剂量。可用于治疗tnfα病症的药剂的治疗剂量是医学领域中公知的。这些剂量已广泛地描述于例如remington’spharmaceuticalsciences的参考文献，以及医学界所依据的作为用于治疗感染性疾病、癌症和自身免疫病之指导的很多其他医学参考文献。寡核苷酸的治疗剂量也已在本领域中描述。给药方案可以是一天数次、每天、每隔一天、每周、每两周、其间的任何时间或更低频率。本文中使用的术语“每两周给药”是指每两周一次地向对象施用物质(例如，抗tnfα核酸)的时间过程。可以例如每7至20天、每11至17天或每13至15天施用寡核苷酸。寡核苷酸以有效量施用。本发明化合物在治疗本文中所述的疾病中的有效量可以根据所使用的具体化合物、化合物的递送模式以及其是单独使用还是组合使用而变化。用于任何特定应用的有效量也可根据例如所治疗的疾病、所施用的具体化合物、对象的体型大小或者疾病或病症的严重程度等因素而变化。本领域普通技术人员可根据经验确定本发明的特定分子的有效量，而不需要过度实验。结合本文中提供的教导，通过在多种活性化合物中选择并权衡例如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和优选施用模式的因素，可以设计不引起显著毒性并且仍对治疗特定对象完全有效的有效预防性或治疗性治疗方案。如本文中更详细描述的，本文中所述的寡核苷酸在本发明的检测和治疗方法中可单独使用或与其他分子(例如检测剂或细胞毒剂)结合使用。寡核苷酸可以例如与可检测的标记偶联或缀合。可检测的标记是可以直接或间接确定其存在的部分。一般来说，标记的检测涉及标记的能量发射。标记可通过其发射和/或吸收特定波长的光子或其他原子粒子(例如放射性、发光、光学或电子密度等)的能力来直接检测。标记可通过其结合、募集和在一些情况下切割自身可以发射或吸收特定波长的光的另一部分(例如，例如flag表位的表位标签、例如辣根过氧化物酶的酶标签等)的能力来间接检测。间接检测的一个实例是使用将底物切割成可见产物的第一酶标记。标记可以具有化学、肽或核酸分子性质，但是其不限于此。其他可检测的标记包括例如p32或h3的放射性同位素、例如荧光染料的发光标志物、光学或电子密度标志物等；或者例如flag表位或ha表位的表位标签，生物素，亲和素，以及酶标签(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)。所述标记可以在寡核苷酸的合成期间或之后与其结合。存在本领域普通技术人员已知的很多不同的标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。本领域普通技术人员将知晓用于本文中所述的寡核苷酸的其他合适标记，或者将能够使用常规实验来确定这样的标记。此外，这些标记与本发明寡核苷酸的偶联或缀合可使用本领域普通技术人员常用的标准技术来进行。除其他方面之外，寡核苷酸与可检测标记的缀合还有利于在诊断测定中使用这样的试剂。另一类别的可检测标记包括诊断和成像标记(通常被称为体内可检测标记)，例如，例如磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)：gd(dota)；对于核医学：201tl，γ发射放射性核素99mtc；对于正电子发射断层摄影(positron-emissiontomography，pet)：正电子发射同位素(18)f-氟脱氧葡萄糖((18)fdg)、(18)f-氟化物、铜-64、钆双胺和pb(ii)的放射性同位素(例如203pb)；111in。在这样的一些情况下，当寡核苷酸提供反义效应时，可观察到寡核苷酸的使用。本文中描述的缀合或修饰使用常规化学，所述化学不构成本发明的一部分并且所述化学是化学领域技术人公知的。保护基和已知接头(例如单-和异-双功能接头)的使用在文献中有充分记载，并且在此不再赘述。本文中使用的“缀合的”意指通过任何物理化学方式彼此稳定结合的两个实体。重要的是，连接的性质为使得其不会显著损害任一实体的有效性。考虑到这些参数，可以使用本领域普通技术人员已知的任何共价或非共价连接。在一些实施方案中，优选共价连接。非共价缀合包括疏水相互作用、离子相互作用、例如生物素-亲和素和生物素-链霉亲和素络合的高亲和力相互作用以及其他亲和力相互作用。这样的连接方式和方法是本领域普通技术人员公知的。根据标记和其他测定组分的性质，可以使用多种方法来检测标记。本发明的药物组合物包含有效量的溶解或分散在可药用载体中的一种或更多种药剂。短语“可药用的或药理学上可接受的”是指当施用于动物(例如，例如人)(适当时)时不产生不利的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应满足fda生物标准局(fdaofficeofbiologicalstandards)所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。该化合物通常适合施用于人。该术语要求，化合物或组合物无毒且足够纯，使得在施用于人之前不需要对化合物或组合物进行进一步操作。如本领域普通技术人员所知，本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、诸如此类的材料及其组合(参见，例如remington’spharmaceuticalsciences(1990)，其通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则其在治疗性或药物组合物中的使用均在考虑之内。药剂可以包含不同类型的载体，这取决于其是否将以固体、液体或气雾剂形式施用，以及其是否需要是无菌的(对于例如注射这样的施用途径)。如本领域普通技术人员所知，本发明可如下施用：静脉内、皮内、动脉内、病灶内、瘤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内(intravesicularlly)、经黏膜、心包内、脐内、眼内、经口、表面、局部、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、在乳膏中、在脂质组合物(例如，脂质体)中、或者通过其他方法或前述的任意组合(参见，例如remington’spharmaceuticalsciences，通过引用并入本文)。在一个具体实施方案中，考虑腹膜内注射。在任何情况下，所述组合物均可以包含多种抗氧化剂以延缓一种或更多种组分的氧化。另外，可通过防腐剂来实现防止微生物的作用，所述防腐剂例如多种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。药剂可以被配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。可药用盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或者与例如如盐酸或磷酸的无机酸或者与例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐还可来自于例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物的无机碱，或者例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。在组合物为液体形式的一些实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可例如以下来维持适当的流动性：通过使用包衣，例如卵磷脂；通过分散在载体(例如，如液体多元醇或脂质)中来维持所需的颗粒尺寸；通过使用表面活性剂(例如羟丙基纤维素)；或者这样的方法的组合。在很多情况下，将优选地包含等张剂，例如糖、氯化钠或其组合。本发明的化合物可直接施用于组织。直接组织施用可以通过直接注射来实现。化合物可以施用一次，或者作为替代地其可以以多次施用来施用。如果多次施用，可以通过不同的途径来施用化合物。例如，第一次(前几次)施用可直接针对受影响的组织，而后续施用可以是全身性的。本发明的制剂以可药用溶液施用，所述溶液常规地可包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、辅料和任选地其他治疗性成分。根据本发明的方法，化合物可以以药物组合物施用。一般来说，药物组合物包含本发明的化合物和可药用载体。本文中使用的可药用载体意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。可药用载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂以及本领域公知的其他材料。这样的制剂可以常规地包含盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选地其他治疗剂。当用于药物时，盐应当为可药用的，但是不可药用的盐可以方便地用于制备其可药用盐并且不被排除在本发明的范围之外。这样的药理学上和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。另外，可将可药用盐制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾或钙的盐。本发明的化合物可以被配制成固体、半固体、液体或气态形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、储库(depository)、吸入剂和注射剂，以及用于经口、肠胃外或外科手术施用的常用方式。本发明还包括配制用于局部施用(例如通过植入物)的药物组合物。适用于经口施用的组合物可以作为各自包含预定量活性剂的离散单元提供，例如胶囊剂、片剂、锭剂。另一些组合物包括在水性液体或非水性液体中的混悬剂，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域公知的可药用载体组合来容易地配制化合物。这样的载体使得能够将本发明的化合物配制成用于待治疗对象经口摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆体(slurry)、混悬剂等。用于经口使用的药物制剂可如下作为固体赋形剂获得：在添加合适的助剂(如果期望的话，获得片剂或糖衣丸核心的合适助剂)之后，任选地研磨所得混合物，并对颗粒混合物进行加工。合适的赋形剂特别地是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果期望的话，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者藻酸或其盐(例如藻酸钠)。任选地，经口制剂还可以在盐水或缓冲剂中配制以中和内部酸性条件或者可以在无任何载体下施用。糖衣丸核心被提供合适的包衣。出于此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液(lacquersolution)、以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣丸包衣添加染料(dyestuff)或颜料(pigment)以用于识别或以表征活性化合物剂量的不同组合。可以经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入式胶囊剂(push-fitcapsule)，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软的密封胶囊剂。推入式胶囊剂可包含与填充剂(例如乳糖)、黏合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，活性化合物可以溶解或混悬在合适的液体(例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。另外，可以添加稳定剂。还可以使用配制用于经口施用的微球。这样的微球已在本领域中充分限定。用于经口施用的所有制剂均应为适于这样的施用的剂量。对于口含施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。对于通过吸入施用，根据本发明使用的化合物可以方便地通过使用合适的抛射剂以由加压包装或喷雾器提供的气雾喷雾剂的形式递送，所述抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过设置递送计量量的阀来确定。在吸入器或吹入器中使用的(例如明胶的)胶囊和药筒可以被配制成包含化合物和合适粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。用于制备气雾剂递送系统的技术是本领域技术人员公知的。一般来说，这样的系统应使用不会显著损害活性剂的生物特性的组分(参见，例如，sciarra和cutie，remington’spharmaceuticalsciences中的“aerosols”)。本领域技术人员可以容易地确定用于产生气雾剂的不同参数和条件，而无需进行过度实验。化合物当期望将其全身递送时可以被配制成用于通过注射(例如通过推注或连续输液)肠胃外施用。注射用制剂可以以单位剂量形式存在，例如存在于其中添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采用例如在油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格液或不挥发油。静脉内载剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。其他施用形式(例如静脉内施用)将导致较低的剂量。如果在施用的初始剂量下对象中的应答不足，则可以在患者耐受性许可的范围内使用更高的剂量(或通过不同的更局部化的递送途径的有效更高剂量)。考虑每天多个剂量以实现化合物的合适全身水平。本发明的组合物可以配制在用于施用于皮肤或体腔的表面组合物中。合适的表面载剂和载剂组分是化妆品和制药领域中公知的，并且包括例如以下载剂(或载剂组分)：水；有机溶剂，例如醇(特别是能够容易从皮肤中蒸发的低级醇，例如乙醇)、二醇(例如丙二醇、丁二醇和甘油)、脂肪族醇(例如羊毛脂)；水与有机溶剂的混合物(例如水和醇)，以及有机溶剂的混合物(例如醇和甘油)(任选地还有水)；基于脂质的材料，例如脂肪酸、酰基甘油(包括油，例如矿物油、以及天然或合成来源的脂肪)、磷酸甘油酯、鞘脂和蜡；基于蛋白质的材料，例如胶原和明胶；基于硅酮的材料(非挥发性和挥发性二者)，例如环甲硅脂(cyclomethicone)、聚二甲基硅氧烷醇(demethiconol)和聚二甲基硅氧烷共聚多元醇(dimethiconecopolyol)(dowcorning)；基于烃的材料，例如矿脂和角鲨烷；阴离子、阳离子和两性表面活性剂和皂；缓释载剂，例如微海绵和聚合物基质；稳定剂和助悬剂；乳化剂；以及适合施用于皮肤的其他载剂和载剂组分，以及如上鉴定或本领域另外已知的表面用载剂组分的混合物。载剂还可以包括适于提高所施用制剂的稳定性或有效性的组分，例如防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透增强剂、缓释材料等。这样的载剂和载剂组分的实例是本领域公知的并且描述于例如martindale-theextrapharmacopoeia(pharmaceuticalpress，london1993)和martin(编辑)，remington’spharmaceuticalsciences的参考著作中。合适载剂的选择将取决于制剂要实现的具体物理形式和递送模式。合适形式的实例包括液体(例如，含漱剂和漱口剂，包括锶阳离子的溶解形式以及混悬剂、乳剂等)；固体和半固体，例如凝胶剂、泡沫剂、糊剂、乳膏剂、软膏剂、“棒剂(stick)”(如唇膏或腋下除臭剂棒)、散剂等；包含脂质体或其他递送囊泡的制剂；直肠或阴道栓剂、乳膏剂、泡沫剂、凝胶剂或软膏剂；以及其他形式。典型的递送模式包括使用手指施加；使用物理施加器例如布、纸巾、拭子、棒或刷子施加(如通过在临施加之前用制剂浸泡施加器，或者通过将准备的已包含制剂的施加器施加或附着至皮肤，所述施加器例如经处理或预润湿的绷带、擦拭物、毛巾或棒)；喷雾(包括雾、气雾剂或泡沫喷雾)；滴管(dropper)施加(例如用滴耳剂)；撒布(如用制剂的合适粉末形式)；以及浸泡。表面用制剂还包括用于直肠和阴道施用的制剂。用于直肠施用的制剂可以作为具有包含例如可可豆脂的合适基质的栓剂提供。适于阴道施用的制剂可以作为片剂、阴道栓剂(pessary)、塞(tampon)、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂提供，所述制剂除活性成分之外还包含例如本领域已知的合适的载体。在又一些实施方案中，递送载剂是生物相容性的微粒或适于植入到哺乳动物接受者中的植入物。另一些递送系统可包括时间释放、迟释或缓释递送系统。这样的系统可避免重复施用化合物，提高对象和医生的便利性。很多类型的释放递送系统均是可获得的并且是本领域普通技术人员已知的。其包括聚合物基质系统，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯/盐(copolyoxalate)、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。在一些实施方案中，将本发明的反义核酸配制为稳定的自组装纳米结构。所述纳米结构包含tnfα反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与核心缔合。所述核心可以是实心或空心的核心，例如脂质体核心。实心核心是不具有空心中心的球形材料。本文中使用的术语球形是指一般形状并且不意指或不限于完美的球体或圆形。其可以包括缺陷。实心核心可以由本领域技术人员已知的很多种材料构建，所述材料包括但不限于：贵金属(金、银)、过渡金属(铁、钴)和金属氧化物(二氧化硅)。此外，这些核心可以是惰性的、顺磁性的或超顺磁性的。这些实心核心可以由所述材料的纯组合物、或任意数量的材料的混合物的组合、或材料的分层组合物构建。此外，实心核心可以由聚合物核心构成，所述聚合物核心例如两亲性嵌段共聚物，疏水性聚合物例如聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚(乙醇酸)、聚(己内酯)，以及本领域技术人员已知的其他生物相容性聚合物。或者，核心可以是空心核心，其在壳材料的中心区域中具有至少一些空间。空心核心包括脂质体核心。本文中使用的脂质体核心是指由形成脂质双层的脂质或磷脂组分形成的位于中心的核心隔室。“脂质体”是多种尺寸和结构的人造的自封闭的囊状结构，其中一个或数个膜包封水性核心。最典型的脂质体膜由脂质双层膜形成，其中亲水性头基朝向水性环境取向，而脂质链嵌入亲脂性核心中。脂质体也可以由其他两亲性单体和聚合物分子(例如聚合物，如嵌段共聚物或多肽)形成。单层囊泡是由包围水性空间的单膜限定的脂质体。相比之下，寡-或多层囊泡由数个膜构建。通常来说，膜为约4nm厚并且由天然或合成来源的两亲性脂质(例如磷脂)构成。任选地，可通过并入其他脂质(如固醇或胆酸衍生物)来对膜性质进行改进。脂质双层由两层脂质分子构成。层中的每个脂质分子基本上与相邻的脂质双层平行取向，并且形成双层的两个层具有其分子暴露于水相的极性末端和彼此相邻的非极性末端。脂质体核心的中心水性区域可以是空的或者完全或部分填充有水、水性乳剂、寡核苷酸或者其他治疗剂或诊断剂。“脂质”是指其作为通用术语的常规意义，包括不溶于水的脂肪、脂质、原生质的醇-醚可溶性成分。脂质通常由亲水性和疏水性部分组成。在水中，脂质可以自组织以形成双层膜，其中亲水性部分(头基)朝向水相取向，而亲脂性部分(酰基链)嵌入双层核心。脂质也可以包含两个亲水性部分(双头基两亲物(bolaamphiphile))。在这种情况下，膜可以由单个脂质层而不是双层形成。当前背景下的脂质的典型实例是脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、固醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂质、色脂和脂肪酸。该术语涵盖天然存在和合成的脂质二者。与本发明有关的优选脂质是：类固醇和固醇，特别是胆固醇、磷脂(包括磷脂酰、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及鞘磷脂。在存在脂肪酸的情况下，其长度可以是约12至24个碳链，含有多至6个双键。脂肪酸与可来自于甘油的主链连接。一种脂质中的脂肪酸可以是不同的(不对称的)，或者可以仅存在1个脂肪酸链，例如，溶血卵磷脂。混合制剂也是可能的，特别是当非阳离子脂质来自于天然来源时，例如卵磷脂(磷脂酰胆碱)从卵黄、牛心脏、脑、肝或大豆纯化。脂质体核心可以由本领域人员已知的一种或更多种脂质构建，所述脂质包括但不限于：鞘脂，例如鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、甲基化鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂以及多种长度和饱和状态的植物鞘氨醇及其衍生物；磷脂，例如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷酸肌醇、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰基甘油)磷酸酯、(二酰基甘油)磷酸酯、醚脂质、二植烷基醚脂质以及多种长度、饱和状态的缩醛磷脂及其衍生物；固醇，例如胆固醇、链固醇(desmosterol)、豆固醇、羊毛固醇、烯胆甾烷醇(lathosterol)、薯蓣皂苷配基、谷固醇、酵母固醇、酵母甾烯醇(zymostenol)、14-去甲基-羊毛固醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸酯、14-去甲基-14-脱水羊毛固醇、谷甾烷醇、菜油固醇(campersterol)、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系元素螯合脂质、a-环取代的氧化固醇、b-环取代的氧化固醇、d-环取代的氧化固醇、侧链取代的氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光固醇、磺化固醇、磷酸化固醇以及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇，及其衍生物。寡核苷酸可以位于核心的外部、核心的壁中和/或核心的中心。位于核心上的寡核苷酸通常被称为与核心偶联。偶联可以是直接或间接的。在一些实施方案中，核心的外部存在至少25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个寡核苷酸或其任意范围组合。在一些实施方案中，表面上存在1至1000、10至500、50至250或50至300个寡核苷酸。寡核苷酸壳的寡核苷酸可以在多个方向上取向。在一些实施方案中，寡核苷酸径向向外取向。这些寡核苷酸的取向可以是相对于核心的5’远端/3’末端，或者相对于核心的3’远端/5’末端，或者围绕核心侧向取向。在一个实施方案中，在单个sna的相同表面上存在一个或多个不同的寡核苷酸。在所有情况下，在表面上存在至少1个寡核苷酸，但可存在多至10,000个。寡核苷酸可以通过接头与核心或彼此和/或与其他分子(例如活性剂)直接或间接地连接。寡核苷酸可以通过5’端或3’端与接头缀合，例如，[序列，5’-3’]-接头或接头-[序列，5’-3’]。纳米结构的一些或全部寡核苷酸可以通过共价或非共价连接彼此直接或间接地连接。一个寡核苷酸与另一寡核苷酸的连接可以是该寡核苷酸与脂质体核心的连接的替代或补充。寡核苷酸壳可以通过一个或多个接头分子锚定到核心的表面，所述接头分子包括但不限于：含有一个或多个硫醇的任何化学结构，例如多种链长的烷烃硫醇、环状二硫醇、硫辛酸或本领域技术人员已知的其他硫醇接头。在包含脂质体核心的一个实施方案中，寡核苷酸壳可以通过与一个或多个接头分子缀合而锚定到脂质体核心的表面，所述接头分子包括但不限于：生育酚；鞘脂，例如鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、甲基化鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂以及多种长度和饱和状态的植物鞘氨醇及其衍生物；磷脂，例如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷酸肌醇、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰基甘油)磷酸酯、(二酰基甘油)磷酸酯、醚脂质、二植烷基醚脂质以及多种长度、饱和状态的缩醛磷脂及其衍生物；固醇，例如胆固醇、链固醇、豆固醇、羊毛固醇、烯胆甾烷醇、薯蓣皂苷配基、谷固醇、酵母固醇、酵母甾烯醇、14-去甲基羊毛固醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸酯、14-去甲基-14-脱水羊毛固醇、谷甾烷醇、菜油固醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系元素螯合脂质、a-环取代的氧化固醇、b-环取代的氧化固醇、d-环取代的氧化固醇、侧链取代的氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光固醇、磺化固醇、磷酸化固醇以及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇，及其衍生物。寡核苷酸还可以通过嵌入到核心(脂质体核心)中与核心缔合，或者其可以间接地(即，通过其他分子(例如接头)非共价地或共价地)或直接地(即，共价地)附接或连接。本发明还包括涉及任意一种组分或组分集合的制品。在一些实施方案中，所述制品是药盒(kit)。所述制品包括在一个或更多个容器中的本发明的药物或诊断级化合物。所述制品可以包括推广或描述本发明化合物的使用的说明书或标签。本文中使用的“推广”包括结合治疗tnfα病症的与本发明组合物相关的所有商业方法，包括教育方法、医院和其他临床指导、制药行业活动(包括药品销售)，以及任何广告或其他推广活动，包括任何形式的书面、口头和电子通信。“说明书”可以定义推广的组成部分并且通常包括在本发明组合物的包装上或与其有关的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书。因此，在一些实施方案中，本文中所述的药剂可以组装成药用或诊断或研究药盒以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。药盒可以包含容纳本发明的组分的一个或更多个容器和使用说明书。具体地，这样的药盒可以包括本文中所述的一种或更多种药剂，以及描述这些药剂的预期治疗应用和合适施用的说明书。在某些实施方案中，药盒中的药剂可以为适于特定应用和适于药剂施用方法的药物制剂和剂量。药盒可以被设计成有利于医师使用本文中描述的方法并且可以采用多种形式。在适用的情况下，药盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉末)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的或以其他方式可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物类(例如，水或细胞培养基)，其可以与或可以不与药盒一起提供。本文中使用的“说明书”可以限定说明和/或推广的组分，并且通常包括在本发明的包装上与其有关的书面说明书。说明书还可以包括以使得使用者将清楚地认识到说明书与该药盒有关的任何方式提供的任何口头或电子说明书，例如，音像(例如，录像带、dvd等)、因特网和/或基于网络的通信等。书面说明书可以是由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书还可反映机构对用于人施用的制造、使用或销售的许可。药盒可以包含在一个或更多个容器中的本文中所述的任意一种或更多种组分。例如，在一个实施方案中，药盒可以包含用于混合药盒的一种或更多种组分和/或分离和混合样品并施用于对象的说明书。药盒可以包括容纳本文中所述的药剂的容器。所述药剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷藏运送。或者，其可以被放置在小瓶或其他用于储藏的容器中。第二容器可以具有无菌制备的其他药剂。或者，药盒可以包含在注射器、小瓶、管或其他容器中预混合并运送的活性剂。药盒可以具有多种形式，例如泡罩袋(blisterpouch)、收缩包装袋(shrinkwrappedpuch)、真空可密封袋、可密封的热成型盘或者类似的袋或盘形式，其中附件松散地包装在袋、一个或更多个管、容器、盒或包中。在添加附件之后，可以对药盒进行灭菌，从而允许容器中的各个附件以其他方式解开。可以使用任何合适的灭菌技术(例如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法)来将药盒灭菌。根据具体应用，药盒还可以包括其他组分，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲剂、试剂、注射器、针、用于施用或去除消毒剂的织物(例如纱布)、一次性手套、施用前的药剂载体等。药盒的组合物可以作为任何合适的形式提供，例如，作为液体溶液或经干燥的粉末提供。当提供的组合物是干粉末时，可以通过添加合适的溶剂(其也可以被提供)来重构粉末。在要求液体形式的组合物的一些实施方案中，液体形式可以是浓缩的或即用型的。溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。用于药物组合物的合适溶剂是公知的并且可在文献中获得。所述溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。在一组实施方案中，药盒可以包括被隔室化以封闭限制的方式接受一个或更多个容器装置(例如小瓶、管等)的载体装置，每个容器装置包含待用于所述方法中的一个单独元件。例如，一个容器可以包含用于测定的阳性对照。另外地，药盒可以包含用于可用于测定的其他组分(例如，缓冲剂)的容器。本发明还包括成品的经包装和标记的药物产品。该制品包括在合适密封器皿或容器(例如玻璃小瓶或其他容器)中的合适的单位剂型。在适于肠胃外施用的剂型的情况下，活性成分是无菌的并且适于作为不含颗粒的溶液施用。换言之，本发明包括肠胃外溶液和冻干粉末两种，每种都是无菌的，并且后者适于在注射前重构。或者，单位剂型可以是适于经口、经皮、表面或经黏膜递送的固体。在一个优选实施方案中，单位剂型适于静脉内、肌内或皮下递送。因此，本发明包括适于每种递送途径的优选无菌的溶液。与任何药用产品一样，包装材料和容器被设计用于在储存和运输期间保护产品的稳定性。此外，本发明的产品包括建议医师、技术人员或患者如何适当地预防或治疗tnfα疾病或病症的使用说明书或其他信息材料。换言之，制品包含指示或建议给药方案(包括但不限于实际剂量)、监测操作和其他监测信息的说明装置。更具体地，本发明提供了一种制品，其包括包装材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套(envelope)等；以及包含在所述包装材料中的药剂的至少一种单位剂型。本发明还提供了一种制品，其包含包装材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；以及包含在所述包装材料中的每种药剂的至少一种单位剂型。本发明还提供了一种制品，其包含包装材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；以及包含在所述包装材料中的每种药剂的至少一种单位剂型。本发明还提供了一种制品，其包含用于注射制剂的针或注射器(优选以无菌形式包装的)，和/或包装的醇垫。本发明在其应用方面不限于以下说明中所述或附图中所示结构细节和组件布置。本发明能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。另外，本文中使用的措辞和术语是出于描述目的并且不应被视为限制。本文中“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用意指涵盖其后所列出的项目及其等同物以及另外的项目。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文中所述的本发明具体实施方案的很多等同方案。这样的等同方案旨在涵盖在所附权利要求书中。本文中公开的包括专利文献在内的所有参考文献均通过引用整体并入本文。实施例实施例1：抑制性寡核苷酸序列使用标准的亚磷酰胺化学在mermade48(bioautomation)上合成寡核苷酸(试剂来自glenresearch和chemgenes)。使三个序列靶向人tnfmrna的起始密码子(oligo3482、3483和3484)。用sfold产生三个另外的序列(oligo3485、3486和3487)。使一个序列oligo3488人源化。最后，产生乱序对照(oligo3495)。各自的序列列于表1中：表1：寡核苷酸序列表oligoidoligo序列(5’至3’)seqidno.oligo3482catggtgtcctttccagg1oligo3483tcagtgctcatggtgtcc2oligo3484catgctttcagtgctcat3oligo3485tgggagtagatgaggtac4oligo3486ttgaccttggtctggtag5oligo3487gatggcagagaggaggtt6oligo3488ttatctctcagctccacg7oligo3495atggagcaaaacccgcag8然后，将寡核苷酸用反相高效液相色谱(aglient)纯化。用基质辅助的激光解吸离子化质谱验证寡核苷酸产物的身份。针对tnf表达来初始筛选合成的寡核苷酸。将原代人角质形成细胞平板接种在96孔板中。第二天，使用optimem(lifetechnologies)中的lipofectamine(lifetechnologies)用2μm的反义链转染细胞24小时。在孵育期之后，用pbs洗涤细胞，提取其mrna，合成cdna，并用rt-pcr确定tnf和gapdh水平(图1)。oligo3482、4385和3487在降低tnf表达水平方面特别有效。在另外一组经修饰的序列中进行相同的实验条件。简言之，将原代人角质形成细胞平板接种在96孔板中。第二天，使用optimem(lifetechnologies)中的lipofectamine(lifetechnologies)用2μm的反义链转染细胞24小时。在孵育期之后，用pbs洗涤细胞，提取其mrna，合成cdna，并用rt-pcr探测tnf和gapdh水平(图2)。如表2中可以看出，每个序列与各自的对照(用斜体表示)配对：表2：经修饰的寡核苷酸序列及其对照实施例2：球形核酸(sna)对tnf的抑制将不同sna的化学物质与各自的寡核苷酸对照进行比较。制备含有抗tnf反义链的sna。通过用10ml水中的0.570g柠檬酸三钠还原0.1969ghaucl4·3h2o的490ml沸腾水溶液来制备13±1nm直径的金纳米颗粒。然后，将颗粒溶液通过0.45μm乙酸纤维素膜过滤以除去任何聚集的纳米颗粒。如所制备的，纳米颗粒浓度为11nm。然后，按原样使用金纳米颗粒来制备抗tnf和对照sna。sna合成开始于将向合成的金纳米颗粒中添加硫醇化的5kda线性聚(乙二醇)至5μm的终浓度。在混合之后，使溶液在37℃下静置1.5小时，此时将寡核苷酸以5μm的终浓度添加到溶液中。在维持温度的同时，在1小时的过程内将氯化钠溶液以两个相等的等分试样添加到功能化混合物中，以将naci浓度提高至150mm。使混合物在37℃下静置过夜。第二天，以21,000×g离心沉淀颗粒，除去上清液，并将颗粒重悬于无菌pbs中。将该过程重复三次以除去过量的peg和未附着于颗粒的寡核苷酸。通过从金核心中释放寡核苷酸(用kcn氧化溶解纳米颗粒)来测量每个纳米颗粒的寡核苷酸数量。最后，用基于荧光的测定(oligreen，lifetechnologies)根据生产商的说明来测量所释放的寡核苷酸的数量。将原代人角质形成细胞平板接种在96孔板中。第二天，在5μm的寡核苷酸浓度下用tnf或对照sna转染细胞。使处理进行过夜。第二天，洗涤细胞，收集mrna，制备cdna，并探测tnf和gapdh的表达。结果示于图3中。如表3中可以看出，每个序列与各自的对照(用斜体表示)配对：表3：用于比较sna化学物质的寡核苷酸序列和对照将人角质形成细胞平板接种在96孔组织培养板中并使其附着过夜。在第二天，将其用50ng/ml人重组tnf处理4小时，之后用oligo3661修饰的sna或oligo3657(seqidno：22)sna处理。使处理进行过夜。第二天，洗涤细胞，收集mrna，制备cdna，并探测tnf和gapdh的表达，并计算百分比基因敲减(图4)。检测额外的硫代磷酸酯修饰对oligo3657修饰的sna的作用。如先前所述，使用金纳米颗粒制备具有提高硫代磷酸酯含量的寡核苷酸家族。将颗粒转染到人角质形成细胞中过夜。第二天，洗涤细胞，收集mrna，制备cdna，并探测tnf和gapdh的表达，并计算百分比基因敲减(图5)。分析表4中的序列：表4：具有提高硫代磷酸酯含量的寡核苷酸检测了空心sna对tnf表达的作用。制备含有生育酚亚磷酰胺的寡核苷酸(试剂来自chemgenes)。通过将脂质以75mg/ml溶解在dcm中来制备由二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)构成的脂质体支架，并随后将溶液在氮流下干燥并冻干。将残余材料以40mg/ml的浓度溶解在hepes(ph7.3)和150mmnacl中，并使其静置30分钟，然后使用液氮进行三个冷冻/融化循环。然后，将该溶液通过包含直径为100、50和30nm的孔的聚碳酸酯膜挤出。所得溶液含有直径为约40nm的脂质体。通过向脂质体溶液中添加生育酚修饰的寡核苷酸来发生向sna的功能化。然后，将材料用切向流过滤浓缩并如上所述施加于人角质形成细胞。所制备的序列如表5中所示：表5：用于空心sna研究的寡核苷酸序列及其对照实施例3：靶向tnfmrna的反义sna的抑制作用将靶向tnfmrna的反义sna对mrna表达的抑制作用与非靶向性对照sna进行比较。制备含有由化合物6081构成的抗tnf反义链的sna。所有的寡核苷酸均使用标准的unilinker(chemgenes)以1微摩尔的规模合成。dna、rna、2’-o-me单体和六(乙二醇)间隔物从chemgenescorporation获得。胆固醇改性剂从glenresearch获得。连接是标准的磷酸二酯或用1∶1卢剔啶：acn中的0.2m苯乙酰基二硫化物(phenylacetyldisulfide，pads)作为硫化剂得到的硫代磷酸酯。以5’至3’方向在dmt脱去下进行合成。在合成之后，在55℃下使用氢氧化铵和乙醇的4∶1混合物将寡核苷酸从载体上切割下来并使其去保护16小时。将寡核苷酸通过离子交换高效液相色谱(hplc)技术纯化。使用idtoligoanalyzer来评估分子量和消光系数。使用基质辅助激光解吸/离子化(matrix-assistedlaserdesorption/ionization，maldi)进行寡核苷酸分子量的验证。通过微板读数器(biotek)上260nm处的uv吸光度与来自idtoligoanalyzer的计算的消光系数来确定寡核苷酸浓度。然后，将寡核苷酸用于制备抗tnf和对照sna。合成开始于将寡核苷酸在pbs中稀释至100μm。然后将寡核苷酸在4℃下避光储存过夜。由于极性溶剂对寡核苷酸的疏水性胆固醇尾的静电排斥，形成具有胆固醇核心和向外延伸的寡核苷酸的结构化胶束结构。将原代人角质形成细胞平板接种在96孔板中。第二天，将细胞用50ng/ml人重组tnf处理4小时，之后用寡核苷酸浓度为1000、333.3、100、33.3、10、3.3、1、0.33、0.1、0.03和0.01nm的oligoid6081或oligoid6093sna转染。使处理进行过夜。第二天，洗涤细胞，收集mrna，制备cdna，探测tnf和gapdh的表达，并计算百分比基因表达(图9)。检测了改变六乙二醇(hexaethyleneglycol，heg)的链长度对oligoid6081sna的反义活性的作用。制备具有提高heg间隔物长度的寡核苷酸并将其配制成自组装sna。将原代人角质形成细胞平板接种在96孔板中。第二天，将细胞用50ng/ml人重组tnf处理4小时，之后用寡核苷酸浓度为100、10、1和0.1nm的oligoid6080、6081、6082、6092、6083、6093、6094或6095sna转染。使处理进行过夜。第二天，洗涤细胞，收集mrna，制备cdna，并探测tnf和gapdh的表达，并计算百分比基因表达(图10)。表6：用于空心sna研究的寡核苷酸序列实施例4：测试在人银屑病皮肤中的离体活性使用标准的固相亚磷酰胺方法用mermade48(bioautomation)合成寡核苷酸。碱基和试剂购自glenresearch和chemgenes。所有的寡核苷酸均通过反相高效液相色谱(hplc)进行纯化，并使用基质辅助激光解吸/离子化(maldi)分析来测量分子量。合成的寡核苷酸列于表7中。如下合成脂质体：使用具有50nm孔的47mm直径的聚碳酸酯膜(sterlitech)挤出在磷酸缓冲盐水溶液(pbs)(137mmnacl、10m磷酸盐、2.7mmkcl，ph7.4，hyclone)中水合的1，2-二油酰基-sm-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)。使用malvernzetasizernano(malverninstruments)用动态光散射来测量脂质体直径。使用磷脂测定试剂盒(sigma)来确定脂质浓度。通过以100∶1的摩尔比混合寡核苷酸与脂质体并将该混合物在室温下孵育4小时来合成l-sna。使l-sna与未反应的材料分离，并利用具有30kd分子量截留改性聚醚砜(modifiedpolyethersulfone，mpes)空心纤维过滤器模块的minikrospilotisystem(spectrumlabs)使用切向流过滤(tangentialflowfiltration，tff)浓缩。使用磷脂测定试剂盒(sigma)分析含有l-sna的渗余物的脂质浓度。将l-sna在90％甲醇中稀释以溶解脂质体以释放表面功能化的寡核苷酸，所述寡核苷酸的浓度使用cary紫外/可见分光光度计(agilent)来测量。通过将寡核苷酸的浓度除以脂质体的浓度来计算与纳米颗粒缀合的寡核苷酸的平均数。使用malvernzetasizernano(malverninstruments)用动态光散射来测量l-sna直径。检测了施用含有oligo4831.1的l-sna对人银屑病离体皮肤培养物的基因调节作用。实验组列于表8中。从5位患有轻度至中度斑块状银屑病的不同患者的银屑病斑块中取出4个3mm直径的皮肤活组织。每个重复样取自不同的患者用于准确表示和针对患者特异性应答。外植体以以下方式进行培养。在corning12孔细胞培养过滤器插入物的中心打孔。将外植体的真皮(底部)部分推入过滤器的孔中，使得活检物嵌入过滤器中。使表皮暴露于内室中，并使真皮暴露于外室中。将这些过滤器浸入1ml细胞培养基(dmem、1％fbs、1.25μg/ml两性霉素b、50μg/ml庆大霉素、0.1u/ml青霉素/链霉素)中，使得真皮接触孔中的培养基并且表皮暴露于空气。以以下方处理培养物：使用移液管将2μl的每种化合物在pbs中施加到每个活检物的顶部(角质层)。将活检物在37℃下孵育16小时。立即使用球轴承匀浆器在填充有3mm直径的氧化锆球轴承的2ml螺旋盖小瓶中的300μlrlt缓冲液(qiagen)中将样品匀浆。将经匀浆的样品立即快速冷冻并在-80℃下储存。使用qiagen96孔rneasy板提取试剂盒处理裂解物。使用针对htnf和hgapdh的探针和引物(rochediagnostics)在lightcycler(rochediagnostics)上进行rtpcr，并测量tnf基因表达(图11)。表7：寡核苷酸序列表8：离体银屑病皮肤组和处理组组织来源oligo靶标类型浓度1患者aoligo4832.1对照l-sna100μm2患者aoligo4831.1tnfl-sna100μm3患者aoligo4831.1tnfl-sna10μm4患者aoligo4831.1tnfl-sna1μm5患者boligo4832.1对照l-sna100μm6患者boligo4831.1tnfl-sna100μm7患者boligo4831.1tnfl-sna10μm8患者boligo4831.1tnfl-sna1μm实施例5：测试抗tnfsna和l-sna在tnbs诱导的炎性肠病(ibd)小鼠模型中的效力在tnbs诱导的ibd小鼠模型中评估oligo227901的作用(表9)。合成在其3’端具有胆固醇的oligo227901(试剂来自chemgenes)。在实施例6中，我们示出了使用cryo-em来形成该寡核苷酸的自组装sna结构。此外，已通过将寡核苷酸添加到50nmdopc脂质体溶液中制备了oligo227901的l-sna形式。将s-san和l-san在碳酸氢盐溶液中调至ph9.5以用于动物。在6至7周大的balb/c小鼠中进行tnbs诱导的结肠炎的研究。为了诱导结肠炎，在研究的第0天每只动物直肠内施用10mg溶解在80％乙醇中的tnbs。对照小鼠由仅用载剂处理的小鼠和未经处理的原初小鼠组成。为了检测oligo227901的s-sna和l-sna对tnbs诱导的结肠炎研究的治疗效果，在诱导结肠炎之后，在第1、2、3和4天(总共4个剂量)通过经口管饲用化合物以100μg/剂量/小鼠至300μg/剂量/小鼠处理小鼠。每天监测小鼠多至7天以进行临床评分观察，并在第7天实施安乐死用于分析大体病理学。通过考虑以下参数来分配对照小鼠和经处理小鼠的临床评分：体重、粪便稠度和经直肠的出血以及在皮毛和腹部中观察到的任何异常。在实施安乐死之后从动物中移出的结肠的研究的最后一天，向对照和经处理的小鼠分配大体病理学评分。根据观察结果分配0至5的大体病理学评分：未检测到异常(评分0)；一处水肿和发红(评分1)；多于一处水肿和发红(评分2)；一处溃疡(评分3)；多于一处溃疡或严重溃疡(评分4)；以及多于一处水肿和发红并且一处或多于一处溃疡(评分5)。研究的结果示于图12中。使用单因素anova随后进行tukey事后检验来计算各组的统计学显著性。在仅tnbs的组中临床评分和大体病理学评分提高表明，直肠施用tnbs在除原初小鼠之外的所有组中均建立结肠炎疾病。对于在第0天用tnbs进行结肠炎诱导后在第1天至第4天用oligo227901的s-sna形式以总共4个剂量的200μg/剂量的量处理的组，观察到与相关载体剂相比平均临床评分显著降低。与载剂组相比，从第1天至第4天用4个剂量的s-sna(200μg/剂量和300μg/剂量)和l-sna(200μg/剂量)处理的动物显示大体病理学评分显著降低。总体而言，结果表明，经口施用s-sna对疾病症状具有积极效果，反映在较低的临床评分、较低的病理评分以及较高的动物存活率。表9：炎性肠病(ibd)研究中的寡核苷酸序列实施例6：自组装sna的cryo-tem对o1igo6307自组装球形核酸(s-sna)的溶液进行cryotem成像(表10)。s-sna使用2.4mm寡核苷酸溶液在磷酸缓冲盐水溶液(pbs)(137mmnacl、10m磷酸盐、2.7mmkcl，ph7.4，hyclone)中制备。将样品保存在400目铜载网上由有孔碳膜支撑的玻璃化冰(vitrifiedice)中。每个样品如下制备：将3μl的样品混悬液滴施加到已清洗的载网上，用滤纸吸干，并立即在液态乙烷中进行玻璃化。将载网储存在液氮下直至转移至电子显微镜用于成像。使用在120kev下操作的配备有feieagle4k×4kccd照相机的feitecnait12电子显微镜进行电子显微术。使用将载网维持在低于-170℃的温度的低温台(cryostage)将玻璃状冰载网转移到电子显微镜中。在110,000x(0.10nm/像素)的标称放大倍率下获取高放大倍率图像。在-5μm至-3μm的标称欠焦和10至40e-/a2的电子剂量下获取图像。在整个视野内，样品主要由很多小的约3nm的圆形颗粒构成(图13)。这些圆形颗粒对应于构成s-sna颗粒之疏水性核心的胆固醇分子簇的直径。小的约3nm的圆形颗粒被3至5nm的间隙均匀隔开，这可能对应于围绕疏水性核心的以球形取向排列的寡核苷酸冠(corona)(图14a)。寡核苷酸冠或壳限定s-sna的流体动力学半径(其为约13nm)，使得电子致密疏水性核心之间均匀间隔(图14b)。表10：寡核苷酸序列序列表<110>艾克西治愈有限公司<120>抗tnf化合物<130>a1107.70005wo00<140>尚未分配<141>2015-10-06<150>us62/060,424<151>2014-06-10<160>46<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>1catggtgtcctttccagg18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>2tcagtgctcatggtgtcc18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>3catgctttcagtgctcat18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>4tgggagtagatgaggtac18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>5ttgaccttggtctggtag18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>6gatggcagagaggaggtt18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>7ttatctctcagctccacg18<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>8atggagcaaaacccgcag18<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经硫代磷酸酯键修饰<400>9tgggagtagatgaggtac18<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经o甲基修饰<400>10ugggaguagaugagguac18<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经o甲基修饰<400>11auggagcaaaacccgcag18<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经硫代磷酸酯键修饰<400>12tgggagtagatgaggtac18<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经硫代磷酸酯键修饰<400>13atggagcaaaacccgcag18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经硫代磷酸酯键修饰<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经o甲基修饰<400>14ugggaguagaugagguac18<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经硫代磷酸酯键修饰<220><221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>经o甲基修饰<400>15auggagcaaaacccgcag18<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>经o甲基修饰<220><221>misc_feature<222>(7)..(13)<223>经硫代磷酸酯键修饰<220><221>misc_feature<222>(13)..(18)<223>经o甲基修饰<400>16ugggagtagatgagguac18<210>17<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>经o甲基修饰<220><221>misc_feature<222>(7)..(13)<223>经硫代磷酸酯键修饰<220><221>misc_feature<222>(13)..(18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