突变的免疫球蛋白‑结合多肽的制作方法

本发明涉及亲和色谱的领域，且更特别地涉及蛋白a的突变的免疫球蛋白-结合结构域，其可用于免疫球蛋白的亲和色谱。本发明还涉及突变的结构域的多聚体和涉及含有突变的结构域或多聚体的分离基质。

发明背景

免疫球蛋白代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及由此的价值已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的mab生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。

亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子，例如单克隆或多克隆抗体的纯化中的关键步骤之一而使用。一类特别感兴趣的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白，这样的相互作用是独立于抗体的抗原-结合特异性的。这样的试剂可广泛用来从不同的样本(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养物来源的原料)亲和色谱回收免疫球蛋白。这样的蛋白的例子是葡萄球菌蛋白a，其含有能够结合来自不同物种的igg免疫球蛋白的fc和fab部分的结构域。这些结构域通常被称为e-、d-、a-、b-和c-结构域。

基于葡萄球菌蛋白a(spa)的试剂由于它们的高亲和性和选择性，已发现广泛用于生物技术领域，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。目前，基于spa的亲和介质很可能是最广泛使用的从不同的样本(包括工业细胞培养上清液)分离单克隆抗体及其片段的亲和介质。因此，包含蛋白a-配体的各种基质是可市售获得的，例如，以天然蛋白a的形式(例如蛋白asepharose™,gehealthcare,uppsala,sweden)，并且还包含重组蛋白a(例如rproteinasepharose™,gehealthcare)。更特别地，在商业重组蛋白a产品中进行的基因操纵旨在促进其附接于支持体并提高配体的生产力。

这些应用，像其它亲和色谱应用，需要综合考虑污染物的确切去除。这样的污染物可以例如是在色谱程序中吸附在固定相或基质上的未洗脱的分子，例如非-希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质除去这样的污染物通常在第一次洗脱所需产物后进行，以在随后使用之前使基质再生。这样的除去通常涉及称为原位清洁(cip)的程序，其中能够从固定相洗脱污染物的试剂被使用。经常使用的一类这样的试剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是naoh，且其浓度可在从0.1至最多例如1m的范围内，这取决于污染的程度和性质。这个策略与基质暴露于具有13以上的ph-值的溶液有关。对于许多含有蛋白质亲和配体的亲和色谱基质，这样的碱性环境是非常苛刻的条件且随后由于配体对所涉及的高ph的不稳定性，导致能力下降。

因此，广泛的研究已经集中于工程改造的蛋白配体的开发，所述配体表现出改进的耐碱性ph-值的能力。例如，gülich等(susannegülich,martinlinhult,per-åkenygren,mathiasuhlén,sophiahober,journalofbiotechnology80(2000),169-178)提出经工程改造以改进链球菌白蛋白-结合结构域(abd)在碱性环境中的稳定性特性的蛋白。gülich等创建一种abd突变体，其中所有4个天冬酰胺残基已被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)替代。此外，gülich等报告他们的突变体表现出一种类似于天然蛋白的靶蛋白结合行为，并且含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露于碱性条件后显示出比使用亲本的非-工程改造的配体制备的柱更高的结合能力。因此，从中得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被替代，而对结构和功能无任何显著的影响。

最近的工作显示，也可对蛋白a(spa)进行修改以实现类似的特性。美国专利申请公布us2005/0143566，其通过引用以其整体结合到本文中，公开当至少一个天冬酰胺残基被突变为并非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予在至多约13-14的ph-值时，与亲本spa，例如spa的b-结构域，或蛋白z(一种源自spa的b-结构域的合成构建体)相比，增加的化学稳定性(us5,143,844，通过引用以其整体结合在此)。作者显示当这些突变的蛋白用作亲和配体时，分离介质如所期望的可更好地耐受使用碱性试剂的清洁程序。为增加碱稳定性目的，蛋白a结构域的另外的突变还已经公开于wo2008/039141、jp2006304633a、ep1992692a1,ep2202310a2、wo2010/110288、wo2012/086660、wo2012/083425、wo2012/087230和wo2014/146350中，其全部通过引用以其整体结合到本文中。然而，目前可获得的突变体仍然是对碱性ph敏感的，并且在清洁期间的naoh浓度通常被限制在0.1m，这意味着完全的清洁难以实现。较高的naoh浓度(这将改进清洁)导致不可接受的能力丧失。

因此，本领域仍有获得含有蛋白配体的分离基质的需要，所述蛋白配体具有对碱性清洁程序的进一步改进的稳定性。

发明概述

本发明的一个方面是提供具有改进的碱稳定性的多肽。这用如在权利要求1中定义的多肽实现。

一个优点是碱稳定性比亲本多肽有改进，并维持对免疫球蛋白和其它含有fc的蛋白的高选择性结合。

本发明的第二个方面是提供具有改进的碱稳定性的多聚体，其包含多个多肽。这用如在权利要求中定义的多聚体实现。

本发明的第三个方面是提供编码具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的核酸或载体。这用如在权利要求中定义的核酸或载体实现。

本发明的第四个方面是提供能够表达具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的表达系统。这用如在权利要求中定义的表达系统实现。

本发明的第五个方面是提供能够选择性地结合免疫球蛋白和其它含有fc的蛋白并表现出改进的碱稳定性的分离基质。这用如在权利要求中定义的分离基质实现。

本发明的第六个方面是提供一种分离免疫球蛋白或其它含有fc的蛋白的有效和经济的方法。这用如在权利要求中定义的方法实现。

本发明的更合适的实施方案在从属权利要求中描述。

定义

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并被理解为也包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。

术语“fc-结合多肽”和“fc-结合蛋白”分别指能够结合抗体的可结晶部分(fc)的多肽或蛋白并包括例如蛋白a和蛋白g，或维持所述结合特性的其任何片段或融合蛋白。

术语“接头”在本文中意指使多聚体中的两个多肽单位，单体或结构域彼此连接的元件。

术语“间隔区”在本文中指将多肽或多肽多聚体连接于支持体的元件。

附图简述

图1显示如由seqidno:1-7和51-52定义的fc-结合结构域的比对。

图2显示来自实施例2的、对于偶联于spr生物传感器芯片的亲本和突变的四聚体zvar(seqidno7)多肽变体的碱稳定性的结果。

图3显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体zvar(seqidno7)多肽变体的碱稳定性(0.5mnaoh)的结果。

图4显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体zvar(seqidno7)多肽变体的碱稳定性(1.0mnaoh)的结果。

实施方案的详细描述

一方面，本发明公开一种fc-结合多肽，其包含葡萄球菌蛋白a(spa)的fc-结合结构域的突变体，或基本由葡萄球菌蛋白a(spa)的fc-结合结构域的突变体组成，所述突变体由以下序列限定，或具有与以下序列至少90%、至少95%或至少98%的同一性：如在图1中说明的seqidno:1(e-结构域)、seqidno:2(d-结构域)、seqidno:3(a-结构域)、seqidno:22(变体a-结构域)、seqidno:4(b-结构域)、seqidno:5(c-结构域)、seqidno:6(蛋白z)、seqidno:7(zvar)、seqidno51(无接头区氨基酸1-6的zvar)或seqidno52(无接头区氨基酸1-6的c-结构域)，其中至少在对应于seqidno:4-7中11位的位置*的天冬酰胺(或丝氨酸，在seqidno2的情况下)残基已经突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。蛋白z(seqidno:6)是如在us5143844中公开的突变型b-结构域，而seqidno7表示蛋白z的另外的突变型变体，在此称为zvar，具有突变n3a、n6d、n23t。seqidno:22是来自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株n315的蛋白a的a-结构域的天然变体(具有a46s突变，使用图1位置术语)。这些结构域中的n11突变赋予与亲本结构域/多肽比较的改进的碱稳定性，而不损害免疫球蛋白-结合特性。因此，多肽也可被描述为fc-或免疫球蛋白-结合多肽，或者备选地描述为fc-或免疫球蛋白-结合多肽单位。

*纵贯本说明书，使用图1的氨基酸残基位置编号约定，而位置编号被指定为相对应于seqidno4-7中的编号。

在备选的语言中，本发明公开包含如由seqidno53限定的，或与seqidno53具有至少90%、至少95%或至少98%同一性的序列的fc-结合多肽。

seqidno53

kex1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fix6x7lkdx8psx9sx10x11x12laeakx13x14ndaqapk

其中彼此独立地：

x1=a或q

x2=e、k、y、t、f、l、w、i、m、v、a、h或r

x3=h或k

x4=a或n

x5=a或g

x6=q或e

x7=s或k

x8=e或d

x9=q或v

x10=k、r或a

x11=a、e或n

x12=i或l

x13=k或r

x14=l或y

n11(x2)突变(如n11e或n11k突变)可以是唯一的突变或多肽还可包含另外的突变，例如对应于seqidno:4-7的位置3、6、9、10、15、18、23、28、29、32、33、36、37、40、42、43、44、47、50、51、55和57的至少一个位置的取代。在这些位置的一个或多个中，原始氨基酸残基可以例如用不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸取代。原始氨基酸残基可以例如用丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸取代。而且，一个或多个氨基酸残基可以例如从位置1-6和/或从位置56-58缺失。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中9位的位置的氨基酸残基(x1)是并非谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸，例如丙氨酸。在位置9和11的突变的组合提供特别好的碱稳定性，如由实施例显示的。在特定的实施方案中，在seqidno:7中，在9位的氨基酸残基是丙氨酸和在11位的氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酸，例如赖氨酸。在9位的突变在同时待审的申请pct/se2014/050872中也有讨论，其通过引用以其整体结合到本文中。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中50位的位置的氨基酸残基(x13)是精氨酸或谷氨酸。

在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7的3位的位置的氨基酸残基是丙氨酸和/或对应于seqidno:4-7中6位的位置的氨基酸残基是天冬氨酸。在位置3和6的氨基酸残基之一可以是天冬酰胺，而在可供选择的实施方案中，在位置3和6的两个氨基酸残基可以是天冬酰胺。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中43位的位置的氨基酸残基(x11)是丙氨酸或谷氨酸，例如丙氨酸。在特定的实施方案中，在seqidno:7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸/谷氨酸，而在43位的氨基酸残基是丙氨酸或谷氨酸。

在某些实施方案中，在对应于seqidno:4-7的28位的位置的氨基酸残基(x5)是丙氨酸或天冬酰胺，例如丙氨酸。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中40位的位置的氨基酸残基(x9)选自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸，或选自谷氨酸和缬氨酸。在特定的实施方案中，在seqidno:7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和谷氨酸，而在40位的氨基酸残基是缬氨酸。任选地，在43位的氨基酸残基则可以是丙氨酸或谷氨酸。

在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7中42位的位置的氨基酸残基(x10)是丙氨酸、赖氨酸或精氨酸。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中18位的位置的氨基酸残基(x3)是赖氨酸或组氨酸，例如赖氨酸。

在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7中33位的位置的氨基酸残基(x7)是赖氨酸或丝氨酸，例如赖氨酸。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中37位的位置的氨基酸残基(x8)是谷氨酸或天冬氨酸，例如谷氨酸。

在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7中51位的位置的氨基酸残基(x14)是酪氨酸或亮氨酸，例如酪氨酸。

在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7中44位的位置的氨基酸残基(x12)是亮氨酸或异亮氨酸。在特定的实施方案中，在seqidno:7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸/谷氨酸，而在44位的氨基酸残基是异亮氨酸。任选地，在43位的氨基酸残基则可以是丙氨酸或谷氨酸。

在一些实施方案中，在对应于seqidno:4-7的位置1、2、3和4或位置3、4、5和6的位置的氨基酸残基已经缺失。在这些实施方案的特定变体中，亲本多肽是蛋白a的c结构域(seqidno:5)。天然c结构域上的这些缺失的作用在us9018305和us8329860中描述，其通过引用以其整体结合到本文中。

在某些实施方案中，在seqidno4-7(例如在seqidno7)中的突变选自：n11k；n11e；n11y；n11t；n11f；n11l；n11w；n11i；n11m；n11v；n11a；n11h；n11r；n11e,q32a；n11e,q32e,q40e；n11e,q32e,k50r；q9a,n11e,n43a；q9a,n11e,n28a,n43a；q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i；q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i；n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r；q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i和q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i。这些突变提供特别高的碱稳定性。在seqidno4-7，例如在seqidno7中的突变，也可选自n11k；n11y；n11f；n11l；n11w；n11i；n11m；n11v；n11a；n11h；n11r；q9a,n11e,n43a；q9a,n11e,n28a,n43a；q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i；q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i；q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i；n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i和q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r。

在一些实施方案中，多肽包含选自以下的序列或基本由选自以下的序列组成：seqidno8、seqidno9、seqidno10、seqidno11、seqidno12、seqidno13、seqidno14、seqidno15、seqidno16、seqidno23、seqidno24、seqidno25、seqidno26、seqidno27、seqidno28、seqidno29、seqidno36、seqidno37、seqidno38、seqidno39、seqidno40、seqidno41、seqidno42、seqidno43、seqidno44、seqidno45、seqidno46、seqidno47、seqidno48、seqidno49和seqidno50。它可例如包含选自以下的序列或基本由选自以下的序列组成：seqidno8、seqidno9、seqidno10、seqidno11、seqidno16、seqidno23、seqidno24、seqidno25、seqidno26、seqidno27、seqidno28和seqidno29。它也可包含选自以下序列或基本由选自以下序列组成：seqidno8、seqidno9、seqidno10、seqidno11、seqidno16、seqidno23、seqidno24、seqidno25、seqidno27、seqidno28、seqidno38、seqidno40；seqidno41；seqidno42；seqno43、seqidno44、seqidno45、seqidno46、seqidno47和seqidno48。多肽可例如由选自以上各组或选自这些组的亚集的序列限定，但它还可包含另外的n-和/或c-末端的氨基酸残基，如在n-末端的前导序列和/或在c-末端的尾序列。

seqidno8zvar(q9a,n11e,n43a)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapk

seqidno9zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapk

seqidno10zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapk

seqidno11zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapk

seqidno12zvar(n11e,q32a)

vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafiaslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno13zvar(n11e)

vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno14zvar(n11e,q32e,q40e)

vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafieslkddpsesanllaeakklndaqapk

seqidno15zvar(n11e,q32e,k50r)

vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafieslkddpsqsanllaeakrlndaqapk

seqidno16zvar(n11k)

vdakfdkeqqkafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno23zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)

vdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapk

seqidno24zvar(q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapk

seqidno25zvar(q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)

vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqraafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapk

seqidno26zvar(n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)

vdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakklndaqapk

seqidno27zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)

vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakklndaqapk

seqidno28zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r)

vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakrlndaqapk

seqidno29zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r)

vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapk

seqidno36b(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)

adnkfnkeaqeafyeilhlpnlneeqrngfiqslkddpsvskailaeakklndaqapk

seqidno37c(q9a,n11e,e43a)

adnkfnkeaqeafyeilhlpnlteeqrngfiqslkddpsvskailaeakklndaqapk

seqidno38zvar(n11y)

vdakfdkeqqyafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno39zvar(n11t)

vdakfdkeqqtafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno40zvar(n11f)

vdakfdkeqqfafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno41zvar(n11l)

vdakfdkeqqlafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno42zvar(n11w)

vdakfdkeqqwafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno43zvar(n11i)

vdakfdkeqqiafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno44zvar(n11m)

vdakfdkeqqmafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno45zvar(n11v)

vdakfdkeqqvafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno46zvar(n11a)

vdakfdkeqqaafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno47zvar(n11h)

vdakfdkeqqhafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno48zvar(n11r)

vdakfdkeqqrafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk

seqidno49zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapk

seqidno50zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)

vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapk

在第二个方面，本发明公开一种多聚体，其包含由以上公开的任何实施方案限定的多个多肽单位，或基本由由以上公开的任何实施方案限定的多个多肽单位组成。多聚体可以例如是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。它可以是同源多聚体，其中多聚体中的所有单位是相同的或它可以是异源多聚体，其中至少一个单位与其它的不同。有利地，多聚体中的所有单位，例如通过包含以上公开的突变，都是碱稳定性的。多肽可直接通过多肽的c-末端和n-末端之间的肽键彼此连接。或者，多聚体中的两个或更多个单位可通过包含低聚物或多聚物种类的接头，例如包含至多15或30个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的元件连接。这尤其是对于seqidno51和52的突变和对于seqidno53多肽的情况，其中接头的具体实例可以例如是vdakfd或adnkfn，例如vdakfd。这样的接头的性质应该优选不会破坏蛋白质单位的空间构象的稳定性。这可例如通过避免脯氨酸在接头中的存在来实现。而且，所述接头还应该优选在碱性环境中是足够稳定的，不会损害突变型蛋白单位的特性。为此目的，如果接头不含天冬酰胺，则是有利的。如果接头不含谷氨酰胺，则可能是额外有利的。多聚体可进一步在n-末端包含多个氨基酸残基，其例如源自克隆过程，或构成来自裂解的信号传导序列的残基。另外的氨基酸残基的数目可以例如是15或更少，例如10或更少或5或更少。作为一个具体实例，多聚体可包含在n-末端的aq序列。

在某些实施方案中，多聚体可包含选自以下序列，或基本由选自以下序列组成：seqidno17、seqidno18、seqidno19、seqidno20、seqidno30、seqidno31、seqidno32、seqidno33、seqidno34和seqidno35。这些序列在下面列出并称为亲本(突变)n，其中n是多聚体中的单体单位的数目。

seqidno17zvar(q9a,n11e,n43a)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkc

seqidno18zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkc

seqidno19zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkc

seqidno20zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkc

seqidno30zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)4

aqgtvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkc

seqidno31zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r)4

aqgtvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkc

seqidno32zvar(q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkc

seqidno33zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)6

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkc

seqidno34zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkc

seqidno35zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)4

aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkc

在一些实施方案中，如上文公开的多肽和/或多聚体还包含在c-末端或n-末端的一个或多个偶合元件，其选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。偶合元件还可位于离开c-末端或n-末端的1-5个氨基酸残基内，例如1-3或1-2个氨基酸残基内。偶合元件可以例如是在c-末端的单一半胱氨酸。偶合元件可直接连接于c-或n-末端，或它/它们可通过包含至多15个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的一段序列(stretch)连接。这段序列优选在碱性环境中应该也是足够稳定的，不损害突变型蛋白的特性。为此目的，如果这段序列不含天冬酰胺，则是有利的。如果这段序列不含谷氨酰胺，则可能是额外有利的。具有c-末端半胱氨酸的优点是蛋白的终点偶合可通过半胱氨酸硫醇与支持体上的亲电子基团的反应完成。这提供对于结合能力是重要的偶联蛋白的优越的移动性。

多肽或多聚体的碱稳定性可通过使之偶合于spr芯片，例如如在实施例中所述，使用例如nhs-或马来酰亚胺偶合化学反应偶合于biacorecm5传感器芯片，并在指定温度下，例如22+/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，通常使用多克隆人igg测量芯片的免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5mnaoh中进行许多个10min的循环，例如100、200或300个循环。于22+/-2℃，在0.5mnaoh中在100个10min的孵育循环后，基质的igg能力可以是至少55，例如至少60、至少80或至少90%的孵育前igg能力。或者，对于如上测量的特定突变体在100个循环后的剩余igg能力可与对亲本多肽/多聚体的剩余的igg能力比较。在这种情况下，对于突变体的剩余的igg能力可以是至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%的亲本多肽/多聚体。

在第三方面，本发明公开编码依据以上公开的任何实施方案的多肽或多聚体的核酸。因此，本发明涵盖编码多肽或多聚体的本核酸序列的所有形式，例如rna和dna。本发明涵盖载体，例如质粒，其除了编码序列，还包含用于表达依据本发明的多肽或多聚体所需的信号序列。在一个实施方案中，载体包含编码依据本发明的多聚体的核酸，其中编码各个单位的独立的核酸可具有同源或异源的dna序列。

在第四方面，本发明公开表达系统，其包含如上公开的核酸或载体。表达系统可以例如是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如大肠杆菌(e.coli)或芽孢杆菌(bacillussp)，其已被修饰为表达本发明的多肽或多聚体。在可供选择的实施方案中，表达系统是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，或哺乳动物细胞，例如cho细胞。

在第五方面，本发明公开一种分离基质，其中依据以上公开的任何实施方案的多个多肽或多聚体已经偶联于固体支持体。这样一种基质可用来分离免疫球蛋白或其它含有fc的蛋白，并且由于多肽/多聚体的改进碱稳定性，基质将耐受在清洁期间的高碱性的条件，这对于长期重复用于生物处理分离装置是至关重要的。基质的碱稳定性可通过通常于特定的温度下，例如22+/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，使用多克隆人igg测量免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5m或1.0mnaoh中进行一定数目的15min循环，例如100、200或300个循环，对应于25、50或75h的总孵育时间。于22+/-2℃，在0.5mnaoh中经96-100个15min孵育循环或24或25h的总孵育时间后，基质的igg能力可以是至少80，例如至少85、至少90或至少95%的孵育前igg能力。于22+/-2℃，在1.0mnaoh中经24h的总孵育时间后，基质的能力可以是至少70，例如至少80或至少90%的孵育前igg能力。

如技术人员应该理解的，表达的多肽或多聚体在被固定到支持体之前，应被纯化至合适的程度。这样的纯化方法是本领域熟知的，且基于蛋白的配体固定于支持体容易使用标准方法进行。合适的方法和支持体将在下文更详细地讨论。

依据本发明的基质的固体支持体可以是任何合适的熟知的种类。常规亲和分离基质通常具有有机性质并基于亲水性表面暴露于所用的水性介质的聚合物，即暴露它们的外表面和(如果存在)也在内表面上的羟基(-oh)、羧基(-cooh)、甲酰胺基(-conh2，可能呈现为n-取代的形式)、氨基(-nh2，可能呈现为取代的形式)、寡-或聚氧乙烯基团。固体支持体可适合为多孔的。孔隙率可以表示为kav或kd值(特定尺寸的探针分子可获得的孔体积的分数)，其通过逆尺寸排阻色谱，例如依据在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法测量。按照定义，kd和kav值二者总是在0-1范围内。kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用mw110kda的葡聚糖作为探针分子测量的。其优点是支持体具有大分数的孔，所述孔能够容纳本发明的多肽/多聚体和结合于多肽/多聚体的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向结合位点和离开结合位点的质量输运。

多肽或多聚体可经由常规偶合技术，利用存在于配体中的例如硫醇基、氨基和/或羧基，附接于支持体。双环氧化物(bisepoxides)、表氯醇、cnbr、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)等是熟知的偶合试剂。在支持体和多肽/多聚体之间，可引入一种称为间隔区的分子，其改进多肽/多聚体的可利用性并促进多肽/多聚体化学偶合于支持体。取决于多肽/多聚体的性质和偶合条件，偶合可以是多点偶合(例如经由多个赖氨酸)或单点偶合(例如经由单一半胱氨酸)。或者，多肽/多聚体可通过非-共价键合，例如物理吸附或生物特异性吸附，附接于支持体。

在一些实施方案中，基质包含5-25，例如5-20mg/ml、5-15mg/ml、5-11mg/ml或6-11mg/ml的偶合于支持体的多肽或多聚体。偶合的多肽/多聚体的量可受在偶合过程中所用的多肽/多聚体的浓度，受所用的激活和偶合条件和/或受所用支持体的孔结构的控制。作为一般规则，基质的绝对结合能力随着偶合多肽/多聚体的量增加，至少达到其中孔变得受偶合的多肽/多聚体显著限制的点。每mg偶合的多肽/多聚体的相对结合能力将在高偶合水平上降低，导致在以上指定范围内的成本效益最优。

在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键偶联于支持体。执行这样的偶联的方法是本领域熟知的并由本领域技术人员使用标准技术和设备容易地进行。硫醚键是挠性和稳定的，且一般适用于亲和色谱。特别是当硫醚键经由多肽或多聚体上的末端或接近-末端的半胱氨酸残基时，偶联的多肽/多聚体的移动性增加，这提供了改进的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，多肽/多聚体经由如上所述的蛋白上提供的c-末端半胱氨酸偶联。这允许半胱氨酸硫醇有效偶联于支持体上的亲电子基团，例如环氧化物基团、卤代醇基团等，导致硫醚桥偶联。

在某些实施方案中，支持体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可激活的)羟基且它们对用于生物处理的碱性清洁溶液一般是稳定的。

在一些实施方案中，支持体包含琼脂或琼脂糖。用于本发明的支持体可依据标准方法，例如逆悬浮凝胶化(inversesuspensiongelation)(shjertén:biochimbiophysacta79(2),393-398(1964)容易地制备。或者，碱性基质是可市售获得的产品，例如以sepharose™ff(gehealthcare)商品名市售的交联的琼脂糖珠。在对于大规模分离是特别有利的实施方案中，使用在us6602990或us7396467(通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法，支持体经修改以增加其刚性，因而使基质更适合于高流速。

在某些实施方案中，支持体，例如多糖或琼脂糖支持体被交联，例如用羟烷基醚交联。产生这样的交联的交联剂可以是例如表卤代醇像表氯醇、双环氧化物像丁二醇二缩水甘油醚、烷基化剂像烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚。交联对于支持体的刚性是有益的并改进化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定性的且不引起显著非特异性吸附。

或者，固体支持体是基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物的情况下，例如基于二乙烯基和单乙烯基-取代的苯的基质，基质的表面常常被亲水化，以使如上定义的亲水性基团暴露于周围的水性液体。这样的聚合物依据标准方法，见例如“styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization”(rarshady:chimicael'industria70(9),70-75(1988))容易地生产。或者，使用可市售获得的产品，例如source™(gehealthcare)。在另一个替代中，依据本发明的固体支持体包含无机性质的支持体，例如二氧化硅、氧化锆等。

在再另一个实施方案中，固体支持体呈现为另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或滤器(如膜或深过滤基质)。

关于依据本发明的基质的形状，在一个实施方案中，基质呈现为多孔的整料的形式。在可供选择的实施方案中，基质以可以是多孔或无孔的串珠或粒子形式呈现。以串珠或粒子形式呈现的基质可用作填充床或以悬浮的形式使用。悬浮的形式包括称为膨胀床和纯粹的悬浮液的那些，其中颗粒或珠自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常遵循具有浓度梯度的常规色谱。在纯粹的悬浮液的情况下，使用分批的模式。

在第六方面，本发明公开一种分离免疫球蛋白的方法，其中使用如以上公开的分离基质。

在某些实施方案中，该方法包含以下步骤：

a)使包含免疫球蛋白的液体样本与如以上公开的分离基质接触，

b)用洗涤液体洗涤所述分离基质，

c)用洗脱液体从分离基质洗脱免疫球蛋白，和

d)用清洁液体清洁分离基质，所述清洁液体可备选地称为原位清洁(cip)液体，例如接触(孵育)至少10min的时间。

该方法还可包含以下步骤：在步骤a)之前，提供依据上文描述的任何实施方案的亲和分离基质和提供包含免疫球蛋白和至少一种其它物质的溶液作为液体样本，以及在步骤c)之后，回收洗脱液和任选地使洗脱液经历进一步的分离步骤，例如通过阴离子或阳离子交换色谱、多峰色谱和/或疏水相互作用色谱。液体样本、洗涤液体和洗脱液体的合适组成，以及执行分离的一般条件是亲和色谱领域且特别是蛋白a色谱领域熟知的。包含含有fc的蛋白和至少一种其它物质的液体样本可包含宿主细胞蛋白(hcp)，例如cho细胞、大肠杆菌或酵母蛋白。cho细胞和大肠杆菌蛋白的含量可便利地通过针对这些蛋白质的免疫分析法测定，如得自cygnustechnologies的chohcp或大肠杆菌hcpelisa试剂盒。宿主细胞蛋白或cho细胞/大肠杆菌蛋白可在步骤b)期间被解除吸附。

洗脱可通过使用用于从蛋白a介质洗脱的任何合适的溶液进行。这可以例如是具有ph5或更低，例如ph2.5-5或3-5的溶液或缓冲液。它在一些情况下也可以是具有ph11或更高，例如ph11-14或ph11-13的溶液或缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲梯度包含至少一种单-、二-或三官能的羧酸或这样的羧酸的盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲梯度包含至少一个选自乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和甲酸盐的阴离子种类。

在一些实施方案中，清洁液体是碱性的，例如具有13-14的ph。这样的溶液提供基质的有效的清洁，特别是在区间的上端。

在某些实施方案中，清洁液体包含0.1-2.0mnaoh或koh，例如0.5-2.0或0.5-1.0mnaoh或koh。这些是有效的清洁溶液，并且当naoh或koh浓度是在0.1m以上或至少0.5m时尤其如此。本发明的多肽的高稳定性使得使用这样的强碱性溶液成为可能。

该方法还可包括用消毒液体消毒基质的步骤，所述消毒液体可例如包含过氧化物，例如过氧化氢和/或过酸，例如过乙酸或过甲酸。

在一些实施方案中，步骤a)-d)重复至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次。这对工艺经济是重要的，因为基质可重复利用多次。

步骤a)-c)也可重复至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次，步骤d)在多个步骤c)的情况后进行，以致步骤d)进行至少10次，例如至少50次。步骤d)可例如在每第2个至第20个步骤c)的情况进行。

实施例

蛋白的诱变

位点定向诱变通过两-步骤pcr，使用编码突变的寡核苷酸进行。作为模板，使用含有z、b或者c的单一结构域的质粒。pcr片段被连接到大肠杆菌表达载体。使用dna测序以验证插入片段的正确序列。

为形成突变体的多聚体，使用位于b、c或z结构域的起始密码子(gtagac)的acci位点，其对应于氨基酸vd。用acci和磷酸酶处理，消化用于单体结构域的载体。设计对每个变体特异性的acci粘性-末端引物，而两个重叠的pcr产物从每个模板生成。纯化pcr产物并通过在2%琼脂糖凝胶上比较pcr产物估测浓度。等量的成对pcr产物在连接缓冲液中杂交(90℃->25℃，45min)。生成的产物组成可能被连接到acci位点的大约¼的片段(正确的pcr片段和/或消化的载体)。连接和转化后，集落经pcr筛选以鉴定含有所需突变体的构建体。通过dna测序验证阳性克隆。

构建体表达和纯化

构建体通过大肠杆菌k12在标准培养基中的发酵在细菌周质中表达。发酵后，细胞经热处理以释放周质内容物到培养基中。释放到培养基中的构建体用具有0.2µm孔径的膜，通过微滤回收。

每个构建体，现在在来自过滤步骤的渗透液中，通过亲和纯化。将渗透液装载到含有固定化igg(iggsepharose6ff,gehealthcare)的色谱介质中。装载的产物用磷酸盐缓冲盐水洗涤并通过降低ph洗脱。

将洗脱池调节至中性ph(ph8)并通过加入二硫苏糖醇还原。然后将样本装载到阴离子交换器中。洗涤步骤后，在nacl梯度中洗脱构建体以使其与任何污染物分离。洗脱池通过超滤被浓缩至40-50mg/ml。应该注意到，固定化igg介质上的构建体的成功亲和纯化表明涉及的构建体具有对igg的高亲和力。

纯化的配体用rpclc-ms分析以确定纯度并确定对应于期望值(基于氨基酸序列)的分子量。

实施例1

表1中列出的纯化的单体配体(还包含在n-末端的aqgt前导序列和在c末端的半胱氨酸)，使用gehealthcare的胺偶合试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶合)，以足以在biacore表面等离子体共振(spr)仪器(gehealthcare,sweden)中给出约200-1500ru的信号强度的量，在biacorecm5传感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的igg结合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(cip)，即于室温(22+/-2℃)下，用500mmnaoh冲洗10分钟。重复96-100个循环并在每个循环后按剩余的igg结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。结果示于表1中并表明至少配体zvar(n11k)1、zvar(n11e)1、zvar(n11y)1、zvar(n11t)1、zvar(n11f)1、zvar(n11l)1、zvar(n11w)1、zn11i)1、zvar(n11m)1、zvar(n11v)1、zvar(n11a)1、zvar(n11h1)、zvar(n11r)1、zvar(n11e,q32a)1、zvar(n11e,q32e,q40e)1和zvar(n11e,q32e,k50r)1、zvar(q9a,n11e,n43a)1、zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)1、zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)1、zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1、zvar(q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i)1、zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(n11k、h18k、d37e、a42r、n43a、l44i)1、zvar(q9a、n11k、h18k、d37e、a42r、n43a、l44i)1和zvar(q9a、n11k、h18k、d37e、a42r、n43a、l44i、k50r)1具有与亲本结构zvar1(用作参考)比较的改进的碱稳定性。此外，配体b(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1和c(q9a,n11e,e43a)1具有与用作参考的亲本b和c结构域比较的改进的稳定性。

表1.用biacore(0.5mnaoh)评价的单体配体。

实施例2

表2中列出的纯化的四聚体和六聚体配体，使用gehealthcare的胺偶合试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶合)，以足以在biacore仪器(gehealthcare,sweden)中给出约200-1500ru的信号强度的量，在biacorecm5传感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的igg结合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(cip)，即于室温(22+/-2℃)下，用500mmnaoh冲洗10分钟。重复300个循环并在每个循环后按剩余的igg结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。结果示于表2和图2中并表明至少配体zvar(q9a,n11e,n43a)4、zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)4,zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)4和zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)4,zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)4和zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)4具有与亲本结构zvar4(其用作参考)比较的改进的碱稳定性。六聚体配体zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)6也具有与用作参考的亲本结构zvar6比较的改进的碱稳定性。

表2.用biacore(0.5mnaoh)评价的四聚体和六聚体配体

实施例3

使用1mnaoh代替在实施例2中的500mm，用3个配体的100个cip循环重复实施例2。结果示于表3并表明所有3个配体在1mnaoh中也具有与用作参考的亲本结构zvar4比较的改进的碱稳定性。

表3.用biacore(1mnaoh)评价的四聚体配体。

实施例4

表2的纯化的四聚体配体(全部具有另外的n-末端半胱氨酸)使用下面描述的方法在琼脂糖珠上固定化并对能力和稳定性进行评价。结果示于表4和图3。

表4.在柱(0.5mnaoh)中评价的具有四聚体配体的基质。

激活

所用的基础基质是依据us6602990的方法制备的85微米(体积-加权的，d50v)直径中值的刚性交联琼脂糖珠，并且依据在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法，对于mw110kda的葡聚糖具有对应于逆凝胶过滤色谱kav值0.70的孔径。

于25℃，将25ml(g)排干的基础基质、10.0ml蒸馏水和2.02gnaoh在带有机械搅拌器的100ml烧瓶中混合10min。加入4.0ml表氯醇并进行反应2小时。激活的凝胶用10个凝胶沉降体积(gv)的水洗涤。

偶合

向在50mlfalcon试管中的20ml配体溶液(50mg/ml)中加入169mgnahco3、21mgna2co3、175mgnacl和7mgedta。将falcon试管置于辊式摇床上5-10min，然后加入77mgdte。还原进行>45min。然后将配体溶液在用sephadexg-25填充的pd10柱上脱盐。脱盐溶液中的配体含量通过测量276nmuv吸收来确定。

激活的凝胶用3-5gv{0.1m磷酸盐/1mmedtaph8.6}洗涤，然后依据在us6399750中描述的方法偶联配体。用于实验的所有缓冲液用氮气脱气至少5-10min。凝胶的配体含量可通过改变配体溶液的量和浓度控制。

固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xgv。混合凝胶+1gv{0.1m磷酸盐/1mmedta/10%硫代甘油ph8.6}，在室温下，将试管放置于振动台上过夜。然后用3xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.6}和0.5mhac交替洗涤凝胶，然后用8-10xgv蒸馏水洗涤。将凝胶样本送至外部实验室用于氨基酸分析并从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。

蛋白

将gammanorm165mg/ml(octapharma)在平衡缓冲液中稀释至2mg/ml。

平衡缓冲液

pbs磷酸盐缓冲液10mm+0.14mnacl+0.0027mkcl,ph7,4(medicago)

吸附缓冲液

pbs磷酸盐缓冲液10mm+0.14mnacl+0.0027mkcl,ph7,4(medicago)

洗脱缓冲液

100mm乙酸盐ph2.9

动态结合能力

将2ml树脂填充到tricorn™5100柱中。穿透能力用äktaexplorer10系统，以6分钟的滞留时间(0.33ml/min流速)测定。使平衡缓冲液通过旁路柱，直到获得稳定的基线。这在自动归零之前进行。将样本施加于柱直至获得100%uv信号。然后，再次应用平衡缓冲液直至获得稳定的基线。

将样本装载于柱直至达到85%的最大吸光度的uv信号。然后用5柱体积(cv)的平衡缓冲液，以0.5ml/min的流速洗涤柱。蛋白用5cv洗脱缓冲液，以0.5ml/min的流速洗脱。然后柱用0.5mnaoh，以0.2ml/min的流速清洁并用平衡缓冲液再平衡。

为计算在10%时的穿透能力，采用以下方程。即是，装载到柱中直至柱流出液中的igg浓度是进料igg浓度的10%的igg的量。

a100%=100%uv信号；

asub=来自非-结合igg亚类的吸光度的贡献；

a(v)=在给定的应用体积的吸光度；

vc=柱体积；

vapp=直至10%穿透的应用体积；

vsys=系统死体积；

c0=进料浓度。

计算在10%穿透时的动态结合能力(dbc)。对10和80%穿透，计算动态结合能力(dbc)。

cip-0.5mnaoh

在重复暴露于碱性清洁溶液之前和之后测定10%穿透dbc(qb10)。每个循环包括用0.5mnaoh，以0.5/min的速率泵吸通过柱20min的cip步骤，此后柱静置4h。暴露于室温(22+/-2℃)下发生。所述孵育后，用平衡缓冲液，以0.5ml/min的流速洗涤柱20min。表4显示6个4h的循环(即暴露于0.5mnaoh的24h累积时间)后的剩余能力，以绝对数值和相对于初始能力的相对数值表示。

实施例5

用示于表5中的四聚体配体重复实施例4，但用用于cip步骤的1.0mnaoh代替0.5m。结果示出于表5和图4中。

表5.在柱-1.0mnaoh中评价具有四聚体配体的基质

本书面说明书使用实施例来公开本发明，包括最好的模式，并且还能使本领域的任何技术人员实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统并执行任何结合的方法。本发明的可专利性范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员可设想的其它实施例。这样的其它实施例意欲落入权利要求书的范围内，只要它们具有与权利要求书的文字语言相同的结构要素，或它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等同结构要素。本文中提及所有专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们各自单独结合到本文中一样。