本发明涉及一种特异性结合bont/e切割的snap-25的多克隆或单克隆抗体。此外，本发明提供一种直接测定bont/e在细胞中的生物活性的方法，其包括以下步骤：a)在允许bont/e发挥其生物活性的时间和条件下用bont/e温育对bont/e中毒敏感的细胞；b)固定所述细胞，并且任选地用洗涤剂使所述细胞透化；c)使所述细胞至少与特异性结合非切割的和bont/e切割的snap-25的第一捕获抗体以及至少与特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与指定底物结合的条件下接触，其中所述第二捕获抗体是本发明的抗体；d)使所述细胞至少与特异性结合所述第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，因而形成第一检测复合物，以及至少与特异性结合所述第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，因而形成第二检测复合物，并且其中所述第一检测抗体不同于所述第二检测抗体；e)测定步骤d)的所述第一检测复合物和第二检测复合物的量；和f)借助于所述第二检测复合物来计算在所述细胞中通过bont/e切割的snap-25的量，从而测定bont/e在所述细胞中的生物活性。此外，本发明涉及一种用于执行本发明的方法的试剂盒。
背景技术：
肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)和破伤风梭菌(clostridiumtetani)分别产生高效的神经毒素，即肉毒杆菌毒素(bont)和破伤风毒素(tent)。这些梭菌神经毒素(cnt)特异性结合神经元细胞并破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kda单链蛋白。翻译后加工涉及形成二硫桥，并且由细菌蛋白酶进行有限的蛋白水解(切口)。
可选地，梭菌神经毒素可以在异源细胞中产生，即通过在适当的宿主细胞中表达编码神经毒素的核酸序列而重组产生。在大肠杆菌中重组表达梭菌神经毒素的方法是本领域中熟知的；参见例如wo00/12728、wo01/14570、wo2006/076902或wo2013/091895。在某些情况下，分别获得轻链和重链，然后在体外重构；参见wo95/32738。
此外，梭菌神经毒素已经在真核表达系统中表达，例如在巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、酿酒酵母(s.cerevisiae)、昆虫细胞和哺乳动物细胞中；参见wo2006/017749。
在所有这些表达系统中，需要通过发酵过程中的宿主细胞酶或者通过在发酵后分离的原始蛋白质材料中加入蛋白水解酶，来进行单链神经毒素前体的蛋白水解切割，以产生包含通过二硫键连接的轻链和重链的最终生物活性梭菌神经毒素蛋白。
活性神经毒素由两条链组成，即通过二硫键连接的约50kda的n端轻链和约100kda的c端重链。cnt在结构上和功能上由三个结构域组成，即催化轻链、包含转运结构域(n端半部)和受体结合结构域(c端半部)的重链；参见例如krieglstein1990,《欧洲生物化学杂志(eur.j.biochem.)》,188,39；krieglstein1991,《欧洲生物化学杂志(eur.j.biochem.)》,202,41；krieglstein1994,《蛋白质化学杂志(j.proteinchem.)》,13,49。肉毒杆菌神经毒素被合成为包含150kda神经毒素蛋白和相关无毒蛋白的分子复合物。复合物大小根据梭菌菌株和不同的神经毒素血清型而不同，范围有300kda，超过500kda和900kda。这些复合物中的无毒蛋白稳定化神经毒素并保护其免于降解；参见silberstein2004,《疼痛实践(painpractice)》,4,s19-s26。
肉毒梭菌分泌七种抗原性不同的血清型，称为肉毒杆菌神经毒素(bont)的a至g。所有血清型以及破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(tent)都是通过切割snare蛋白来阻断突触胞吐作用的zn2+内切蛋白酶；参见couesnon,2006,《微生物学(microbiology)》,152,759。cnt引起肉毒中毒和破伤风中可见的弛缓性肌肉麻痹；参见fischer2007,pnas104,10447。
尽管其毒性作用，肉毒杆菌毒素复合物已被用作大量疾病中的治疗剂。肉毒杆菌毒素血清型a于1989年在美国被批准供人类使用以治疗斜视、眼睑痉挛和其它病症。其可作为肉毒杆菌毒素a(bont/a)蛋白质制剂，例如以商品名botox(allergan,inc.)或以商品名dysport/reloxin(ipsen,ltd)商购获得。改进的无复合物的肉毒杆菌毒素a制剂可以商品名xeomin(merzpharmaceuticals,gmbh)商购获得。对于治疗应用，将制剂直接注射到待治疗的肌肉中。在生理ph下，毒素从蛋白质复合物中释放出来，并且发生所期望的药理作用。肉毒杆菌毒素的作用只是暂时的，这就是可能需要重复施用肉毒杆菌毒素来维持治疗效果的原因。
梭菌神经毒素削弱随意肌力量并且是斜视、局灶性肌张力障碍(包括子宫颈肌张力障碍)和良性原发性眼睑痉挛的有效疗法。它们已进一步证实可缓解半面痉挛和局灶性痉挛状态，并且此外在广泛多种其它适应症如胃肠道病症、多汗症和美容除皱中是有效的；参见jost2007,《药物(drugs)》,67,669。
在梭菌神经毒素的制造过程中，所述神经毒素的定性和定量测定以及生物活性神经毒素多肽的质量控制是特别重要的。此外，政府机构只接受简单、可靠和经过验证的肉毒杆菌毒素活性测定法。目前，小鼠ld50生物测定法(致死率测试)仍然是制药厂商用来分析其制剂效力的“黄金标准”；参见arnon等,(2001),jama285,1059-1070。然而，近年来，已经作出了相当大的努力来寻求替代方法以减轻对动物试验的需求以及与这类基于动物的测定法相关的所有缺点、成本和伦理问题。此外，监管机构正在引导制药公司将三个“r”原则应用于肉毒杆菌神经毒素的效力测试：“减少(reduce)、优化(refine)、更换(replace)”；参见straughan,《实验动物替代杂志(altern.lab.anim.)》,(2006),34,305-313。因此，已开发了基于细胞的测试系统，以便为使用活体动物的方法提供合理的替代方案。然而，迄今为止，只有几种细胞测试系统可用于测定神经毒素生物活性，其已被证实对神经毒素多肽具有足够的灵敏度。这些基于细胞的测试系统包括使用从体外分化的啮齿动物胚胎分离的原代神经元(pellett等,(2011),《生物化学与生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)》,404,388-392)、神经元分化诱导的多能干细胞(whitemarsh等,(2012),《毒理学(toxicol.sci.)》,126,426-35)和sima细胞系的亚克隆(wo2010/105234a1)。
然而，原代神经元的分离需要杀死动物，并且费时费力。此外，使用不同原代神经元的测试系统显示出很大的偏差。类似地，神经元分化诱导的多能干细胞的产生是困难和耗时的。此外，这种细胞的储存很成问题。使用肿瘤细胞系的测定法通常对bont不够灵敏。此外，所述肿瘤细胞系需要复杂的分化方案，其导致使用所述细胞系的测定法出现大的偏差和/或高的失败率。
用于测定本领域描述的梭菌神经毒素的生物活性的测定法包括western印迹分析，其中通过细胞裂解物中切割的神经毒素底物的量来定量神经毒素活性。在其它测定法中，通过电化学发光(ecl)夹心elisa来测量梭菌神经毒素的活性；参见wo2009/114748a1。在这种情况下，梭菌神经毒素的生物活性也是通过从细胞裂解物分离后检测切割的梭菌神经毒素底物来测定的。此外，在两种测定法中，神经毒素底物必须被浓缩。
鉴于上述情况，非常需要政府机构可接受的测定神经毒素多肽活性的其它测试系统和/或提供基于动物的测试系统的替代物。
因此，本发明背后的技术问题可能被视为提供符合上述需要的装置和方法。所述技术问题由权利要求和下文中的特征性实施方案来解决。
技术实现要素：
在第一方面，本发明涉及一种特异性结合bont/e切割的snap-25的多克隆或单克隆抗体。此外，本发明涉及一种产生特异性结合bont/e切割的snap-25的单克隆抗体的保藏杂交瘤细胞系。
本发明提供了一种特异性结合bont/e切割的snap-25的切割位点、即特异性结合bont/e切割的snap-25的新颖抗体。此外，本发明提供了产生特异性结合bont/e切割的snap-25的本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000。该杂交瘤细胞系已由本申请人根据布达佩斯条约于2014年12月17日以入藏登记号dsmacc3261保藏在dsmz–deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstraβe7b,38124braunschweig,germany。如本领域中已知的，snap-25尤其是bont/e神经毒素的底物。snap-25的总长度为206个氨基酸残基。snap-25中的bont/e切割位点位于精氨酸(r)180与异亮氨酸(i)181之间，也称为“r180i”。因此，bont/e切割snap-25206显示了两个片段，即来自氨基酸残基1至180的n端片段(下文也称为“snap-25180切割产物”)和来自氨基酸残基181至206的c端片段。本发明的抗体已经如下列实施例中所述产生和表征。简而言之，已经通过用与免疫蛋白偶联的肽“c-neidtqnrqidr-oh”(seqidno:1)使小鼠免疫而产生小鼠单克隆抗体。所示数据表明该抗体特异性检测snap-25180切割产物。因此，该抗体特别适合于通过检测bont/e切割的snap-25来测量bont/e的生物活性的测定法。具体来说，它可以用作本发明方法的第二捕获抗体，由于其对snap-25180切割产物相对于snap-25206未切割底物的高亲和力和特异性，允许直接在细胞中测定bont/e的生物活性。这样的抗体尚未商业化。本发明还设想的是多克隆抗血清或抗体，其可以例如通过将肽“c-neidtqnrqidr-oh”(seqidno:1)与免疫蛋白偶联并使包括(但不限于)例如兔、山羊、马、驴、小鼠、大鼠或骆驼的物种免疫而产生。
如本文所用，术语“抗体”是指由免疫系统产生的分子，其响应于特定抗原而形成，其特异性结合所述抗原，并且包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体。如本文所用的“抗体”涵盖单克隆抗体、多克隆抗血清或抗体、单链抗体、二聚体或多聚体、嵌合抗体、双特异性抗体、双特异性单链抗体、多特异性抗体、合成抗体、人源化抗体、双功能抗体、细胞相关抗体如ig受体、线性抗体、双链抗体、微型抗体或所述抗体中的任一种的片段。所述抗体的片段包括例如fab、fv或scfv片段，或者这些片段中的任何一个的化学修饰的衍生物。抗体可以通过使用本领域中描述的方法制造；参见例如harlow和lane“抗体：实验室手册(antibodies,alaboratorymanual)”,cshpress,coldspringharbor,1988。单克隆抗体可以通过最初描述于
完整的抗原识别和抗原结合位点包含在抗体的可变结构域(即fv片段)内。该片段包括处于紧密的非共价缔合中的一个重链可变结构域(vh)和一个轻链可变结构域(vl)的二聚体。每个结构域包括四个框架区(fr)，其大部分采用通过三个高变区连接的β折叠构型，所述三个高变区形成环连接，并且在某些情况下形成β折叠结构的一部分。每个高变区包含对应于互补决定区(cdr)的氨基酸序列。总体来说，它是六个cdr区的三维配置(轻链上的三个cdr区，即cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，以及重链上的三个cdr区，即cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)，其限定赋予抗原结合特异性的vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。参见例如cyruschothia等,conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions,《自然(nature)》,342(6252):877-883(1989)；elvina.kabat等,《免疫学关注的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)。抗体的恒定结构域不直接参与抗体与抗原结合，而是表现出各种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用的“选择性结合”或“特异性结合”是指本发明的抗体特异性结合bont/e切割的snap-25，但与非切割的snap-25或与一般其它多肽不在显著程度上交叉反应。表位特异性是本发明的抗体的重要特征。本发明的抗体特异性结合由具有如seqidno:1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列的肽组成的表位。可以通过各种众所周知的技术(包括例如竞争研究)来测试特异性结合。另一个重要特征是抗体的敏感性。在本发明的一个方面，敏感性应使得样品或细胞所包含的bont/e切割的snap-25的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％被结合。敏感性可以通过熟知的技术进行测试。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每个测定的操作和最佳测定条件。用于结合研究的常规技术包括放射免疫测定法、elisa、平衡透析、等温微量热法、
靶抗原例如bont/e底物snap-25通常具有一个或多个结合位点，也称为表位，其被抗体的cdr形成的抗原结合位点识别。如本文所用，“表位”与“抗原决定基”同义，并且是指靶抗原上的位点，例如能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体或以其它方式与分子相互作用的肽、多肽、多糖或含脂质分子。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有多于一种的相应抗体。如本文所提及的“特异性结合”可以通过各种众所周知的技术来测试，包括例如竞争实验和western印迹法。如根据本发明使用的表位涉及bont/e切割的snap-25中的抗原决定基，其可以定位在被抗体识别的snap-25的bont/e切割位点附近、邻近或其中。如本文所用，术语“特异性地”是指选择性地并且是指具有唯一的效果或影响或者仅以一种方式或仅与一种事物进行反应。如本文所用，术语“特异性结合”或“选择性结合”当涉及抗体或结合蛋白或结合结构域时是指抗体或结合蛋白/结构域与指定的靶表位的区别性结合，使得抗体或结合蛋白/结构域基本上不与非靶表位交叉反应。如本文所定义的肽表位的最小尺寸为约5个氨基酸残基，并且肽表位通常包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或至少30个氨基酸残基。肽表位可以是线性或不连续表位。不连续表位包含在肽的一级结构中不相邻但通过肽的二级、三级或四级结构合并成为表位的氨基酸残基。此外，还应注意，表位可以包含除了氨基酸序列以外的分子的一部分，例如碳水化合物部分，脂质部分如糖脂或脂蛋白，或化学修饰的氨基酸部分如磷酸化氨基酸。
在本发明的多克隆或单克隆抗体的另一个方面，抗体特异性结合由具有seqidno:1(“c-neidtqnrqidr-oh”)所示的氨基酸序列的肽组成的表位。优选地，本发明的抗体识别并特异性结合seqidno:2所示的表位snap-25169-180“neidtqnrqidr”和/或snap-25180，即bont/e切割的snap-25。更优选地，本发明的抗体识别并特异性结合seqidno:3所示的表位snap-25170-180“eidtqnrqidr”和/或snap-25180，seqidno:4所示的序列的表位snap-25171-180“idtqnrqidr”和/或snap-25180，seqidno:5所示的表位snap-25172-180“dtqnrqidr”和/或snap-25180，seqidno:6所示的表位snap-25173-180“tqnrqidr”和/或snap-25180，seqidno:7所示的表位snap-25174-180“qnrqidr”和/或snap-25180，或者seqidno:8所示的表位snap-25175-180“nrqidr”和/或snap-25180。
在本发明的单克隆抗体的一个方面，单克隆抗体是由杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000产生的，所述杂交瘤细胞系已由本申请人根据布达佩斯条约于2014年12月17日以入藏登记号dsmacc3261保藏在dsmz–deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstraβe7b,38124braunschweig,germany。
在本发明的多克隆或单克隆抗体的另一个方面，所述抗体对于bont/e切割的snap-25具有小于100nm、小于50nm、小于10nm、小于5nm、小于2nm、小于1nm或优选小于0.5nm的平衡解离常数。
在本发明的多克隆或单克隆抗体的另一个方面，所述抗体对于bont/e切割的snap-25的平衡解离常数为其对于未被bont/e切割的snap-25(即非切割的snap-25)的平衡解离常数的至少10倍、至少50倍或优选至少100倍。
在本发明的多克隆或单克隆抗体的另一个方面，所述抗体包含至少一个互补决定区(cdr)，其选自由杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000产生的单克隆抗体所包含的cdr-l1(seqidno.15)、cdr-l2(seqidno.16)、cdr-l3(seqidno.17)、cdr-h1(seqidno.18)、cdr-h2(seqidno.19)和cdr-h3(seqidno.20)，所述杂交瘤细胞系以入藏登记号dsmacc3261保藏。优选地，所述抗体包含所示cdr中的两个、三个、四个、五个或全部六个。
在本发明的多克隆或单克隆抗体的另一个方面，所述抗体包含由以入藏登记号dsmacc3261保藏的杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000产生的单克隆抗体所包含的vh结构域或vh区(seqidno.22)和/或vl结构域或vl区(seqidno.21)。
在这些方面，本发明涉及一种抗体或其片段，其特异性结合bont/e切割的snap-25的切割位点，并且其包含由以入藏登记号dsmacc3261保藏的杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000产生的单克隆抗体所包含的包含以seqidno.22示出的氨基酸序列的重链可变区(vh)和/或以seqidno.21示出的氨基酸序列的轻链可变区(vl)。本发明进一步涵盖抗体或其片段，其包含所述重链和/或轻链可变区或结构域的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。以入藏登记号dsmacc3261保藏的杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000所产生的单克隆抗体分别包含cdr-h1(seqidno.18)、cdr-h2(seqidno.19)和cdr-h3(seqidno.20)的相应序列以及cdr-l1(seqidno.15)、cdr-l2(seqidno.16)和cdr-l3(seqidno.17)的相应序列。
优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。更优选地，所述单克隆抗体是在以下实施例中产生和表征的小鼠单克隆抗体，即由以入藏登记号dsmacc3261保藏的杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000产生的单克隆抗体。上述cdr、vh和vl序列是所述抗体的相应序列。
在另一个方面，本发明提供一种直接测定bont/e在细胞中的生物活性的方法，其包括以下步骤：
a)在允许bont/e发挥其生物活性的时间和条件下用bont/e温育对bont/e中毒敏感的细胞；
b)固定所述细胞，并且任选地用洗涤剂使所述细胞透化；
c)使所述细胞至少与特异性结合非切割的和bont/e切割的snap-25的第一捕获抗体以及至少与特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体在允许所述第一捕获抗体与非切割的和bont/e切割的snap-25结合以及允许所述第二捕获抗体与bont/e切割的snap-25结合的条件下接触；
d)使所述细胞至少与特异性结合所述第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，因此形成第一检测复合物，以及至少与特异性结合所述第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，因此形成第二检测复合物，并且其中所述第一检测抗体不同于所述第二检测抗体；
e)测定步骤d)的所述第一检测复合物和第二检测复合物的量；和
f)借助于所述第二检测复合物来计算在所述细胞中通过bont/e切割的snap-25的量，
从而测定所述bont/e在所述细胞中的生物活性。
在本发明方法的一个方面，步骤c)中使用的第二捕获抗体是本发明的多克隆或单克隆抗体。在本发明方法的另一个方面，步骤c)中使用的第二捕获抗体是如jones等,《免疫学方法杂志(journalofimmunologicalmethods)》,329(2008),第92-101页中所述的bont/e切割位点特异性抗体。
在本发明的方法中，bont/e切割的snap-25可以在细胞中直接检测。为此，将如本文其它地方更详细定义的对bont/e中毒敏感的细胞与bont/e神经毒素多肽在允许bont/e神经毒素多肽发挥其生物活性的时间和条件下温育。在下一步骤中，将细胞固定，并且取决于所用的固定剂，例如通过加入固定剂如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或所述固定剂的混合物而透化。任选地，可以另外通过使用如本文其它地方定义的至少一种洗涤剂如tritonx-100、tween20、皂苷、毛地黄皂苷或正辛基-β-吡喃葡萄糖苷，使细胞透化。所述洗涤剂可以包含在适当的缓冲液如pbs中。此后，使所述细胞至少与特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的snap-25的第一捕获抗体以及至少与特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体(例如特异性结合bont/e切割的snap-25的切割位点的抗体)在允许所述第一捕获抗体与所述非切割的和bont/e切割的snap-25结合以及所述第二捕获抗体与bont/e切割的snap-25结合的条件下接触。合适的表位、snap-25中的bont/e切割位点和用于产生特异性结合bont/e切割的snap-25的抗体的方法在本文其它地方进行了描述。此外，本发明人已经在以下实施例中产生并表征了特异性结合bont/e切割的snap-25的单克隆抗体。所述抗体对snap-25180切割产物具有高结合特异性，其允许相对于snap-25206未切割底物而优先识别该切割产物。所述第一捕获抗体能够通过特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的snap-25中存在的适当表位来确定细胞中的bont/e底物snap-25的总含量或量。所述第二捕获抗体识别并特异性结合仅存在于bont/e切割的snap-25中而不存在于非切割的snap-25中的表位。可选地，可以在所述条件下，使所述细胞与所述第一捕获抗体和第二捕获抗体的混合物接触，即所述细胞与至少第一捕获抗体和至少第二捕获抗体同时接触。在下一步骤中，使所述细胞至少与特异性结合第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，因此形成第一检测复合物。在随后的步骤中，使所述细胞至少与特异性结合第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，因此形成第二检测复合物。可选地，可以在所述条件下，使所述细胞与所述第一检测抗体和第二检测抗体的混合物接触，即所述细胞与至少第一检测抗体和至少第二检测抗体同时接触。可选地，可以在所述条件下，使透化细胞与所述第一捕获抗体和第二捕获抗体与所述第一检测抗体和第二检测抗体的混合物同时接触。在下一步骤中，测定第一检测复合物和第二检测复合物的量。最后，借助于第二检测复合物来计算所述细胞中通过bont/e切割的snap-25的量。如根据本发明的方法使用的术语“计算”涉及允许测定细胞中的bont/e切割的snap-25的量的数学运算。由此，在细胞中直接测定bont/e的生物活性。这意味着如本领域所述的方法那样，不再需要细胞的裂解，并且不需要从细胞裂解物中分离或浓缩bont/e切割的snap-25。此外，本发明的方法相比于例如本领域中使用的基于fret的测定法耗时更少，费力更小和更精确。
本发明的方法在下文中更详细地描述。对于细胞培养，首先在96孔微量滴定板上接种如本文所定义的对bont/e神经毒素多肽中毒敏感的细胞，例如神经元细胞、sima细胞或诱导多能干细胞(ips)衍生的神经元。sima细胞被分化为神经元表型，例如，根据wo2010/105234中公开的程序，并且ips衍生的神经元被分化为神经元表型，例如根据wo2012/135621中描述的测定法。如果需要，可以通过使用如wo2015/124618中公开的特定细胞培养方法来优化对bont/e神经毒素多肽敏感的细胞的敏感性或敏感性的均匀性。然后，用bont/e神经毒素多肽使细胞中毒约72小时。在随后的步骤中，在elisa测定之前，将细胞固定在微量滴定板上。为了固定细胞，例如可以在-20℃将冰冷的甲醇(-20℃)加入到细胞中持续20分钟。
为了进行elisa测定，首先洗涤细胞。作为洗涤缓冲液，可以使用例如10mmpbs缓冲液(ph7.4)。此后，通过淬灭缓冲液如含0.6％h2o2的10mmpbs(ph7.4)来淬灭内源性蛋白酶，然后进行另一次洗涤步骤。在随后的步骤中，通过适当的封闭缓冲液例如含2％bsa的10mmpbs缓冲液(ph7.4)来封闭微量滴定板上的游离结合位点。此后，如上所述通过洗涤缓冲液洗涤细胞。
在下一步骤中，例如用两种不同抗体的混合物来温育固定并透化的细胞。所述混合物包含特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体和特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体，例如特异性结合bont/e切割的snap-25中的bont/e切割位点的抗体。为此目的，本发明的多克隆或单克隆抗体是特别合适的。所述第一捕获抗体和第二捕获抗体随后也可以适用。例如，第一捕获抗体可以特异性结合非切割的和bont/e切割的snap-25，从而允许定量细胞中的snap-25(即bont/e非切割的和bont/e切割的snap-25)的总量或含量。此外，在如本文所述的评估后，该第一捕获抗体可以用于归一化细胞中的bont/e切割的snap-25的量。所述第二捕获抗体特异性结合bont/e切割的snap-25并且因此允许测定和检测bont/e切割的snap-25。
本发明方法中的总(bont/e非切割的和bont/e切割的)snap-25和bont/e切割的snap-25的以下检测可以在微量滴定板或细胞培养皿上，即在细胞内直接进行。因此，有利的是，与本领域中所述的方法相比，本发明的方法不需要从细胞裂解物中制备细胞提取物并分离和/或浓缩bont/e切割的snap-25。此后，洗涤细胞以除去未结合到相应抗原的过量抗体。在随后的步骤中，使透化细胞与至少第一检测抗体和至少第二检测抗体接触。所述抗体可以作为混合物(即同时)施用，或随后施用。第一检测抗体特异性结合第一捕获抗体。由此，形成第一检测复合物。第一检测抗体可以针对第一捕获抗体所来源的物种。例如，在使用兔多克隆抗snap-25抗体s9684(sigma)作为特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体的情况下，抗兔碱性磷酸酶结合抗体可以用作第一检测抗体。第二检测抗体特异性结合第二捕获抗体。由此，形成第二检测复合物。第二检测抗体可以针对第二捕获抗体所来源的物种。例如，在以下实施例中生成和表征的小鼠单克隆抗体(mab)用作特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体的情况下，抗小鼠辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体可以用作第二检测抗体。本领域技术人员清楚的是，第一检测抗体和第二检测抗体与不同的酶结合，以便允许特异性检测如本发明的方法中使用的相应的第一捕获抗体和第二捕获抗体。例如，如本文其它地方描述的基于hrp的检测可用于bont/e切割的snap-25并且基于碱性磷酸酶的检测可用于总(bont/e切割的和bont-e非切割的)snap-25。此后，再次洗涤细胞。在随后的步骤中，将荧光hrp底物加入到细胞中。作为hrp底物，例如可以使用amplexultrared(invitrogen)，其在540nm被激发并且以600nm发射。用hrp底物进行温育，持续足以通过辣根过氧化物酶使底物充分转化的时间。在用hrp底物温育后，例如可以将ap底物difmup(6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯；激发360nm；发射450nm)加入到hrp底物中并且用所述两种底物的混合物温育细胞。用所述ap底物进行温育，持续允许通过碱性磷酸酶使底物充分转化的时间。如本领域中已知的，根据检测极限的定义，底物必须被转换足够的量，使得所测量的信号至少高达空白的平均值加上平均值的三个标准偏差。检测极限可以如文献中所述确定；参见例如armbruster和pry,《临床生物化学评论(clinicalbiochem.rev.)》,2008,29(增刊1):s49-s52。由于碱性磷酸酶的ph最佳值在碱性区域，因此相应的底物缓冲液是强碱性的。如果将碱性磷酸酶底物加入到hrp底物中，则通过碱性ph终止辣根过氧化物酶的反应，并且碱性磷酸酶转化difmup。转化的hrp底物不受碱性ph的影响。最后，两种底物的荧光测量如下：
amplexultrared：激发540nm；发射600nm
difmup：激发360nm；发射450nm
如本领域技术人员所理解的，只有那些荧光底物适于在本发明的方法中检测第一捕获抗体和第二捕获抗体，其显示出所用底物的不同的激发/发射波长。仅在这种情况下，它们允许每个抗原的特异性检测，即总snap-25(bont/e非切割的和bont/e切割的snap-25)和bont/e切割的snap-25。因此，可以同时定量每个孔或细胞培养皿中snap-25的总含量和bont/e切割的snap-25的含量。鉴于此，有利地使本发明的方法自动化。如本文其它地方所述，可以设想为本发明方法选择的荧光底物在激发/发射光谱之间表现出足够的偏移，以便允许相应底物的特异性检测。例如，对于hrp底物amplex和其衍生物以及对于ap底物difmup，满足这一要求。然而，在最佳情况下，所用荧光底物的激发/发射光谱之间没有重叠，已感受到所用荧光底物的激发光谱的峰面积中高达30％的重叠是可容许的。
如本领域技术人员进一步认识到的，本发明的方法允许直接检测和定量细胞中由神经毒素多肽bont/e切割的底物snap-25，从而测定所述bont/e神经毒素多肽在所述细胞中的生物活性。有利的是，本发明的方法不需要制备细胞裂解物或提取物以及从所述细胞裂解物/提取物分离或浓缩bont/e切割的snap-25，而这对于本领域中已知的方法和测定法是必需的。因此，可以节省样品材料。此外，通过本发明的方法可以减少样品制备和样品数量，因为样品中总snap-25的量和bont/e切割的snap-25的量可以同时测定。在本领域描述的测定法中，样品必须被细分，以彼此独立地检测两种抗原，即总神经毒素底物和切割的神经毒素底物。本发明的方法使得样品的细分是不必要的。因此，可以避免样品细分产生的不均匀性，并且可以节省样品材料。此外，抗原可以在本领域描述的测定法中降解，这可以歪曲切割的神经毒素底物的检测。这是因为在本领域描述的测定法中，将细胞与含有洗涤剂的裂解缓冲液一起温育，然而，它们不能使神经毒素多肽或其它内源性蛋白酶失活，从而在样品长时间储存后导致神经毒素底物的降解。由于在所述测定法中需要使用细胞裂解物，所以较强的裂解缓冲液不能用于现有技术中描述的ecl夹心elisa中。这是因为上述抗原的聚集可能导致抗原非特异性吸附于细胞培养皿或微量滴定板的塑料表面，这反过来又通过适当的抗体扰乱抗原的检测。由于用于检测抗原的抗体也与裂解物接触，所以抗体也可以聚集。在这种情况下，不再能够可靠和准确地检测抗原。本发明人通过使用western印迹测定法检测本领域所述的神经毒素活性的生物活性而经历这种降解反应。裂解物在-20℃下储存较长时间后，与新鲜裂解物样品相比，已经发现总snap-25的检测信号强烈降低，从而降低了测试系统的灵敏度。本发明人已经发现，通过将细胞直接固定在细胞培养皿上，可以避免snap-25的降解和/或样品的不稳定性，因为bont/e神经毒素底物snap-25和bont/e神经毒素或其它内源性蛋白酶通过聚集在细胞培养皿上而立即灭活。这可以通过使用例如通过甲醇或其它固定剂或本领域已知的固定剂如乙醇、丙酮、甲醛或其混合物或者本文所述的其它固定剂固定细胞来实现。使用这种固定方法来分析例如亲本sima细胞(人类神经母细胞瘤细胞；dsmz编号：acc164)和ips衍生神经元(whitemarsh等,(2012),《毒理学(toxicol.sci.)》,126,426-35)的稳定性，没有显示出新鲜的和在冰箱中储存七天的细胞培养皿之间的任何差异。
除非上下文另有明确说明，否则如本文所用的单数形式“一”和“所述”包括单数和复数个所指物。举例来说，“细胞”是指一个或多于一个的细胞。
如本文所用，术语“约”在对所述项目、数量、百分比或条款的值进行限定时，是指所述项目、数量、百分比或条款的值±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的范围。优选的是±10％的范围。
如本文所用的术语“包含”和“由……组成”与“包括”或“含有”是同义的，并且是包容性的或开放式的，不排除额外的未叙述的成员、要素或方法步骤。显然，术语“包含”涵盖术语“由……组成”。更具体地，如本文所用的术语“包含”是指权利要求涵盖所有列出的要素或方法步骤，但也可以包括额外的未指定的要素或方法步骤。例如，包括步骤a)、b)和c)的方法在其最狭义的意义上涵盖由步骤a)、b)和c)组成的方法。短语“由……组成”是指组合物(或设备或方法)具有所述的要素(或步骤)，而无其它。相反，术语“包含”还可以涵盖除了步骤a)、b)和c)之外还包括其它步骤例如步骤d)和e)的方法。
在本文中使用的数值范围如“浓度在1与5微摩尔浓度之间”时，该范围不仅包括1和5微摩尔浓度，而且还包括在1与5微摩尔浓度之间的任何数值，例如2、3和4微摩尔浓度。
如本文所用的术语“体外”表示在动物或人类身体的外面或外部。如本文所用的术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物或人类身体移除并在身体外面(例如在培养容器中)维持或增殖的组织或细胞。如本文所用的术语“体内”表示动物或人类身体的里面或内部。优选地，本发明的方法是体外方法。
如本文所用的术语“神经毒素多肽”表示肉毒梭菌和破伤风梭菌神经毒素，即肉毒杆菌毒素(bont)和破伤风毒素(tent)。更具体地说，如果未另外说明，否则所述术语是指bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽。bont/e-mdm2多肽和编码它们的核酸序列已经在wo2013/068476中进行了定义和表征，所述文献的公开内容通过引用并入本文。因此，神经毒素多肽，特别是其轻链和重链，可从bont/e衍生。在一个方面，神经毒素多肽的所述轻链和重链是bont/e神经毒素的轻链和重链。在另一个方面，编码所述神经毒素多肽的多核苷酸包含如seqidno:9所示的核酸序列(编码bont/e的核酸序列)、如seqidno:11所示的核酸序列(编码bont/e-mdm2多肽的核酸序列)或如seqidno:13所示的核酸序列(编码bont/e-mdm2多肽的核酸序列)。此外，在一个方面，涵盖包含编码如seqidno:10(bont/e)、seqidno:12(bont/e-mdm2多肽)或seqidno:14(bont/e-mdm2多肽)所示的氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸。在本发明的装置和方法的一个方面，还涵盖包含以下或由以下组成的神经毒素多肽：如seqidno:10(bont/e)、seqidno:12(bont/e-mdm2多肽)或seqidno:14(bont/e-mdm2多肽)所示的氨基酸序列。在另一个方面，肉毒杆菌神经毒素是可通过使用wo2014/068317中公开的密码子优化的核酸序列获得的bont/e1。
在另一个方面，所述多核苷酸是上述多核苷酸的变体，其包含一个或多个核苷酸取代、缺失和/或添加，其在另一个方面可导致具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加的多肽。此外，本发明的变体多核苷酸在另一个方面将包含与如seqidno:9、11或13所示的核酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列变体，或编码与如seqidno:10、seqidno:12或seqidno:14所示的氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的核酸序列变体。如本文所用的术语“同一性”是指通过确定两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相同氨基酸数目来表征的序列同一性，其中对序列进行比对以便获得最高级别匹配。其可以使用计算机程序中编码的公开技术或方法来计算，例如blastp、blastn或fasta(altschul1990,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,215,403)。在一个方面，在整个氨基酸序列上计算同一性百分比值。技术人员可以使用基于各种算法的一系列程序来比较不同的序列。在这种情况下，needleman和wunsch或smith和waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了执行序列比对，可使用程序pileup(higgins1989,cabios5,151)或程序gap和bestfit(needleman1970,《分子生物学杂志(jmolbiol)》,48；443；smith1981,《高等应用数学(adv.appl.math.)》,2,482)，它们是gcg软件包(geneticscomputergroup1991,575sciencedrive,madison,wisconsin,usa53711)的一部分。在本发明的另一个方面，在整个序列区域中使用具有以下设置的程序gap来确定上述以百分比(％)表示的序列同一性值：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均不匹配：0.000，除非另有说明，否则应始终用作序列比对的标准设置。在一个方面，上述变体多核苷酸各自编码保留bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽的一种或多种生物学特性的多肽，并且在另一个方面，各自编码保留bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽的所有生物学特性的多肽。本领域技术人员应理解，仅在蛋白水解激活后维持完全生物活性，虽然可以想象未经处理的前体可以发挥一些生物功能或具部分活性。如本文所用的“生物学特性”是指(a)受体结合，(b)内化，(c)穿过内体膜转运到细胞溶质中，和/或(d)参与突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白切割。用于评估生物活性的体内测定法包括如pearce等(pearce1994,《毒理学与应用药理学(toxicol.appl.pharmacol.)》,128:69-77)和dressler等(dressler2005,《运动障碍(mov.disord.)》,20:1617-1619；keller2006,《神经科学(neuroscience)》,139:629-637)所述的小鼠ld50测定法和离体小鼠偏侧膈测定法。生物活性通常以小鼠单位(mu)表示。如本文所用，1mu是神经毒性成分在腹膜内注射后杀死指定小鼠群体的50％(即小鼠i.p.ld50)的量。在另一个方面，所述变体多核苷酸可以编码具有改进或改变的生物学特性的bont/e神经毒素或bont/e-mdm2多肽，例如，它们可以包括改进用于酶识别的切割位点，可被改进用于受体结合，可具有改变的(例如延长或缩短的)生物活性持续时间，或上文指定的任何其它性质。
因此，如本文所用的术语“bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽的生物活性”是指bont/e神经毒素多肽的特征性生物学特性，即a)受体结合，(b)内化，(c)穿过内体膜转运到细胞溶质中，和/或(d)参与突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白切割。可以设想，如本文所用的bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽表现出上述性质a)至d)中的至少一种，优选地参与突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白切割，或者a)至d)中列出的两种或三种或全部四种生物学特性。
本公开的方面部分地包括来自已建立细胞系的细胞。如本文所用，术语“细胞”是指对bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽中毒敏感的任何真核细胞或者可以摄取bont/e神经毒素多肽或bont/e-mdm2多肽的任何真核细胞。术语细胞涵盖来自各种生物体的细胞，例如鼠类、大鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人类细胞；来自各种细胞类型的细胞，例如神经元和非神经元细胞；并且可以从异源细胞群体、组织或生物体分离或者是异源细胞群体、组织或生物体的一部分。如本文所用，术语“已建立细胞系”与“永生细胞系”或“转化细胞系”同义，并且是指从源自生物体、组织或器官来源的细胞群体选择用于无限期繁殖的细胞的细胞培养物。根据定义，已建立细胞系不包括原代细胞的细胞培养物。如本文所用，术语“原代细胞”是直接从新鲜组织或器官采集并且不具有无限期繁殖潜力的细胞。例如，本发明的方法中可以使用原代神经元细胞。已建立细胞系可以包含异质细胞群体或均一细胞群体。源自单个细胞的已建立细胞系被称为克隆细胞系。已建立细胞系可以是其细胞内源性表达细胞经历整个细胞机制且由此使神经毒素多肽如bont/e蛋白水解切割底物如snap-25所需的全部组分的细胞系，并且涵盖神经毒素与神经毒素受体如bont/e与bont/e受体的结合，神经毒素/受体复合物的内化，bont/e神经毒素轻链从胞内囊泡转运到细胞质中以及bont/e神经毒素底物snap-25的蛋白水解切割。可选地，已建立细胞系可以是其细胞已经从外源引入使细胞经历整个细胞机制且由此使神经毒素如bont/e蛋白水解切割底物如snap-25所需的至少一种组分的细胞系，并且涵盖神经毒素与受体如bont/e与bont/e受体的结合，神经毒素/受体复合物的内化，bont/e神经毒素轻链从胞内囊泡转运到细胞质中以及bont/e神经毒素底物snap-25的蛋白水解切割。也称为遗传工程化的细胞系，来自这种已建立细胞系的细胞可以例如表达外源fgfr2、外源fgfr3、外源sv2、外源神经毒素底物snap-25或其任何组合。
如本文所示的术语“对bont/e神经毒素中毒敏感的细胞”是指可以经历整个细胞机制由此使bont/e神经毒素多肽切割bont/e神经毒素底物snap-25的细胞，并且涵盖bont/e神经毒素与bont/e受体的结合，神经毒素/受体复合物的内化，bont/e神经毒素轻链从胞内囊泡转运到细胞质中以及bont/e神经毒素底物snap-25的蛋白水解切割。用于确定bont/e神经毒素多肽的生物活性的测定法是本领域熟知的，并且也在本文其它地方进行了描述；参见例如pellett等,(2011),《生物化学与生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)》,404,388-392；whitemarsh等,(2012),《毒理学(toxicol.sci.)》,126,426-35。因此，如本文所用的“对bont/e神经毒素中毒敏感的细胞”是指bont/e神经毒素敏感细胞。所述术语包括如下的细胞或细胞系，例如，分离的原代细胞或其细胞系或者已建立细胞系的细胞或已建立细胞系，例如能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞或肿瘤细胞系，例如如本文其它地方所定义的神经母细胞瘤细胞或神经母细胞瘤细胞系。例如，所述神经母细胞瘤细胞系可以是可从dsmz(acc164)商购获得的sima细胞系。wo2010/105234中还公开了细胞系sima的特异性克隆。可用于本发明方法中的其它神经母细胞瘤细胞系可以下列atcc或dsmz编号从atcc或dsmz获得：编号crl-2263的细胞系n1e-115、编号ccl-131的细胞系neuro2a、编号crl-2266的细胞系sh-sy5y、编号crl-1721的细胞系pc12、编号acc157(dsmz)的细胞系mhh-nb-11和编号crl-2271的细胞系sk-n-be(2)。对神经毒素中毒敏感的其它肿瘤细胞是p-19细胞(鼠类胚胎癌细胞系)(dsmz编号acc316)。对bont/e神经毒素中毒敏感的细胞还涵盖诱导多能干细胞(ips)衍生的神经元，优选人类诱导多能干细胞(ips)衍生的神经元；参见例如whitemarsh等,(2012),同上。这样的人类ips衍生神经元也可例如从cellulardynamics商购获得。生成ips细胞的方法描述于例如yu等(《科学(science)》,2009年5月8日；324(5928):797-801。2009年电子出版)、wo2011/056971和wo2011/025852中。在一些方面，使用合适的方法将ips分化成神经元，例如在wo2012/135621和美国专利申请us2010/0279403和us2010/0216181中描述的那些。
术语“固定细胞”或“细胞的固定”是指使用本领域描述的方法固定细胞。一般来说，固定是一种化学过程，由此生物组织被保存免于腐败，从而防止自溶。固定终止任何正在进行的生化反应，并且还可以增加经过处理的组织的机械强度或稳定性。在制备所述组织或细胞用于检查或分析的过程中，固定保持了生物材料样品如组织或细胞尽可能接近其天然状态。为此，固定剂通常用于使内在生物分子，特别是蛋白水解酶失去能力，否则其会消化或破坏样品。此外，固定剂通常保护样品免于外部损伤。固定剂对大多数常见微生物有毒性，所述微生物包括可能存在于组织或细胞培养物中的细菌，或者可能以其它方式定殖于固定组织或细胞培养物中的细菌。此外，许多固定剂以化学方式改变固定材料，使其不太可口，不易消化或对机会微生物有毒。最后，固定剂通常在分子水平上改变细胞或组织，以增加其机械强度或稳定性。这种增加的强度和刚度可以帮助保持样品在被处理用于进一步分析时的形态例如形状和结构。本领域技术人员显而易见的是，固定剂和固定方案的选择可能取决于额外的处理步骤和所计划的最后分析。例如，免疫组织化学使用特异性结合特异性蛋白质靶标(抗原)的抗体。延长的固定可以化学掩蔽这些靶标并防止抗体结合。在这些情况下，例如可以使用利用冷福尔马林的快速固定方法。可选地，可以通过加入冰冷的甲醇(-20℃)来固定细胞。除了醛类如甲醛或戊二醛以及醇类如乙醇或甲醇之外，氧化剂、hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(hope)固定剂、丙酮或其混合物，例如甲醇和丙酮的混合物、甲醇和乙醇的混合物、多聚甲醛和tritonx-100的混合物，或多聚甲醛和甲醇的混合物，可用于固定方案中。在本发明方法的一个方面，通过加入选自甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物的固定剂来进行细胞固定。为了确保和/或支持抗体自由接近其抗原，细胞可以任选地通过使用包含至少一种洗涤剂如tritonx-100的适当的渗透缓冲液来透化。可用于本发明方法中的渗透缓冲液例如为含0.5％tritonx-100的10mmpbs缓冲液。在本发明方法的其它方面，可以通过使用例如包含选自tween20、皂苷、毛地黄皂苷或正辛基-β-吡喃葡萄糖苷的至少一种洗涤剂的pbs的渗透缓冲液来透化细胞。在其它方面，本文提及的两种或更多种洗涤剂的混合物可用于所述渗透缓冲液中。通常，固定强度和时间对于细胞相比于较厚的、结构复杂的组织切片来说明显更短。对于免疫细胞化学，样品制备基本上需要将靶细胞固定在载玻片、细胞培养皿或微量滴定板上。完美的固定将固定化抗原，同时保留真实的细胞和亚细胞结构，并允许抗体无阻碍地接近所有细胞和亚细胞区室。通常使用如上例举的广泛多种固定剂，并且方法的正确选择将取决于所检查的抗原的性质和所用抗体的性质。固定方法通常分为两类：有机溶剂和交联试剂。有机溶剂如醇类和丙酮除去脂质并使细胞脱水，同时使蛋白质沉淀在细胞结构上。交联试剂如多聚甲醛通常通过游离氨基形成分子间桥，从而产生连接抗原网络。交联剂比有机溶剂更好地保存细胞结构，但可能降低一些细胞成分的抗原性，并且通常需要添加如上所述的透化步骤，以允许抗体进入试样。用两种方法进行固定都可能使蛋白质抗原变性，因此，针对变性蛋白质制备的抗体可能更适于细胞染色。应根据相关应用选择适当的固定方法。细胞的固定方法在本领域中有充分描述，并且因此是本领域技术人员已知的；参见例如《细胞生物学中的方法(methodsincellbiology)》,第37卷:细胞生物学中的抗体(antibodiesincellbiology)；davidj.asai编辑；1993,academicpressinc。
如根据本发明方法使用的术语“接触”是指将细胞和相应抗体物理上接近以允许物理和/或化学相互作用。允许这种特定相互作用的合适条件是本领域技术人员熟知的。显然，所述条件将取决于本发明方法中应用的抗体和细胞，并且可以由本领域技术人员常规调整。此外，足以允许相互作用的时间也可以由技术人员毫不费力地确定。应当理解，在本发明方法中所述的使细胞和相应抗体接触的各个步骤之间，可以进行洗涤步骤以获得合适的接触条件。例如，在本发明方法的步骤c)中将细胞至少与特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体以及至少与特异性结合ont/e切割的底物snap-25的第二捕获抗体接触之后，可以结合洗涤步骤以除去剩余的溶液和/或过量的第一捕获抗体和第二捕获抗体，然后施加第一检测抗体和/或第二检测抗体。类似地，在本发明的方法中使细胞与第一检测抗体和/或第二检测抗体接触后，可以包括洗涤步骤。适当的洗涤缓冲液是例如10mmpbs缓冲液(ph7.4)。更具体地说，本文使用的术语“接触”是指在本发明方法的步骤c)中，使细胞至少与特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体和至少与特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与所述snap-25结合的条件下接触。第一捕获抗体和第二捕获抗体可以同时(例如作为混合物)或依序施加至细胞。“接触”还指在本发明方法的步骤d)中，使细胞至少与特异性结合第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，以及至少与特异性结合第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触。因此，形成第一检测复合物和第二检测复合物。可选地，也可以随后施加第一检测抗体和第二检测抗体。
根据本发明的方法，“第一捕获抗体”特异性结合由bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25所包含的表位。snap-25是bont/e的已知底物。所述第一捕获抗体允许确定细胞中snap-25的总量(即完全含量)，原因在于其特异性结合于未切割snap-25中和bont-e切割的snap-25中可用的表位。对于bont/e，定位在bont/e切割位点的n端(arg(r)180–ile(i)181)、即snap-25的氨基酸残基1与180之间的表位，可以用于第一捕获抗体。
在本发明方法的一个方面，snap-25是人类snap-25a或b或者来自大鼠、小鼠、牛、鲐鱼、鲫鱼、非洲爪蟾、鱼雷鱼、海胆、乌贼、椎实螺、猕猴(恒河猴)、黑猩猩或海兔的其直系同源物、旁系同源物或直向同源物。鼠类和人类snap-25的相应氨基酸序列分别示于例如uniprot入藏登记号p60879和p60880中。snap-25可以用作天然存在的重组、外源或内源核酸分子或多肽。上述snap-25蛋白中的bont/e切割位点例如在ep1926744b1中公开。
可以用作本发明方法中的第一捕获抗体的适当抗体的实例包括例如兔多克隆抗snap-25抗体s9684(sigma)(fernández-salase,wangj,molinay,nelsonjb,jackybps等,(2012)botulinumneurotoxinserotypeaspecificcell-basedpotencyassaytoreplacethemousebioassay.plosone7(11):e49516.doi:10.1371/journal.pone.0049516)、兔多克隆抗snap25抗体pa5-19708(pierceantibodies)、兔单克隆抗snap25抗体ab108990(abcam)或兔多克隆抗snap25抗体pa5-19701(pierceantibodies)。
在本发明方法的另一个方面，特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体可以具有例如小于1×105m-1s-1、小于1×106m-1s-1、小于1×107m-1s-1或小于1×108m-1s-1的缔合速率常数。在另一个方面，特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体可以具有例如大于1×105m-1s-1、大于1×106m-1s-1、大于1×107m-1s-1或大于1×108m-1s-1的缔合速率常数。在另一个方面，特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体可以具有例如小于1×10-3s-1、小于1×10-4s-1、小于1×10-5s-1或小于1×10-6s-1的解离速率常数。在另一个方面，特异性结合bont/e非切割的和bont/e切割的底物snap-25的第一捕获抗体可以具有例如大于1×10-3s-1、大于1×10-4s-1、大于1×10-5s-1或大于1×10-6s-1的解离速率常数。如本领域中已知的，缔合速率常数是用于表征抗体与其靶标的结合速率的常数。解离速率常数是用于表征抗体与其靶标的解离速率的常数。
在另一个方面，第一捕获抗体用于归一化细胞中bont/e切割的snap-25。
在本发明方法的另一个方面，特异性结合bont/e切割的snap-25的第二捕获抗体是本发明的多克隆或单克隆抗体。因此，关于本发明抗体的定义和实施方案加以必要的变更适用于本发明方法中使用的第二捕获抗体。在本发明方法的另一个方面，第二捕获抗体是如jones等,《免疫学方法杂志(journalofimmunologicalmethods)》,329(2008),第92-101页中所述的bont/e切割位点特异性抗体。
如本文所用的术语“第一检测抗体”是特异性结合第一捕获抗体的抗体。所述第一检测抗体允许特异性检测第一捕获抗体。通过测量结合的第一检测抗体的量，可以确定第一检测复合物的量，因为第一检测复合物中结合的第一检测抗体的量与第一检测复合物所包含的第一捕获抗体的量(以及相应地总snap-25(即bont/e切割的和非切割的snap-25)的量)相关。例如，适当的物种特异性抗体可以用作第一检测抗体：如果已使用小鼠抗体作为第一捕获抗体，则所述第一检测抗体可以是特异性结合小鼠抗体的抗小鼠抗体。所述第一检测抗体可以是例如碱性磷酸酶(ap)结合抗体、辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体或与荧光染料结合的抗体。例如通过使用戊二醛将酶与抗体结合是本领域中熟知的。
已经使用酶联免疫吸附测定法(elisa)来定量广泛多种化合物和病原体近40年。最初，使用放射性来定量测定法，但放射免疫测定法(ria)已经用利用酶的测定法代替，以获得比色结果。最近，已开发了新的底物来制备荧光和发光产品。新测定法的基本原理与比色测定法保持相同：底物通过与抗体结合的蛋白质的酶活性转化成可测量的化合物，其赋予特异性。
elisa中常用的酶结合物是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。因此，在一个方面，第一检测抗体可以例如与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶结合。在本发明方法中可用作第一检测抗体的酶结合物的其它实例包括使用葡萄糖作为底物的葡萄糖氧化酶，转化底物1-(4-甲基-香豆素-7-基)-3-(4-羟基苯基)脲)(pap-amc)的酪氨酸酶(stratisavrameas,《免疫化学(immunochemistry)》,第6卷,第1期,1969年1月,第43-48页,in9-in11,49-52)，或转化底物6,8-二氟-4-甲基伞形酮β-d-吡喃半乳糖苷(difmug)的β-半乳糖苷酶(gee等,《分析生物化学(analyticalbiochemistry)》,第273卷,第1期,1999年8月,第41-48页)。加入底物后，所述底物由酶转化为可检测的形式。例如，碱性磷酸酶催化磷酸酯的切割。如果使用碱性磷酸酶(ap)结合抗体作为第一检测抗体，则适当的底物如4-甲基伞形酮磷酸酯衍生物，例如6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(difmup)或二磷酸荧光素(fdp)。6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(difmup)被ap转化成可检测的形式，即荧光产物6,8-二氟-4-甲基伞形酮。所述底物例如由molecularprobes提供。difmup的该反应产物的荧光强度可以使用约358/450nm的激发/发射最大值来测量。可用于此目的的其它底物是9h-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(ddao-磷酸酯；invitrogen)、二磷酸荧光素(fdp；sigmaaldrich)或4-甲基伞形酮磷酸酯(mup；invitrogen)。ddao-磷酸酯由ap转化成具有约646/659nm的激发/发射最大值的荧光产物二甲基吖啶酮(ddao)。如果fdp用作ap的底物，则反应产物是荧光素，具有约490/514nm的激发/发射最大值。对于mup，相应的反应产物是4-甲基伞形酮(7-羟基-4-甲基香豆素)，具有约360/449nm的激发/发射最大值。这些底物也可例如从molecularprobes商购获得。可选地，可以使用辣根过氧化物酶作为本发明方法的第一检测抗体中的酶结合物。辣根过氧化物酶(hrp)催化将过氧化氢(h2o2)还原成水(h2o)。在作为氢供体的特定底物存在下，hrp的作用分别将无色或非荧光分子转化为有色和/或荧光部分。例如，
可选地，第一检测抗体可以携带适当的可检测标记，其允许检测第一捕获抗体。可以通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标记直接(共价地或非共价地)结合到第一检测抗体。间接标记涉及特异性结合第一检测抗体并携带可检测标记的试剂的结合(共价地或非共价地)。这样的试剂可以是例如与第一检测抗体特异性结合的二级(高级)抗体。这种情况下的二级抗体将与可检测的标记偶联。应当理解，除了第一检测复合物的检测之外，还可以使用更高级的抗体。高级抗体通常用于增加信号。合适的高级抗体还可以包括众所周知的抗生物素蛋白链菌素-生物素系统(vectorlaboratories,inc.)和众所周知的dakolsabtm2和lsabtm+(标记的抗生物素蛋白链菌素-生物素)或dakopap(过氧化物酶抗过氧化物酶)。在另一个方面，第一检测抗体的所述标记是荧光染料，即第一抗体与荧光染料结合。在这种情况下，可以通过荧光读取器直接测量荧光。典型的荧光标记包括荧光蛋白如gfp和其衍生物，cy染料如cy3或cy5，德克萨斯红，荧光素和alexa染料(例如alexa568)。
如本文所用的“第二检测抗体”是特异性结合第二捕获抗体的抗体。所述第二检测抗体可以例如与酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或酪氨酸酶结合。因此，在一个方面，所述第二检测抗体是碱性磷酸酶(ap)结合抗体、辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体、葡萄糖氧化酶结合抗体或酪氨酸酶结合抗体。所述第二检测抗体允许特异性检测第二捕获抗体。通过测量结合的第二检测抗体的量，可以确定第二检测复合物的量，因为第二检测复合物中结合的第二检测抗体的量与第二检测复合物所包含的第二捕获抗体的量(以及相应地bont/e切割的snap-25的量)相关。例如，如果已使用小鼠抗体作为第二捕获抗体，则抗小鼠抗体可以用作第二检测抗体。所述第二检测抗体可以携带如上所述的酶或如本文其它地方关于第一检测抗体所述的标记如荧光染料(即第二检测抗体与荧光染料结合)。在本发明方法的一个方面，与第一检测抗体结合的酶不同于与第二检测抗体结合的酶，以允许在本发明方法中特异性检测相应的第一捕获抗体和第二捕获抗体。例如，如果第一检测抗体是ap结合抗体，则第二检测抗体可以是辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体，反之亦然。此外，ap和hrp的荧光底物的激发/发射光谱基本上不重叠但彼此不同，即它们显示明显的偏移，以便区分由各个产物产生的荧光强度。例如，difmup在约358/450nm处表现出激发/发射，而amplexultrared表现出约570/585nm的激发/发射，从而允许精确测量通过利用相应的酶转化所述荧光底物而产生的荧光强度。在另一个方面，碱性磷酸酶(ap)结合抗体被用作在细胞中过量存在的抗原的第一检测抗体，即用于测量细胞中总(bont/e切割的和非切割的)snap-25的总量。辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体被用作在细胞中以较低量存在的抗原的第二检测抗体，即用于测量细胞中bont/e切割的snap-25的量。如本领域中已知的，hrp底物比ap底物更敏感，这意味着可以检测较低量的被分析物。如果使用hrp抗体作为用于检测bont/e切割的snap-25的二级抗体，则可检测到较低量的bont/e切割的snap-25。反过来，可以确定较低量的bont/e，从而提高测定法的灵敏度。因为ap抗体测量细胞中snap-25的总量，所以由于被分析物过量而不需要对底物的高灵敏度。
如本文所用的术语“至少”，例如“至少第一捕获抗体”，是指除了特异性结合非切割的和bont/e切割的底物的抗体之外，一种或多种具有所述特异性的其它抗体也可以用于本发明的方法中。类似地，“至少第二捕获抗体”是指除了特异性结合bont/e切割的snap-25的切割位点的本发明抗体之外，一种或多种具有所述特异性的其它抗体也可以用于本发明的方法中。此外，一种或多种特异性结合第一检测抗体(或多种第一检测抗体)的第一检测抗体可以用于本发明的方法中。类似地，一种或多种特异性结合第二检测抗体(或多种第二检测抗体)的第二检测抗体可以用于本发明的方法中。
术语“第一检测复合物”是指包含第一捕获抗体和第一检测抗体的复合物，其特异性结合于非切割的和bont/e切割的snap-25，从而允许确定细胞中snap-25的总含量。第一检测复合物的量可以通过测定特异性结合的第一检测抗体的量来测量。这可以取决于酶的性质或第一检测抗体的标记，例如通过测量荧光强度来实现。
术语“第二检测复合物”是指包含第二捕获抗体和第二检测抗体的复合物，其特异性结合于bont/e切割的snap-25的切割位点，从而允许确定细胞中bont/e切割的snap-25的含量。第二检测复合物的量可以通过测定特异性结合的第二检测抗体的量来测量。这可以取决于酶的性质或第二检测抗体的标记，例如通过测量荧光强度来实现。
可以设想，除了酶联免疫吸附分析(elisa)之外，任何检测系统都可以用于实施本发明方法的方面，其条件是，信噪比可以在统计学显著程度上区分来自所形成的抗体-抗原复合物的信号与背景信号。基于免疫的检测系统的非限制性实例包括免疫印迹分析如western印迹法和斑点印迹法，免疫沉淀分析和夹心elisa。信号的检测可以使用利用成像或磷光成像(au)的放射自显影术、生物发光(bl)、荧光、共振能量转移、平面偏振、比色或流式细胞术(fc)来实现。基于免疫的检测系统的描述公开在例如《分子克隆的常用技术(commonlyusedtechniquesinmolecularcloning)》,第a8.1-a8-55页(sambrook和russell编,《分子克隆：实验室手册(molecularcloningalaboratorymanual)》,第3卷,增补修订版3,2001)；《检测系统(detectionsystems)》,第a9.1-a9-49页(sambrook和russell编,《分子克隆：实验室手册(molecularcloningalaboratorymanual)》,第3卷,增补修订版3,2001)中。
在本发明方法的一个方面，所述方法是荧光方法。
在另一个方面，如本文所提及的细胞、抗体如本发明的抗体、神经毒素多肽如bont/e和神经毒素底物如snap-25或任何其它产物分别是分离的细胞、抗体、神经毒素多肽、神经毒素底物或产物。如本文所用，术语“分离的”例如分离的抗体是指通过使用人类干预从其天然环境分离的分子。
在本发明方法的一个方面，所述bont/e神经毒素多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)如seqidno:10、seqidno:12或seqidno:14所示的氨基酸序列；和
b)与如seqidno:10、seqidno:12或seqidno:14所示的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明方法的另一个方面，所述细胞是选自以下的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞，能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞如神经母细胞瘤细胞，p19细胞或诱导多能干细胞(ips)衍生的神经元。
在本发明方法的另一个方面，通过加入选自以下的固定剂来固定细胞：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物。
在本发明方法的另一个方面，特异性结合非切割的和bont/e切割的底物的所述第一捕获抗体是兔多克隆抗snap-25抗体s9684、兔多克隆抗snap25抗体pa5-19708(pierceantibodies)、兔单克隆抗snap25抗体ab108990(abcam)或兔多克隆抗snap25抗体pa5-19701(pierceantibodies)。
在本发明方法的一个方面，所述第一检测抗体是碱性磷酸酶(ap)结合抗体、辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体或与荧光染料结合的抗体。
在本发明方法的一个方面，所述第二检测抗体是碱性磷酸酶(ap)结合抗体、辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体、葡萄糖氧化酶结合抗体、酪氨酸酶结合抗体或β-半乳糖苷酶抗体。优选地，所述第二检测抗体不同于所述第一检测抗体。
在本发明方法的另一个方面，所述hrp底物是amplexultrared、10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(adhp)或3-(4-羟基苯基)丙酸(hppa)。
在本发明方法的另一个方面，其中所述ap底物是4-甲基伞形酮磷酸酯衍生物例如6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(difmup)，或二磷酸荧光素(fdp)。
本发明还涉及一种用于执行本发明方法的试剂盒，其包括：
a)第一捕获抗体、优选是本发明的多克隆或单克隆抗体的第二捕获抗体、第一检测抗体和第二检测抗体的配置，其中所述配置允许执行本发明的方法；
b)基于根据a)的配置测定的第二检测复合物的量，用于计算通过bont/e切割的snap-25的量的装置；和
c)用于执行本发明的所述方法的说明书。
如本文所用的术语“试剂盒”是指可能或可能不包装在一起的上述本发明装置或试剂的集合。试剂盒的组分可以由独立的小瓶(即，作为单独部分的试剂盒)包含或提供在单个小瓶中。此外，应当理解，本发明的试剂盒用于实施上文所提及的方法。在一个方面，可以设想所有组分都是以现成的方式提供，用于实施本文提及的方法。在另一个方面，该试剂盒包含用于执行所述方法的说明书。所述说明书可以通过纸质或电子形式的用户手册提供。例如，所述手册可以包括用于解释在使用本发明的试剂盒执行上述方法时获得的结果的指令。
最后，本发明在另一个方面涉及用于制造用于药物或化妆品应用中的配制的bont/e神经毒素产品或bont/e-mdm2神经毒素产品的方法，其包括：(i)通过本发明的方法测定bont/e神经毒素或bont/e-mdm2神经毒素多肽的生物活性，和(ii)配制用于药物或化妆品应用中的bont/e神经毒素或bont/e-mdm2神经毒素多肽，以便获得配制的bont/e神经毒素产品或bont/e-mdm2神经毒素产品。bont/e神经毒素或bont/e-mdm2神经毒素多肽可以通过依赖于本领域已知的所需应用目的的各种技术配制成bont/e神经毒素产品或bont/e-mdm2神经毒素产品。例如，(生物活性)bont/e神经毒素多肽可以与一种或多种药学上可接受的载体组合作为药物组合物使用。所述药学上可接受的载体在与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是可接受的。所用的药物载体可包括固体、凝胶或液体。固体载体的实例是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例是甘油、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液、各种类型的润湿剂等。合适的载体包括上述载体和本领域熟知的其它载体，参见例如《雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》,mackpublishingcompany,easton,pennsylvania。在一个方面，药物组合物可以在施用之前溶解在稀释剂中。所述稀释剂也被选择为不影响bont/e或bont/e-mdm2神经毒素多肽的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水或生理盐水。另外，药物组合物或制剂还可以包括其它载体或无毒的非治疗性非免疫原性稳定剂等。因此，所配制的bont/e神经毒素产品或bont/e-mdm2神经毒素产品在一个方面可以液体或冻干形式存在。在一个方面，它可以与甘油、蛋白质稳定剂(hsa)或非蛋白质稳定剂如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、透明质酸或游离氨基酸一起存在。在一个方面，wo2005/007185或wo2006/020208中公开了合适的非蛋白质稳定剂。在一个方面，通过本发明方法根据步骤(i)测定的生物活性对应于25、50、75、100、125、150或200u(小鼠ld50单位)的bont/e神经毒素或bont/e-mdm2神经毒素多肽活性。所配制的bont/e神经毒素产品或bont/e-mdm2神经毒素产品可以治疗有效剂量用于各种疾病或病症的人类或动物治疗或用于美容目的。
如本文所提及的疾病或病症选自：随意肌力量，局灶性肌张力障碍包括子宫颈、颅肌张力障碍，和良性原发性眼睑痉挛、半面痉挛和局灶性痉挛状态，胃肠道病症，多汗症和美容除皱，眼睑痉挛，开颌型/闭颌型口下颌肌张力障碍，磨牙症，梅格综合征，舌侧肌张力障碍，眼睑失用症，开放性颈椎肌张力障碍，颈前倾症(antecollis)，颈后仰症(retrocollis)，侧向斜颈，斜颈，咽肌张力障碍，喉肌张力障碍，内收肌型痉挛性发声障碍，外展肌型痉挛性发声障碍，痉挛性呼吸困难，肢体肌张力障碍，手臂肌张力障碍，任务特异性肌张力障碍，书写痉挛，音乐家痉挛，高尔夫球手痉挛，大腿内收/大腿外展型腿肌张力障碍，膝关节屈曲，膝关节伸展，踝关节屈曲，踝关节伸展，马蹄内翻足，畸形足肌张力障碍，纹状体脚趾，脚趾屈曲，脚趾伸展，轴向肌张力障碍，比萨综合征，肚皮舞者肌张力障碍，节段性肌张力障碍，偏身肌张力障碍，广泛性肌张力障碍，lubag综合征中的肌张力障碍，皮质基底节变性中的肌张力障碍，lubag综合征中的肌张力障碍，迟发性肌张力障碍，脊髓小脑性共济失调中的肌张力障碍，帕金森病中的肌张力障碍，亨廷顿氏病中的肌张力障碍，hallervorden-spatz病中的肌张力障碍，多巴诱发的运动障碍/多巴诱发的肌张力障碍，迟发性运动障碍/迟发性肌张力障碍，阵发性运动障碍/肌张力障碍，运动诱发性/非运动诱发性作用诱导的腭肌阵挛，肌阵挛性肌无力，僵硬，良性肌肉痉挛，遗传性下巴颤抖，矛盾性颌肌活动，半侧咀嚼肌痉挛，肥大性支气管肌病，咬肌肥大，胫骨前肌肥大，眼球震颤，振动幻视核上性凝视麻痹，持续性不全癫痫，痉挛性斜颈手术计划，外展肌声带麻痹，顽固性突变性发声障碍，上食管括约肌功能障碍，声带肉芽肿，口吃，抽动秽语综合征(gillesdelatourettesyndrome)，中耳肌阵挛，喉切除术后保护性喉闭合，言语衰竭，保护性上睑下垂，睑内翻，odii括约肌功能障碍，假性贲门失弛缓症，非贲门失弛缓症，食管运动障碍，阴道炎，术后固定性震颤，膀胱功能障碍，逼尿肌括约肌协同失调，膀胱括约肌痉挛，半面痉挛，神经再支配运动障碍，精神错乱，僵人综合征，破伤风，前列腺增生，肥胖症，治疗婴儿脑性麻痹，在视网膜脱离手术后、白内障手术后伴随的混合麻痹性斜视，无晶状体肌炎性斜视，肌病性斜视，解离性垂直偏差，斜视手术辅助，内斜视，外斜视，贲门失弛缓症，肛裂，外分泌腺多动症，frey综合征，鳄鱼眼综合征，多汗症，腋掌跖脓疱，中风、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症中的相对唾液分泌过多，脑炎和脊髓炎自身免疫过程中的痉挛状态，多发性硬化，横纹性脊髓炎，devic综合征，病毒感染，细菌感染，寄生虫感染，真菌感染，遗传性痉挛性截瘫中风后综合征大脑半球梗塞，脑干梗塞，脊髓梗死，中枢神经系统创伤，大脑半球病变，脑干病变，脊髓病变，中枢神经系统出血，脑内出血，蛛网膜下腔出血，硬膜下出血，脊柱内出血，肿瘤形成，大脑半球肿瘤，脑干肿瘤，脊髓肿瘤和阴道炎。美容用途选自治疗或减少皱纹如鱼尾纹或gfl、皱眉纹、面部不对称。
本说明书中引用的所有参考文献通过引用其全部公开内容而因此并入并且其公开内容在本说明书中具体提及。
附图说明
图1：表示本发明的基于细胞的测定法的作用模式的图解。将对bont/e中毒敏感的细胞接种在多孔板中。此后，用bont/e使细胞中毒，并且在给定的中毒期后，将细胞固定。bont/e切割的snap-25的特异性抗体和未切割的snap-25的特异性抗体与snap-25上的特异性结合位点结合。使用酶偶联抗宿主特异性二级抗体，这些结合事件可用于产生与孔内的bont/e切割的snap-25浓度和snap-25总量相关的可测量信号。随着bont/e浓度增加，所测量的切割的snap-25的量增加，导致信号增益。
具体实施方式
现在将通过以下实施例说明本发明，然而这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：特异性结合bont/e切割的底物snap-25的切割位点的单克隆抗体的产生
已使用杂交瘤标准技术生成了特异性结合bont/e切割的底物snap-25的切割位点的小鼠单克隆抗体。为此，用肽“c-neidtqnrqidr-oh”(seqidno:1)使balb/c小鼠(雌性，8周)免疫化。n端半胱氨酸残基不是衍生自snap-25氨基酸序列，而是已被引入以将肽连接到钥孔血蓝蛋白(klh)。已通过将小鼠脾细胞与购自germancollectionofmicroorganismsandcellculture(dsmzgmbh,braunschweig,acc146)的骨髓瘤细胞系sp2/0-ag14(sp2/0)融合而获得杂交瘤细胞；也参见hemmerlein等,《分子癌症(molecularcancer)》,2006,5,41。在elisa中筛选特异性结合bont/e切割的底物snap-25的切割位点的抗体。所获得的克隆已经关于其对bont/e切割的snap-25的特异性和亲和力进行了选择。作为阴性对照，已经对克隆测试了其与非切割的snap-25206的非结合。结果发现杂交瘤pcnei32-7-1,3614-000产生的小鼠单克隆抗体对于bont/e切割的snap-25具有高度特异性，在elisa和western印迹法中没有可检测的与snap25206的交叉反应性。
产生特异性结合bont/e切割的snap-25的本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞系pcnei32-7-1,3614-000已经由本申请人根据布达佩斯条约于2014年12月17日以入藏登记号dsmacc3261保藏在dsmz–deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,inhoffenstraβe7b,38124braunschweig,germany。该单克隆抗体的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的氨基酸序列分别如seqidno.18、19和20所示。该单克隆抗体的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的氨基酸序列分别如seqidno.15、16和17所示。该单克隆抗体的vh区的氨基酸序列如seqidno.22所示，并且该单克隆抗体的vl区的氨基酸序列如seqidno.21所示。
实施例2：双重荧光-cb-bont/e活性elisa
细胞固定
1.除去培养基/毒素溶液。加入100微升/孔冰冷甲醇(-20℃)并在-20℃下温育20分钟。
注意：在室温下进行所有后续步骤。
细胞固定后：
1.除去甲醇溶液并加入100微升/孔pbs缓冲液。对于较长时间储存(>1天)，应该加入300微升/孔pbs缓冲液并用parafilm将板密封。所述板应该储存在冰箱中。
2.除去pbs缓冲液并用300微升/孔pbs缓冲液将细胞洗涤3次。每个步骤应该在轻轻摇动下进行1分钟。
3.除去pbs缓冲液并加入100微升/孔淬灭缓冲液并在轻轻摇动下温育20分钟。
4.除去淬灭缓冲液并在轻轻摇动下用300微升/孔pbs缓冲液洗涤细胞一次，持续3分钟。
5.除去pbs缓冲液，并且加入200微升/孔封闭缓冲液并在轻轻摇动下温育1小时。
6.除去所述封闭缓冲液并向每个孔中加入100μl初级抗体混合物(在封闭缓冲液中的抗体稀释液)。在轻轻摇动下温育过夜(16-18小时)。用以下两种初级抗体同时温育细胞：对bont/e切割的snap25具特异性的小鼠抗体和识别snap-25的多克隆兔抗体(用于测定snap-25总量的抗体以用于归一化)。
7.除去初级抗体混合物并用300μlpbs缓冲液洗涤细胞4次。每个步骤应该在轻轻摇动下进行3分钟。
9.除去pbs缓冲液，并向每个孔中加入100μl二级抗体混合物：hrp结合的抗小鼠二级抗体和ap结合的抗兔二级抗体(在封闭缓冲液中的抗体稀释液)，并在轻轻摇动下温育2.5至3小时。
10.除去二级抗体混合物并用300微升/孔的hepes缓冲液将细胞洗涤6次。每个洗涤步骤应该在轻轻摇动下进行3分钟。
11.从板中除去hepes缓冲液并向每个孔中加入75μl辣根过氧化物酶的荧光底物(hrp底物)。在轻轻摇动下温育50分钟。保护板避免直射光。
12.向每个孔中加入75μl碱性磷酸酶的荧光底物(ap底物)并在轻轻摇动下再温育50分钟。保护板避免直射光。
13.使用荧光板读取器来读取板：
以540nm激发；以600nm发射。
以360nm激发；以450nm发射。
15.计算
对于归一化，将bont/e切割的snap-25的rfu值(600nm荧光)归一化为每个孔中的总snap-25的rfu(450nm)。为了更好地说明图解中的rfu，使用以下公式将所有值都乘以因子1000：
随后，对于每个标准物或样品，对所得rfu值取平均。
试剂制备
pbs缓冲液(10mm)：
磷酸盐缓冲盐水(sigma，#p5368)(ph7.4)
淬灭缓冲液：
含0.6％h2o2的10mmpbs缓冲液(ph7.4)
封闭缓冲液：
含2％bsa的10mmpbs缓冲液(ph7.4)
hepes缓冲液：
50mmhepes(ph7.4)
hrp底物：
50mmhepes(ph7.4)
0.007％h2o2
150μmamplexultrared
ap底物：
25mm二乙醇胺(ph9.8)
2mmmgcl2
100μmdifmup
序列表
<110>莫茨药物股份两合公司
<120>用于测定bont/e在细胞中的生物活性的装置和方法
<130>mp12918pc
<150>ep14199282.6
<151>2014-12-19
<160>22
<170>patentin3.5版
<210>1
<211>13
<212>prt
<213>人工
<220>空白
<223>bont/e表位
<400>1
cysasngluileaspthrglnasnargglnileasparg
<210>2
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>2
asngluileaspthrglnasnargglnileasparg
<210>3
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>3
gluileaspthrglnasnargglnileasparg
<210>4
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>4
ileaspthrglnasnargglnileasparg
<210>5
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>5
aspthrglnasnargglnileasparg
<210>6
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>6
thrglnasnargglnileasparg
<210>7
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>7
glnasnargglnileasparg
<210>8
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>8
asnargglnileasparg
<210>9
<211>3756
<212>dna
<213>肉毒梭菌
<400>9
atgccaaaaattaatagttttaattataatgatcctgttaatgatagaacaattttatat60
attaaaccaggcggttgtcaagaattttataaatcatttaatattatgaaaaatatttgg120
ataattccagagagaaatgtaattggtacaaccccccaagattttcatccgcctacttca180
ttaaaaaatggagatagtagttattatgaccctaattatttacaaagtgatgaagaaaag240
gatagatttttaaaaatagtcacaaaaatatttaatagaataaataataatctttcagga300
gggattttattagaagaactgtcaaaagctaatccatatttagggaatgataatactcca360
gataatcaattccatattggtgatgcatcagcagttgagattaaattctcaaatggtagc420
caagacatactattacctaatgttattataatgggagcagagcctgatttatttgaaact480
aacagttccaatatttctctaagaaataattatatgccaagcaatcaccgttttggatca540
atagctatagtaacattctcacctgaatattcttttagatttaatgataattgtatgaat600
gaatttattcaagatcctgctcttacattaatgcatgaattaatacattcattacatgga660
ctatatggggctaaagggattactacaaagtatactataacacaaaaacaaaatccccta720
ataacaaatataagaggtacaaatattgaagaattcttaacttttggaggtactgattta780
aacattattactagtgctcagtccaatgatatctatactaatcttctagctgattataaa840
aaaatagcgtctaaacttagcaaagtacaagtatctaatccactacttaatccttataaa900
gatgtttttgaagcaaagtatggattagataaagatgctagcggaatttattcggtaaat960
ataaacaaatttaatgatatttttaaaaaattatacagctttacggaatttgatttacga1020
actaaatttcaagttaaatgtaggcaaacttatattggacagtataaatacttcaaactt1080
tcaaacttgttaaatgattctatttataatatatcagaaggctataatataaataattta1140
aaggtaaattttagaggacagaatgcaaatttaaatcctagaattattacaccaattaca1200
ggtagaggactagtaaaaaaaatcattagattttgtaaaaatattgtttctgtaaaaggc1260
ataaggaaatcaatatgtatcgaaataaataatggtgagttattttttgtggcttccgag1320
aatagttataatgatgataatataaatactcctaaagaaattgacgatacagtaacttca1380
aataataattatgaaaatgatttagatcaggttattttaaattttaatagtgaatcagca1440
cctggactttcagatgaaaaattaaatttaactatccaaaatgatgcttatataccaaaa1500
tatgattctaatggaacaagtgatatagaacaacatgatgttaatgaacttaatgtattt1560
ttctatttagatgcacagaaagtgcccgaaggtgaaaataatgtcaatctcacctcttca1620
attgatacagcattattagaacaacctaaaatatatacatttttttcatcagaatttatt1680
aataatgtcaataaacctgtgcaagcagcattatttgtaagctggatacaacaagtgtta1740
gtagattttactactgaagctaaccaaaaaagtactgttgataaaattgcagatatttct1800
atagttgttccatatataggtcttgctttaaatataggaaatgaagcacaaaaaggaaat1860
tttaaagatgcacttgaattattaggagcaggtattttattagaatttgaacccgagctt1920
ttaattcctacaattttagtattcacgataaaatcttttttaggttcatctgataataaa1980
aataaagttattaaagcaataaataatgcattgaaagaaagagatgaaaaatggaaagaa2040
gtatatagttttatagtatcgaattggatgactaaaattaatacacaatttaataaaaga2100
aaagaacaaatgtatcaagctttacaaaatcaagtaaatgcaattaaaacaataatagaa2160
tctaagtataatagttatactttagaggaaaaaaatgagcttacaaataaatatgatatt2220
aagcaaatagaaaatgaacttaatcaaaaggtttctatagcaatgaataatatagacagg2280
ttcttaactgaaagttctatatcctatttaatgaaaataataaatgaagtaaaaattaat2340
aaattaagagaatatgatgagaatgtcaaaacgtatttattgaattatattatacaacat2400
ggatcaatcttgggagagagtcagcaagaactaaattctatggtaactgataccctaaat2460
aatagtattccttttaagctttcttcttatacagatgataaaattttaatttcatatttt2520
aataaattctttaagagaattaaaagtagttcagttttaaatatgagatataaaaatgat2580
aaatacgtagatacttcaggatatgattcaaatataaatattaatggagatgtatataaa2640
tatccaactaataaaaatcaatttggaatatataatgataaacttagtgaagttaatata2700
tctcaaaatgattacattatatatgataataaatataaaaattttagtattagtttttgg2760
gtaagaattcctaactatgataataagatagtaaatgttaataatgaatacactataata2820
aattgtatgagagataataattcaggatggaaagtatctcttaatcataatgaaataatt2880
tggacattcgaagataatcgaggaattaatcaaaaattagcatttaactatggtaacgca2940
aatggtatttctgattatataaataagtggatttttgtaactataactaatgatagatta3000
ggagattctaaactttatattaatggaaatttaatagatcaaaaatcaattttaaattta3060
ggtaatattcatgttagtgacaatatattatttaaaatagttaattgtagttatacaaga3120
tatattggtattagatattttaatatttttgataaagaattagatgaaacagaaattcaa3180
actttatatagcaatgaacctaatacaaatattttgaaggatttttggggaaattatttg3240
ctttatgacaaagaatactatttattaaatgtgttaaaaccaaataactttattgatagg3300
agaaaagattctactttaagcattaataatataagaagcactattcttttagctaataga3360
ttatatagtggaataaaagttaaaatacaaagagttaataatagtagtactaacgataat3420
cttgttagaaagaatgatcaggtatatattaattttgtagccagcaaaactcacttattt3480
ccattatatgctgatacagctaccacaaataaagagaaaacaataaaaatatcatcatct3540
ggcaatagatttaatcaagtagtagttatgaattcagtaggaaattgtacaatgaatttt3600
aaaaataataatggaaataatattgggttgttaggtttcaaggcagatactgtcgttgct3660
agtacttggtattatacacatatgagagatcatacaaacagcaatggatgtttttggaac3720
tttatttctgaagaacatggatggcaagaaaaataa3756
<210>10
<211>1251
<212>prt
<213>肉毒梭菌
<400>10
metprolysileasnserpheasntyrasnaspprovalasnasparg
151015
thrileleutyrilelysproglyglycysglngluphetyrlysser
202530
pheasnilemetlysasniletrpileileprogluargasnvalile
354045
glythrthrproglnaspphehisproprothrserleulysasngly
505560
aspsersertyrtyraspproasntyrleuglnseraspgluglulys
65707580
aspargpheleulysilevalthrlysilepheasnargileasnasn
859095
asnleuserglyglyileleuleuglugluleuserlysalaasnpro
100105110
tyrleuglyasnaspasnthrproaspasnglnphehisileglyasp
115120125
alaseralavalgluilelyspheserasnglyserglnaspileleu
130135140
leuproasnvalileilemetglyalagluproaspleuphegluthr
145150155160
asnserserasnileserleuargasnasntyrmetproserasnhis
165170175
argpheglyserilealailevalthrpheserproglutyrserphe
180185190
argpheasnaspasncysmetasnglupheileglnaspproalaleu
195200205
thrleumethisgluleuilehisserleuhisglyleutyrglyala
210215220
lysglyilethrthrlystyrthrilethrglnlysglnasnproleu
225230235240
ilethrasnileargglythrasnilegluglupheleuthrphegly
245250255
glythraspleuasnileilethrseralaglnserasnaspiletyr
260265270
thrasnleuleualaasptyrlyslysilealaserlysleuserlys
275280285
valglnvalserasnproleuleuasnprotyrlysaspvalpheglu
290295300
alalystyrglyleuasplysaspalaserglyiletyrservalasn
305310315320
ileasnlyspheasnaspilephelyslysleutyrserphethrglu
325330335
pheaspleuargthrlyspheglnvallyscysargglnthrtyrile
340345350
glyglntyrlystyrphelysleuserasnleuleuasnaspserile
355360365
tyrasnilesergluglytyrasnileasnasnleulysvalasnphe
370375380
argglyglnasnalaasnleuasnproargileilethrproilethr
385390395400
glyargglyleuvallyslysileileargphecyslysasnileval
405410415
servallysglyilearglysserilecysilegluileasnasngly
420425430
gluleuphephevalalasergluasnsertyrasnaspaspasnile
435440445
asnthrprolysgluileaspaspthrvalthrserasnasnasntyr
450455460
gluasnaspleuaspglnvalileleuasnpheasnsergluserala
465470475480
proglyleuseraspglulysleuasnleuthrileglnasnaspala
485490495
tyrileprolystyraspserasnglythrseraspilegluglnhis
500505510
aspvalasngluleuasnvalphephetyrleuaspalaglnlysval
515520525
progluglygluasnasnvalasnleuthrserserileaspthrala
530535540
leuleugluglnprolysiletyrthrphepheserserglupheile
545550555560
asnasnvalasnlysprovalglnalaalaleuphevalsertrpile
565570575
glnglnvalleuvalaspphethrthrglualaasnglnlysserthr
580585590
valasplysilealaaspileserilevalvalprotyrileglyleu
595600605
alaleuasnileglyasnglualaglnlysglyasnphelysaspala
610615620
leugluleuleuglyalaglyileleuleugluphegluprogluleu
625630635640
leuileprothrileleuvalphethrilelysserpheleuglyser
645650655
seraspasnlysasnlysvalilelysalaileasnasnalaleulys
660665670
gluargaspglulystrplysgluvaltyrserpheilevalserasn
675680685
trpmetthrlysileasnthrglnpheasnlysarglysgluglnmet
690695700
tyrglnalaleuglnasnglnvalasnalailelysthrileileglu
705710715720
serlystyrasnsertyrthrleugluglulysasngluleuthrasn
725730735
lystyraspilelysglnilegluasngluleuasnglnlysvalser
740745750
ilealametasnasnileaspargpheleuthrgluserserileser
755760765
tyrleumetlysileileasngluvallysileasnlysleuargglu
770775780
tyraspgluasnvallysthrtyrleuleuasntyrileileglnhis
785790795800
glyserileleuglygluserglnglngluleuasnsermetvalthr
805810815
aspthrleuasnasnserileprophelysleusersertyrthrasp
820825830
asplysileleuilesertyrpheasnlysphephelysargilelys
835840845
serserservalleuasnmetargtyrlysasnasplystyrvalasp
850855860
thrserglytyraspserasnileasnileasnglyaspvaltyrlys
865870875880
tyrprothrasnlysasnglnpheglyiletyrasnasplysleuser
885890895
gluvalasnileserglnasnasptyrileiletyraspasnlystyr
900905910
lysasnpheserileserphetrpvalargileproasntyraspasn
915920925
lysilevalasnvalasnasnglutyrthrileileasncysmetarg
930935940
aspasnasnserglytrplysvalserleuasnhisasngluileile
945950955960
trpthrphegluaspasnargglyileasnglnlysleualapheasn
965970975
tyrglyasnalaasnglyileserasptyrileasnlystrpilephe
980985990
valthrilethrasnaspargleuglyaspserlysleutyrileasn
99510001005
glyasnleuileaspglnlysserileleuasnleuglyasnile
101010151020
hisvalseraspasnileleuphelysilevalasncyssertyr
102510301035
thrargtyrileglyileargtyrpheasnilepheasplysglu
104010451050
leuaspgluthrgluileglnthrleutyrserasngluproasn
105510601065
thrasnileleulysaspphetrpglyasntyrleuleutyrasp
107010751080
lysglutyrtyrleuleuasnvalleulysproasnasnpheile
108510901095
aspargarglysaspserthrleuserileasnasnileargser
110011051110
thrileleuleualaasnargleutyrserglyilelysvallys
111511201125
ileglnargvalasnasnserserthrasnaspasnleuvalarg
113011351140
lysasnaspglnvaltyrileasnphevalalaserlysthrhis
114511501155
leupheproleutyralaaspthralathrthrasnlysglulys
116011651170
thrilelysileserserserglyasnargpheasnglnvalval
117511801185
valmetasnservalglyasncysthrmetasnphelysasnasn
119011951200
asnglyasnasnileglyleuleuglyphelysalaaspthrval
120512101215
valalaserthrtrptyrtyrthrhismetargasphisthrasn
122012251230
serasnglycysphetrpasnpheileserglugluhisglytrp
123512401245
glnglulys
1250
<210>11
<211>3819
<212>dna
<213>人工
<220>
<223>具有mdm2结合基序的重组蛋白bont/e
<400>11
atgccgaaaatcaacagcttcaactataacgatccggtgaacgatcgtaccatcctgtat60
attaaaccgggcggttgccaggaattttacaaaagcttcaacatcatgaaaaacatctgg120
attattccggaacgtaacgtgattggcaccaccccgcaggattttcatccgccgaccagc180
ctgaaaaacggcgatagcagctattatgatccgaactatctgcagtctgatgaagaaaaa240
gatcgcttcctgaaaatcgtgaccaaaatcttcaaccgcatcaacaacaacctgagcggc300
ggcattctgctggaagaactgagcaaagcgaatccgtatctgggcaacgataacactcca360
gataaccagtttcatattggtgatgcgagcgcggtggaaattaaatttagcaacggctct420
caggacattctgctgccgaacgtgattattatgggcgcggaaccggacctgtttgaaacc480
aacagcagcaacattagcctgcgtaacaactatatgccgagcaaccatggttttggcagc540
attgcgattgtgacctttagcccggaatatagctttcgcttcaacgataacagcatgaac600
gaatttattcaggacccggcgctgaccctgatgcacgagctgattcatagcctgcatggc660
ctgtatggcgcgaaaggcattaccaccaaatataccatcacccagaaacagaatccgctg720
attaccaacattcgtggcaccaacattgaagaatttctgacctttggcggcaccgatctg780
aacattattaccagcgcgcagagcaacgatatctataccaacctgctggccgattataaa840
aaaatcgcgtctaaactgagcaaagtgcaggtgagcaatccgctgctgaatccgtataaa900
gatgtgtttgaagcgaaatatggcctggataaagatgctagcggcatttatagcgtgaac960
atcaacaaattcaacgacatcttcaaaaaactgtatagctttaccgaatttgatctggcc1020
accaaatttcaggtgaaatgccgccagacctatattggccagtataaatattttaaactg1080
agcaacctgctgaacgatagcatttacaacatcagcgaaggctataacatcaacaacctg1140
aaagtgaactttcgtggccagaacgcgaatttaaatccgcgtattattaccccgattacc1200
ggccgtggactagtgaaaaaaattatccgtttttgcgtgcgtggcattatcaccagcctg1260
acctttgaacataattgggcacagctgaccagcaaaagcctggtgccgcgtggcagcaaa1320
gcgttaaatgatttatgcatcgaaatcaacaacggcgaactgttttttgtggcgagcgaa1380
aacagctataacgatgataacatcaacaccccgaaagaaattgatgataccgtgaccagc1440
aataacaactacgaaaacgatctggatcaggtgattctgaactttaacagcgaaagcgca1500
ccgggcctgtctgatgaaaaactgaacctgaccattcagaacgatgcgtatatcccgaaa1560
tatgatagcaacggcaccagcgatattgaacagcatgatgtgaacgaactgaacgtgttt1620
ttttatctggatgcgcagaaagtgccggaaggcgaaaacaacgtgaatctgaccagctca1680
attgataccgcgctgctggaacagccgaaaatctataccttttttagcagcgaattcatc1740
aacaacgtgaacaaaccggtgcaggcggcgctgtttgtgagctggattcagcaggtgctg1800
gttgattttaccaccgaagcgaaccagaaaagcaccgtggataaaattgcggatattagc1860
attgtggtgccgtatattggcctggccctgaacattggcaacgaagcgcagaaaggcaac1920
tttaaagatgcgctggaactgctgggtgcgggcattctgctggaatttgaaccggaactg1980
ctgattccgaccattctggtgtttaccatcaaaagctttctgggcagcagcgataacaaa2040
aacaaagtgatcaaagcgattaacaacgcgctgaaagaacgtgatgaaaaatggaaagaa2100
gtgtatagcttcattgtgtctaactggatgaccaaaatcaacacccagttcaacaaacgt2160
aaagaacaaatgtatcaggcgctgcagaaccaggtgaacgcgattaaaaccatcatcgaa2220
agcaaatacaacagctacaccctggaagaaaaaaacgaactgaccaacaaatatgacatc2280
aaacaaatcgaaaatgaactgaaccagaaagtgagcattgccatgaacaacattgatcgc2340
tttctgaccgaaagcagcattagctacctgatgaaactgatcaacgaagtgaaaatcaac2400
aaactgcgcgaatatgatgaaaacgtgaaaacctacctgctgaactatattattcagcat2460
ggcagcattctgggcgaaagccagcaagaactgaacagcatggttaccgataccctgaac2520
aacagcattccgtttaaactgagcagctacaccgatgataaaatcctgatcagctacttc2580
aacaaattcttcaaacgcatcaaaagcagcagcgtgctgaacatgcgttataaaaacgat2640
aaatacgtagataccagcggctatgatagcaatatcaacattaacggtgatgtgtataaa2700
tacccgaccaacaaaaaccagttcggcatctacaacgataaactgagcgaagtgaacatt2760
agccagaacgattatatcatctacgataataaatataaaaacttcagcatcagcttttgg2820
gtgcgtattccgaactacgataacaaaatcgtgaacgtgaacaacgaatacaccatcatt2880
aactgcatgcgtgataacaacagcggctggaaagtgagcctgaaccataacgaaatcatc2940
tggaccctgcaggataacgccggcattaaccagaaactggcctttaactatggcaacgcg3000
aacggcattagcgattacatcaacaaatggatctttgtgaccattaccaacgatcgtctg3060
ggcgatagcaaactgtatattaacggcaacctgatcgaccagaaaagcattctgaacctg3120
ggcaacattcatgtgagcgataacatcctgttcaaaattgtgaactgcagctatacccgt3180
tatattggcatccgctatttcaacatcttcgataaagaactggatgaaaccgaaattcag3240
accctgtatagcaacgaaccgaacaccaacatcctgaaagatttctggggcaactatctg3300
ctgtacgataaagaatattatctgctgaacgtgctgaaaccgaacaactttattgatcgc3360
cgtaaagatagcaccctgagcattaacaacattcgtagcaccattctgctggccaaccgt3420
ctgtatagcggcattaaagtgaaaattcagcgcgtgaacaatagcagcaccaacgataac3480
ctggtgcgtaaaaacgatcaggtgtatatcaactttgtggccagcaaaacccacctgttt3540
ccgctgtatgcggataccgcgaccaccaacaaagaaaaaaccattaaaatcagcagcagc3600
ggcaaccgttttaaccaggtggtggtgatgaacagcgtgggcaacaactgtacaatgaac3660
ttcaaaaacaacaacggcaacaacattggcctgctgggctttaaagcggataccgtggtg3720
gcgagcacctggtattatacccacatgcgtgatcataccaacagcaacggctgcttttgg3780
aactttattagcgaagaacatggctggcaggaaaaatga3819
<210>12
<211>1272
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>具有mdm2结合基序的重组蛋白bont/e
<400>12
metprolysileasnserpheasntyrasnaspprovalasnasparg
151015
thrileleutyrilelysproglyglycysglngluphetyrlysser
202530
pheasnilemetlysasniletrpileileprogluargasnvalile
354045
glythrthrproglnaspphehisproprothrserleulysasngly
505560
aspsersertyrtyraspproasntyrleuglnseraspgluglulys
65707580
aspargpheleulysilevalthrlysilepheasnargileasnasn
859095
asnleuserglyglyileleuleuglugluleuserlysalaasnpro
100105110
tyrleuglyasnaspasnthrproaspasnglnphehisileglyasp
115120125
alaseralavalgluilelyspheserasnglyserglnaspileleu
130135140
leuproasnvalileilemetglyalagluproaspleuphegluthr
145150155160
asnserserasnileserleuargasnasntyrmetproserasnhis
165170175
glypheglyserilealailevalthrpheserproglutyrserphe
180185190
argpheasnaspasnsermetasnglupheileglnaspproalaleu
195200205
thrleumethisgluleuilehisserleuhisglyleutyrglyala
210215220
lysglyilethrthrlystyrthrilethrglnlysglnasnproleu
225230235240
ilethrasnileargglythrasnilegluglupheleuthrphegly
245250255
glythraspleuasnileilethrseralaglnserasnaspiletyr
260265270
thrasnleuleualaasptyrlyslysilealaserlysleuserlys
275280285
valglnvalserasnproleuleuasnprotyrlysaspvalpheglu
290295300
alalystyrglyleuasplysaspalaserglyiletyrservalasn
305310315320
ileasnlyspheasnaspilephelyslysleutyrserphethrglu
325330335
pheaspleualathrlyspheglnvallyscysargglnthrtyrile
340345350
glyglntyrlystyrphelysleuserasnleuleuasnaspserile
355360365
tyrasnilesergluglytyrasnileasnasnleulysvalasnphe
370375380
argglyglnasnalaasnleuasnproargileilethrproilethr
385390395400
glyargglyleuvallyslysileileargphecysvalargglyile
405410415
ilethrserleuthrphegluhisasntrpalaglnleuthrserlys
420425430
serleuvalproargglyserlysalaleuasnaspleucysileglu
435440445
ileasnasnglygluleuphephevalalasergluasnsertyrasn
450455460
aspaspasnileasnthrprolysgluileaspaspthrvalthrser
465470475480
asnasnasntyrgluasnaspleuaspglnvalileleuasnpheasn
485490495
sergluseralaproglyleuseraspglulysleuasnleuthrile
500505510
glnasnaspalatyrileprolystyraspserasnglythrserasp
515520525
ilegluglnhisaspvalasngluleuasnvalphephetyrleuasp
530535540
alaglnlysvalprogluglygluasnasnvalasnleuthrserser
545550555560
ileaspthralaleuleugluglnprolysiletyrthrphepheser
565570575
serglupheileasnasnvalasnlysprovalglnalaalaleuphe
580585590
valsertrpileglnglnvalleuvalaspphethrthrglualaasn
595600605
glnlysserthrvalasplysilealaaspileserilevalvalpro
610615620
tyrileglyleualaleuasnileglyasnglualaglnlysglyasn
625630635640
phelysaspalaleugluleuleuglyalaglyileleuleugluphe
645650655
gluprogluleuleuileprothrileleuvalphethrilelysser
660665670
pheleuglyserseraspasnlysasnlysvalilelysalaileasn
675680685
asnalaleulysgluargaspglulystrplysgluvaltyrserphe
690695700
ilevalserasntrpmetthrlysileasnthrglnpheasnlysarg
705710715720
lysgluglnmettyrglnalaleuglnasnglnvalasnalailelys
725730735
thrileilegluserlystyrasnsertyrthrleugluglulysasn
740745750
gluleuthrasnlystyraspilelysglnilegluasngluleuasn
755760765
glnlysvalserilealametasnasnileaspargpheleuthrglu
770775780
serserilesertyrleumetlysleuileasngluvallysileasn
785790795800
lysleuargglutyraspgluasnvallysthrtyrleuleuasntyr
805810815
ileileglnhisglyserileleuglygluserglnglngluleuasn
820825830
sermetvalthraspthrleuasnasnserileprophelysleuser
835840845
sertyrthraspasplysileleuilesertyrpheasnlysphephe
850855860
lysargilelysserserservalleuasnmetargtyrlysasnasp
865870875880
lystyrvalaspthrserglytyraspserasnileasnileasngly
885890895
aspvaltyrlystyrprothrasnlysasnglnpheglyiletyrasn
900905910
asplysleusergluvalasnileserglnasnasptyrileiletyr
915920925
aspasnlystyrlysasnpheserileserphetrpvalargilepro
930935940
asntyraspasnlysilevalasnvalasnasnglutyrthrileile
945950955960
asncysmetargaspasnasnserglytrplysvalserleuasnhis
965970975
asngluileiletrpthrleuglnaspasnalaglyileasnglnlys
980985990
leualapheasntyrglyasnalaasnglyileserasptyrileasn
99510001005
lystrpilephevalthrilethrasnaspargleuglyaspser
101010151020
lysleutyrileasnglyasnleuileaspglnlysserileleu
102510301035
asnleuglyasnilehisvalseraspasnileleuphelysile
104010451050
valasncyssertyrthrargtyrileglyileargtyrpheasn
105510601065
ilepheasplysgluleuaspgluthrgluileglnthrleutyr
107010751080
serasngluproasnthrasnileleulysaspphetrpglyasn
108510901095
tyrleuleutyrasplysglutyrtyrleuleuasnvalleulys
110011051110
proasnasnpheileaspargarglysaspserthrleuserile
111511201125
asnasnileargserthrileleuleualaasnargleutyrser
113011351140
glyilelysvallysileglnargvalasnasnserserthrasn
114511501155
aspasnleuvalarglysasnaspglnvaltyrileasnpheval
116011651170
alaserlysthrhisleupheproleutyralaaspthralathr
117511801185
thrasnlysglulysthrilelysileserserserglyasnarg
119011951200
pheasnglnvalvalvalmetasnservalglyasnasncysthr
120512101215
metasnphelysasnasnasnglyasnasnileglyleuleugly
122012251230
phelysalaaspthrvalvalalaserthrtrptyrtyrthrhis
123512401245
metargasphisthrasnserasnglycysphetrpasnpheile
125012551260
serglugluhisglytrpglnglulys
12651270
<210>13
<211>3819
<212>dna
<213>人工
<220>
<223>具有mdm2结合基序的重组蛋白bont/e
<400>13
atgccgaaaatcaacagcttcaactataacgatccggtgaacgatcgtaccatcctgtat60
attaaaccgggcggttgccaggaattttacaaaagcttcaacatcatgaaaaacatctgg120
attattccggaacgtaacgtgattggcaccaccccgcaggattttcatccgccgaccagc180
ctgaaaaacggcgatagcagctattatgatccgaactatctgcagtctgatgaagaaaaa240
gatcgcttcctgaaaatcgtgaccaaaatcttcaaccgcatcaacaacaacctgagcggc300
ggcattctgctggaagaactgagcaaagcgaatccgtatctgggcaacgataacactcca360
gataaccagtttcatattggtgatgcgagcgcggtggaaattaaatttagcaacggctct420
caggacattctgctgccgaacgtgattattatgggcgcggaaccggacctgtttgaaacc480
aacagcagcaacattagcctgcgtaacaactatatgccgagcaaccatggttttggcagc540
attgcgattgtgacctttagcccggaatatagctttcgcttcaacgataacagcatgaac600
gaatttattcaggacccggcgctgaccctgatgcacgagctgattcatagcctgcatggc660
ctgtatggcgcgaaaggcattaccaccaaatataccatcacccagaaacagaatccgctg720
attaccaacattcgtggcaccaacattgaagaatttctgacctttggcggcaccgatctg780
aacattattaccagcgcgcagagcaacgatatctataccaacctgctggccgattataaa840
aaaatcgcgtctaaactgagcaaagtgcaggtgagcaatccgctgctgaatccgtataaa900
gatgtgtttgaagcgaaatatggcctggataaagatgctagcggcatttatagcgtgaac960
atcaacaaattcaacgacatcttcaaaaaactgtatagctttaccgaatttgatctggcc1020
accaaatttcaggtgaaatgccgccagacctatattggccagtataaatattttaaactg1080
agcaacctgctgaacgatagcatttacaacatcagcgaaggctataacatcaacaacctg1140
aaagtgaactttcgtggccagaacgcgaatttaaatccgcgtattattaccccgattacc1200
ggccgtggactagtgaaaaaaattatccgtttttgcgtgcgtggcattatcaccagcctg1260
acctttgaacataattgggcacagctggaaaacaaaagcctggtgccgcgtggcagcaaa1320
gcgttaaatgatttatgcatcgaaatcaacaacggcgaactgttttttgtggcgagcgaa1380
aacagctataacgatgataacatcaacaccccgaaagaaattgatgataccgtgaccagc1440
aataacaactacgaaaacgatctggatcaggtgattctgaactttaacagcgaaagcgca1500
ccgggcctgtctgatgaaaaactgaacctgaccattcagaacgatgcgtatatcccgaaa1560
tatgatagcaacggcaccagcgatattgaacagcatgatgtgaacgaactgaacgtgttt1620
ttttatctggatgcgcagaaagtgccggaaggcgaaaacaacgtgaatctgaccagctca1680
attgataccgcgctgctggaacagccgaaaatctataccttttttagcagcgaattcatc1740
aacaacgtgaacaaaccggtgcaggcggcgctgtttgtgagctggattcagcaggtgctg1800
gttgattttaccaccgaagcgaaccagaaaagcaccgtggataaaattgcggatattagc1860
attgtggtgccgtatattggcctggccctgaacattggcaacgaagcgcagaaaggcaac1920
tttaaagatgcgctggaactgctgggtgcgggcattctgctggaatttgaaccggaactg1980
ctgattccgaccattctggtgtttaccatcaaaagctttctgggcagcagcgataacaaa2040
aacaaagtgatcaaagcgattaacaacgcgctgaaagaacgtgatgaaaaatggaaagaa2100
gtgtatagcttcattgtgtctaactggatgaccaaaatcaacacccagttcaacaaacgt2160
aaagaacaaatgtatcaggcgctgcagaaccaggtgaacgcgattaaaaccatcatcgaa2220
agcaaatacaacagctacaccctggaagaaaaaaacgaactgaccaacaaatatgacatc2280
aaacaaatcgaaaatgaactgaaccagaaagtgagcattgccatgaacaacattgatcgc2340
tttctgaccgaaagcagcattagctacctgatgaaactgatcaacgaagtgaaaatcaac2400
aaactgcgcgaatatgatgaaaacgtgaaaacctacctgctgaactatattattcagcat2460
ggcagcattctgggcgaaagccagcaagaactgaacagcatggttaccgataccctgaac2520
aacagcattccgtttaaactgagcagctacaccgatgataaaatcctgatcagctacttc2580
aacaaattcttcaaacgcatcaaaagcagcagcgtgctgaacatgcgttataaaaacgat2640
aaatacgtagataccagcggctatgatagcaatatcaacattaacggtgatgtgtataaa2700
tacccgaccaacaaaaaccagttcggcatctacaacgataaactgagcgaagtgaacatt2760
agccagaacgattatatcatctacgataataaatataaaaacttcagcatcagcttttgg2820
gtgcgtattccgaactacgataacaaaatcgtgaacgtgaacaacgaatacaccatcatt2880
aactgcatgcgtgataacaacagcggctggaaagtgagcctgaaccataacgaaatcatc2940
tggaccctgcaggataacgccggcattaaccagaaactggcctttaactatggcaacgcg3000
aacggcattagcgattacatcaacaaatggatctttgtgaccattaccaacgatcgtctg3060
ggcgatagcaaactgtatattaacggcaacctgatcgaccagaaaagcattctgaacctg3120
ggcaacattcatgtgagcgataacatcctgttcaaaattgtgaactgcagctatacccgt3180
tatattggcatccgctatttcaacatcttcgataaagaactggatgaaaccgaaattcag3240
accctgtatagcaacgaaccgaacaccaacatcctgaaagatttctggggcaactatctg3300
ctgtacgataaagaatattatctgctgaacgtgctgaaaccgaacaactttattgatcgc3360
cgtaaagatagcaccctgagcattaacaacattcgtagcaccattctgctggccaaccgt3420
ctgtatagcggcattaaagtgaaaattcagcgcgtgaacaatagcagcaccaacgataac3480
ctggtgcgtaaaaacgatcaggtgtatatcaactttgtggccagcaaaacccacctgttt3540
ccgctgtatgcggataccgcgaccaccaacaaagaaaaaaccattaaaatcagcagcagc3600
ggcaaccgttttaaccaggtggtggtgatgaacagcgtgggcaacaactgtacaatgaac3660
ttcaaaaacaacaacggcaacaacattggcctgctgggctttaaagcggataccgtggtg3720
gcgagcacctggtattatacccacatgcgtgatcataccaacagcaacggctgcttttgg3780
aactttattagcgaagaacatggctggcaggaaaaatga3819
<210>14
<211>1272
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>具有mdm2结合基序的重组蛋白bont/e
<400>14
metprolysileasnserpheasntyrasnaspprovalasnasparg
151015
thrileleutyrilelysproglyglycysglngluphetyrlysser
202530
pheasnilemetlysasniletrpileileprogluargasnvalile
354045
glythrthrproglnaspphehisproprothrserleulysasngly
505560
aspsersertyrtyraspproasntyrleuglnseraspgluglulys
65707580
aspargpheleulysilevalthrlysilepheasnargileasnasn
859095
asnleuserglyglyileleuleuglugluleuserlysalaasnpro
100105110
tyrleuglyasnaspasnthrproaspasnglnphehisileglyasp
115120125
alaseralavalgluilelyspheserasnglyserglnaspileleu
130135140
leuproasnvalileilemetglyalagluproaspleuphegluthr
145150155160
asnserserasnileserleuargasnasntyrmetproserasnhis
165170175
glypheglyserilealailevalthrpheserproglutyrserphe
180185190
argpheasnaspasnsermetasnglupheileglnaspproalaleu
195200205
thrleumethisgluleuilehisserleuhisglyleutyrglyala
210215220
lysglyilethrthrlystyrthrilethrglnlysglnasnproleu
225230235240
ilethrasnileargglythrasnilegluglupheleuthrphegly
245250255
glythraspleuasnileilethrseralaglnserasnaspiletyr
260265270
thrasnleuleualaasptyrlyslysilealaserlysleuserlys
275280285
valglnvalserasnproleuleuasnprotyrlysaspvalpheglu
290295300
alalystyrglyleuasplysaspalaserglyiletyrservalasn
305310315320
ileasnlyspheasnaspilephelyslysleutyrserphethrglu
325330335
pheaspleualathrlyspheglnvallyscysargglnthrtyrile
340345350
glyglntyrlystyrphelysleuserasnleuleuasnaspserile
355360365
tyrasnilesergluglytyrasnileasnasnleulysvalasnphe
370375380
argglyglnasnalaasnleuasnproargileilethrproilethr
385390395400
glyargglyleuvallyslysileileargphecysvalargglyile
405410415
ilethrserleuthrphegluhisasntrpalaglnleugluasnlys
420425430
serleuvalproargglyserlysalaleuasnaspleucysileglu
435440445
ileasnasnglygluleuphephevalalasergluasnsertyrasn
450455460
aspaspasnileasnthrprolysgluileaspaspthrvalthrser
465470475480
asnasnasntyrgluasnaspleuaspglnvalileleuasnpheasn
485490495
sergluseralaproglyleuseraspglulysleuasnleuthrile
500505510
glnasnaspalatyrileprolystyraspserasnglythrserasp
515520525
ilegluglnhisaspvalasngluleuasnvalphephetyrleuasp
530535540
alaglnlysvalprogluglygluasnasnvalasnleuthrserser
545550555560
ileaspthralaleuleugluglnprolysiletyrthrphepheser
565570575
serglupheileasnasnvalasnlysprovalglnalaalaleuphe
580585590
valsertrpileglnglnvalleuvalaspphethrthrglualaasn
595600605
glnlysserthrvalasplysilealaaspileserilevalvalpro
610615620
tyrileglyleualaleuasnileglyasnglualaglnlysglyasn
625630635640
phelysaspalaleugluleuleuglyalaglyileleuleugluphe
645650655
gluprogluleuleuileprothrileleuvalphethrilelysser
660665670
pheleuglyserseraspasnlysasnlysvalilelysalaileasn
675680685
asnalaleulysgluargaspglulystrplysgluvaltyrserphe
690695700
ilevalserasntrpmetthrlysileasnthrglnpheasnlysarg
705710715720
lysgluglnmettyrglnalaleuglnasnglnvalasnalailelys
725730735
thrileilegluserlystyrasnsertyrthrleugluglulysasn
740745750
gluleuthrasnlystyraspilelysglnilegluasngluleuasn
755760765
glnlysvalserilealametasnasnileaspargpheleuthrglu
770775780
serserilesertyrleumetlysleuileasngluvallysileasn
785790795800
lysleuargglutyraspgluasnvallysthrtyrleuleuasntyr
805810815
ileileglnhisglyserileleuglygluserglnglngluleuasn
820825830
sermetvalthraspthrleuasnasnserileprophelysleuser
835840845
sertyrthraspasplysileleuilesertyrpheasnlysphephe
850855860
lysargilelysserserservalleuasnmetargtyrlysasnasp
865870875880
lystyrvalaspthrserglytyraspserasnileasnileasngly
885890895
aspvaltyrlystyrprothrasnlysasnglnpheglyiletyrasn
900905910
asplysleusergluvalasnileserglnasnasptyrileiletyr
915920925
aspasnlystyrlysasnpheserileserphetrpvalargilepro
930935940
asntyraspasnlysilevalasnvalasnasnglutyrthrileile
945950955960
asncysmetargaspasnasnserglytrplysvalserleuasnhis
965970975
asngluileiletrpthrleuglnaspasnalaglyileasnglnlys
980985990
leualapheasntyrglyasnalaasnglyileserasptyrileasn
99510001005
lystrpilephevalthrilethrasnaspargleuglyaspser
101010151020
lysleutyrileasnglyasnleuileaspglnlysserileleu
102510301035
asnleuglyasnilehisvalseraspasnileleuphelysile
104010451050
valasncyssertyrthrargtyrileglyileargtyrpheasn
105510601065
ilepheasplysgluleuaspgluthrgluileglnthrleutyr
107010751080
serasngluproasnthrasnileleulysaspphetrpglyasn
108510901095
tyrleuleutyrasplysglutyrtyrleuleuasnvalleulys
110011051110
proasnasnpheileaspargarglysaspserthrleuserile
111511201125
asnasnileargserthrileleuleualaasnargleutyrser
113011351140
glyilelysvallysileglnargvalasnasnserserthrasn
114511501155
aspasnleuvalarglysasnaspglnvaltyrileasnpheval
116011651170
alaserlysthrhisleupheproleutyralaaspthralathr
117511801185
thrasnlysglulysthrilelysileserserserglyasnarg
119011951200
pheasnglnvalvalvalmetasnservalglyasnasncysthr
120512101215
metasnphelysasnasnasnglyasnasnileglyleuleugly
122012251230
phelysalaaspthrvalvalalaserthrtrptyrtyrthrhis
123512401245
metargasphisthrasnserasnglycysphetrpasnpheile
125012551260
serglugluhisglytrpglnglulys
12651270
<210>15
<211>12
<212>prt
<213>小家鼠
<400>15
thrleuserserglnhisasnthrtyrthrileglu
1510
<210>16
<211>7
<212>prt
<213>小家鼠
<400>16
lysaspglyserhisserthr
15
<210>17
<211>13
<212>prt
<213>小家鼠
<400>17
glyvalglyaspthrilelysgluglnphevaltyrval
1510
<210>18
<211>10
<212>prt
<213>小家鼠
<400>18
glytyrthrpheasnthrtyralavalasn
1510
<210>19
<211>19
<212>prt
<213>小家鼠
<400>19
argileargserlyssertyrasntyrvalthrtyrtyralaaspser
151015
vallysasp
<210>20
<211>10
<212>prt
<213>小家鼠
<400>20
glyasnglyasntyrvalserphealatyr
1510
<210>21
<211>115
<212>prt
<213>小家鼠
<400>21
glnleuvalleuthrglnserserseralaserpheserleuglyala
151015
seralalysleuthrcysthrleuserserglnhisasnthrtyrthr
202530
ileglutrptyrglnglnglnproleulysproprolystyrvalmet
354045
gluleulyslysaspglyserhisserthrglyaspglyileproasp
505560
argpheserglyserserserglyalaaspargtyrleuserileser
65707580
asnileglnprogluaspglualailetyrilecysglyvalglyasp
859095
thrilelysgluglnphevaltyrvalpheglyglyglythrlysval
100105110
thrvalleu
115
<210>22
<211>121
<212>prt
<213>小家鼠
<400>22
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnprolysgly
151015
serleulysleusercysalaalaserglytyrthrpheasnthrtyr
202530
alavalasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alaargileargserlyssertyrasntyrvalthrtyrtyralaasp
505560
servallysaspargphethrileserargaspaspserglnsermet
65707580
leutyrleuglnmetasnasnleulysthrgluaspthralamettyr
859095
tyrcysvallysglyasnglyasntyrvalserphealatyrtrpgly
100105110
glnglythrleuvalthrvalserala
115120
pct/ro/134表