一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药检测技术领域，具体的说涉及一种宿主蛋白抗体的制备方法及其应用，更具体的说涉及一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其在表达外源蛋白检测中的应用。

背景技术：

自上世纪80年代，由phillipspetroleum公司和salkinstitutebiotechnology/industrialassociates公司联合开发毕赤酵母表达系统以来，已经有超过1000种外源蛋白在该系统中得到了表达。毕赤酵母表达系统经过近三十年的发展，已基本成为非常完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子aox1，已高效表达了hbsag、phytase、albumin、antibody、collagen等多种外源基因，大量的实例已经证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模，目前还有多种该系统表达的治疗性蛋白处于开发之中。

毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。但是同其他表达系统一样，毕赤酵母在应用中也存在一些问题，如残留宿主蛋白(hostcellprotein，hcp)问题。hcp是重组蛋白药物的一个主要杂质成分，即使在最严格的纯化工艺和质量控制下进行生产，微量的hcp残留也不可避免。hcp属异源蛋白，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞（传代细胞）分泌的促生长因子等物质。有研究报道，hcp不仅能引起机体的过敏反应还有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体，从而严重影响此类药物的有效性与安全性。

除了有效地去除残留hcp外，为了严格控制残余hcp水平，还需要建立快速、准确和灵敏的hcp检测方法。目前用于hcp分析的主要技术包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、高效液相色谱法和免疫印迹法，但是通常基因工程最终产品中hcp含量都在ppm级，而以上的方法的检测灵敏度和准确性明显不够，无法对高纯度的样品进行有效的hcp定量分析。因此，酶联免疫吸附(elisa)技术由于其高灵敏度和准确性被认为是行业内hcp的黄金标准检测方法。到目前为止，绝大多数通过fda批准认可的重组蛋白药物残留hcp定量都是通过elisa进行测定。

elisa方法的核心就是hcp的特异性抗体，一般hcp抗体的制备方法为含空载体的宿主细胞免疫动物，获得的抗血清，分离纯化的多克隆抗体用于elisa检测中。但是由于hcp作为抗原分子量大小不一，成分复杂，各成分之间免疫原性差异大，而不容易得到合适的hcp抗体。这是因为，常规方法将hcp全部成分免疫动物之后，获得抗体主要结合分子量大或免疫原性强的hcp成分，对于低分子量或免疫原性弱的hcp成分无结合能力。而如果低分子量或免疫原性弱的hcp成分较多的出现在待检生物制品中时，会导致elisa检测灵敏度大大降低，并且出现由于部分低免疫原性的hcp成分无法检测而造成实际测定值偏低的现象，由此出现的检测误差导致对生物制品纯度的错误评价已导致一些生物药物的研发失败。

hcp的特异性抗体的制备是一个备受探讨关注的问题，尤其是对于临床应用剂量很高的重组蛋白药物，如在临床上对于出血性休克，人血白蛋白单次使用剂量往往超过10克，所以其纯度要求非常严格。上述介绍的抗体制备方法无法很好地满足如此高纯度的重组蛋白药物hcp的鉴定，因此有必要对hcp检测方法进行进一步优化，提高hcp特异性抗体的覆盖率、针对性，以满足对基因工程最终产品中hcp进行有效、灵敏、准确的测定。

技术实现要素：

针对现有检测技术存在的上述不足，本发明提供了一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，该方法制备所得抗体具有免疫原性强、抗原覆盖率全的特点，利用该抗体建立的elisa检测方法检测结果特异性强、稳定可靠、检测灵敏度高。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：将含有空表达载体的毕赤酵母全宿主蛋白溶液按分子量进行抗原分组，分别免疫动物，合并所得抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。

作为一种优选方案，所述毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，具体步骤如下：

1）转化空表达载体的毕赤酵母进行培养和诱导表达，发酵液过滤收集上清；

2）上清经纯化，浓缩除菌，制得无目的蛋白的毕赤酵母全宿主蛋白溶液；

3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组；

4）抗原组分别免疫动物，合并抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。

其中步骤1）所述毕赤酵母空表达载体优选为ppiczα-a，毕赤酵母优选毕赤酵母x33菌株。

目前所使用的各种毕赤酵母菌株均来自于原始的y-11430菌，x33菌株含有野生型的aox1基因，高达85%的甲醇利用率是由该基因完成的；毕赤酵母表达载体可为ppiczα-a、ppiczα-b、ppiczα-c、ppic3.5k、ppic3、ppic9、phil-d1、pa0804、pa0815、ppsc3k或ppic9k等，优选为ppiczα-a。中国专利zl200510068186.5就是通过将人血白蛋白基因片段插入ppiczα-a的nspⅴ和ecorⅰ识别位点间得到表达载体，转化x33菌株构建成为表达人血白蛋白的工程菌。

其中步骤2）上清纯化步骤与含目的基因的基因工程毕赤酵母上清纯化步骤相同或是纯化步骤的一部分，纯化步骤优选进行阳离子交换层析，层析树脂优选高盐阳离子交换层析介质cst-ⅱff或mmc。

中国专利zl200510068187.x公开了一种纯化重组人血白蛋白的方法，即将含重组人血白蛋白的发酵液上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化重组人血白蛋白，其高盐阳离子交换层析介质即为cst-ⅱff。

步骤3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组是通过分子筛层析进行的，分子筛层析树脂优选凝胶过滤填料superdex75。

superdex75对球状蛋白的分级范围为3×10³~7×10⁴，使用superdex75层析柱对全宿主蛋白溶液（质粒ppiczα-a转化毕赤酵母x33菌株中得到的工程菌发酵，经高盐阳离子交换层析介质cst-ⅱff或mmc纯化制备而得）进行层析，流出液经紫外检测仪检测，分离为8个组分。

步骤3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组，优选分为4组，分组范围：1#>250kd；2#250~100kd；3#100~50kd；4#<50kd。

步骤4）免疫动物优选兔或羊。

本发明的另一种目的是提供上述制备方法所得毕赤酵母宿主蛋白抗体的应用，作为活性成分用于制备检测通过毕赤酵母表达系统制备的生物制品宿主蛋白残留的试剂或试剂盒。

进一步的应用为检测通过毕赤酵母表达系统制备的生物制品宿主蛋白残留的方法为利用抗体特异性的检测方法，优选elisa，更优选双抗夹心elisa。

进一步的应用为通过毕赤酵母表达系统制备的生物制品优选为重组人血白蛋白。

该方法制备所得抗体具有免疫原性强、抗原覆盖率全的特点，利用该抗体建立的elisa检测方法检测结果特异性强、稳定可靠、检测灵敏度高，从而为毕赤酵母生物制品宿主蛋白残留的检测，特别是为毕赤酵母表达重组人血白蛋白残留宿主蛋白的检测，提供了一种快速有效、简单可靠、适于大规模推广应用的检测方法。

说明书附图

图1：hcp经阳离子层析纯化后非还原sds-page电泳图，分子量marker从上到下依次是：250kd、150kd、100kd、75kd、50kd、37kd、25kd、20kd、15kd、10kd。

图2：hcp经阳离子层析纯化后western-blot检测

图3：hcpdot-blot鉴定上：hsa浓度对照品系列含有hsa浓度从左至右依次是:5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、625μg/ml、312μg/ml、165μg/ml、78μg/ml、39μg/ml。下：hcp不同浓度点样，样品浓度与对应hsa浓度对照品相同。

图4：酵母宿主蛋白不同组分sds-page分析，泳道1和10：酵母宿主蛋白；泳道2：组分8；泳道3：组分7；泳道4：组分6；泳道5：组分5；泳道6：组分4；泳道7：组分3；泳道8：组分2；泳道9：组分1。

图5：elisa标准曲线

具体实施例

下面结合实施例，对本发明做进一步描述，其作用被理解为对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

本部分所用菌株：含有空表达载体的毕赤酵母为将质粒ppiczα-a转化毕赤酵母x33菌株中得到的工程菌，制备方法参见中国专利zl:200510068186.5；表达重组人血白蛋白的基因工程菌为将质粒pazp-hsa导入巴斯德毕赤酵母x33菌株得到的表达hsa的工程菌，保藏号为cgmccno.1360；

层析填料：阳离子交换层析柱25mlcaptommc(amershambiosciences)；层析仪：akatapurifier100(ge-healthcare)；分子筛排阻层析介质superdex^tm75(ge公司)

upco羊抗人igg-fc抗体（southernbiotech公司）、羊抗鼠igg-hrp（sigma公司）、正

常人血清（中科晨宇生物科技有限公司）、酶标板为96孔酶标板（美国corning/costar）、tmba、b显色液（北京泰天河生物技术有限公司）、biotin标记兔抗毕赤酵母hcp抗体（sigma公司）、弗氏完全佐剂（sigma公司）、弗氏不完全佐剂（sigma公司）、生物素标记试剂盒（elabscience公司）。

实施例一：hcp的制备及鉴定

含有空表达载体的毕赤酵母工程菌经过种子培养与发酵培养（培养方法参见：中国专利zl200510068187.x一种纯化rhsa的方法具体实施方式中一、rhsa的发酵生产），发酵液过滤后得上清8l，进行阳离子交换层析cst-ⅱff或mmc，层析过程如下：平衡液（25mmnaac，ph4.5）平衡阳离子交换层析柱；上清液通过系统泵进柱，平衡液洗脱未结合的杂蛋白，洗脱至基线水平；洗脱液（50mmpb、0.1mnacl、10mmcap，ph7.0）洗脱结合目标蛋白。收集洗脱液，将样品浓缩，经过滤除菌，制得白蛋白生产用宿主菌体蛋白溶液50ml，经凯氏定氮法测定，蛋白浓度为8.09mg/ml。

对宿主菌体蛋白溶液进行非还原sds-page电泳分析，电泳条件：胶浓度4%～15%，hcp上样量20μg/条带。分子量marker为：bio-radunstainedstandards161-0363250kd-10kd（见图1）。west-bolt分析：电泳条件同上述sds-page，电转条件：pvdf膜，50v，60分钟。转膜后用1%bsa封闭，biotin标记兔抗毕赤酵母hcp抗体（sigma公司）稀释到2μg/ml孵育，洗膜后用亲和素-hrp孵育，dab显色试剂盒显色，结果显示所制备hcp为毕赤酵母细胞宿主蛋白（见图2）。

为检查hcp中是否有重组人血白蛋白rhsa的污染，进行了dot-blot试验，将rhsa（培养方法参见：中国专利zl200510068187.x一种纯化rhsa的方法）对照品系列稀释，浓度依次是:5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、625μg/ml、312μg/ml、165μg/ml、78μg/ml、39μg/ml。hcp样品浓度与对应rhsa浓度对照品相同。点样后用1%bsa封闭，用鼠抗hsa单抗（sigma）1：1000倍稀释，洗膜后用羊抗鼠-hrp孵育，dab显色试剂盒显色，结果显示制备所得的hcp中不含有rhsa污染（见图3）。

实施例二：hcp组分分离及抗体制备

1、hcp组分分离

用分子排阻层析（设备：aktapurifier层析柱：xk16介质：superdex75）将hcp按照分子量进行分离，层析过程如下：洗脱液（0.05m磷酸缓冲液，0.15mnacl，ph7.0）平衡层析柱；上清液通过系统泵进柱后，洗脱液以0.4ml/min的流速洗脱蛋白，记录uv检测信号随时间的变化获得色谱流出曲线，自动组分收集器将层析柱中流出来的组分分别收集到不同的玻璃收集管中，按分子量从大到小共获得8个组分。

对其分离的8个组分进行sds-page电泳分析（见图4），电泳条件：胶浓度4%～15%，非还原loadingbuffer，hcp上样量20μg/条带。分子量marker：bio-radunstainedstandards161-0363250kd-10kd。将分子量从大到小相邻的两个组分合并，成为4个抗原组（1#，2#，3#，4#），分组范围：1#>250kd；2#250~100kd；3#100~50kd；4#<50kd，用于制备兔抗hcp多克隆抗体。

2、兔抗hcp抗体制备及纯化

a）抗体制备

对兔子进行预放血，轻轻的将兔子放在特制的兔盒中，按压兔子耳根部直至血管突出，然后将针头插入耳根血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1~5ml。收集结束后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。收集的血液在37℃恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4℃放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上剥落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10000g离心10分钟，收集上清液在4℃保存。

将毕赤酵母hcp4个抗原组（1#，2#，3#，4#）分别制备兔抗多克隆抗体：hcp抗原200μg用生理盐水稀释至0.5ml，再加入等体积的弗式完全佐剂，剧烈震荡使之充分乳化，用2ml注射器抽取该乳化液，接上25g针头，排空注射器气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处：抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏住皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1~2cm，小心不要刺入肌肉中。注射结束后，将针在注射处放置几秒种后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。

与第一次注射间隔14天后，将200μghcp抗原用生理盐水稀释至0.5ml，再加入等体积的弗式不完全佐剂，按上述方法进行注射。28天后进行第三次注射，方法、剂量均同第二次。

完成三次注射10天后开始收集血液，毕赤酵母hcp4个抗原组（1#，2#，3#，4#）分别测定效价：将实施例1制备得到的毕赤酵母hcp抗原稀释于包被缓冲液中（0.1mna2co3，ph9.6），终浓度为5ng/μl，每孔100μl。并设立空白对照（只加包被缓冲液）及阴性对照（预放血阴性血清）。4℃包被过夜。用1xpbst（1xpbs+0.1%tween20）洗涤3次，每次5分钟。然后每孔加200μl封闭液（10%小牛血清溶于1xpbs），37℃孵育2小时。用1xpbst洗涤3次，每次5分钟。将血清样品倍比稀释于1xpbs中，每孔100μl，37℃孵育2小时。用1xpbst洗涤3次，每次5分钟。每孔加入100μl1:2000稀释的hrp标记的羊抗兔酶标二抗，37℃显色0.5小时，用1xpbst洗涤3次，每次5分钟。每孔加入100μldab显色液，室温避光10分钟后每孔加入2mh2so450μl，终止反应，测定od450值。酶标仪判定结果。见下表，四个组分的抗体滴度均能达到1：1×10⁶。

将家兔轻轻放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45度在该处切出0.3cm左右切口使血液能自由流出。收集适量血液后，可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处确定血流停止后方可结束。

按照预放血方法收集抗血清，-20℃保存。

b）抗体纯化

将抗血清放入冰水中缓慢解冻，加入固体叠氮钠至浓度为0.05%，4℃，15000g，离心5分钟，移出澄清的抗血清过滤除脂。

将上述步骤得到的抗血清溶液用tbs缓冲液（6.06gtris、8.78gnacl、0.5g叠氮化钠溶于1l蒸馏水中，ph7.4）以1:5的比例进行稀释，过滤。以每分钟0.5ml的速度将抗血清上到柱（蛋白asephoraosecl-4b亲和柱）上，连续上样2次并保留上样流出液。用tbs缓冲液清洗柱子至aλ280<0.008后，加ph2.7洗脱缓冲溶液（3.75g甘氨酸溶解于1l蒸馏水中，用hcl调节ph2.7），以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100μl中和缓冲溶液（121.2gtris、87.8gnacl、0.37gedta、5g叠氮化钠溶于1l蒸馏水中，调节ph8.0）的离心管收集洗脱液，调至ph7.4防止抗体变性。在柱中加入10ml，ph1.9洗脱缓冲溶液（3.75g甘氨酸溶解于1l蒸馏水中，用hcl调节ph1.9），按上述方法收集洗脱液至aλ280<0.008。

c）抗体标记

提前20分钟将生物素标记试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。溶解nh2-reactivebiotin：加入30μldmf至nh2-reactivebiotin瓶中，静置10分钟，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10mm。取1mg上述纯化抗体于filtrationtube中，并加入相应体积的labelingbuffer，使抗体终浓度为2mg/ml，12000g，离心10分钟。加入13.5μlnh2-reactivebiotin和适量的labelingbuffer至上述filtrationtube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光孵育30分钟。取出，12000g离心10分钟。加入适量labelingbuffer至上述filtrationtube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，2000g离心10分钟。并重复操作一次。加入0.2mllabelingbuffer至filtrationtube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一离心管中，6000g，离心10分钟。收集离心管中的溶液，加入叠氮钠（0.5g/l）及bsa（1.0g/l），4℃避光保存，或加入50%重蒸甘油，置于-20℃保存。

实施例三：兔抗hcp不同组分混合抗体及biotin标记混合抗体建立夹心elisa法

将制备的兔抗hcp抗体（1#~4#）按等比例混合，作为包被抗体，biotin标记的上述抗体按等比例混合作为检测抗体，两者配对组合，建立了毕赤酵母重组表达人血白蛋白hcp夹心elisa法检测方法。

用包被液缓冲液（0.1mol/l碳酸盐，ph9.6）稀释混合多抗至2μg/ml，100μl/孔，4℃湿盒过夜。洗板三遍，拍干，3%脱脂乳封闭板孔，200μl/孔，37℃湿盒1小时。用3%脱脂乳稀释rhsa至质量体积比为10%，用作hcp标准稀释液，加入标准品或样品100μl/孔，用稀释液作为空白孔液。拍干板孔，加入系列稀释的标准品、样品和空白对照，常温摇床2小时。洗板三遍，拍干，加入biotin标记抗体100μl/孔，常温摇床2小时。洗板三遍，拍干，加入亲和素-hrp100μl/孔，37℃湿盒1小时。洗板五遍，拍干，tmb显色15分钟。加终止液（2mol/lh2so4），50µl/孔，终止反应。终止后30分钟内用酶标仪读取数据，波长为450/630nm。

依据上述检测步骤对该方法进行方法学验证如下：

1、线性

将实施例1制备得到的hcp系列稀释作为标准品（s1~s12），进行检测，并绘制标准曲线，s1~s12浓度为100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.563ng/ml，0.871ng/ml，0.391ng/ml，0.195ng/ml，0.098ng/ml、0.049ng/ml。

结果见下表：

结果显示，该方法在hcp含量0.098ng/ml~1.563ng/ml之间时，线性关系良好（见图5），y=0.057x+0.013，r²=0.994。

2、检测限度验证

在方法验证试验的测定中，设置空白复孔，统计该批次空白样本od值的sd值和标准曲线的斜率。

用校准曲线中低浓度的1.563ng/ml，0.871ng/ml，0.391ng/ml，0.195ng/ml，0.098ng/ml，这5个点做线性拟合，得到校准曲线在低浓度区域的斜率s=0.057；通过0ng/ml（blank）平行样品的od值计算其对应的sd值即为σ=0.0013，用公式检测限度（lod）＝3σ/s和定量限度（loq）＝10σ/s计算该方法的检测限和定量限。

经计算，该方法的检测限为0.067ng/ml，定量限为0.22ng/ml。较目前通用的检测毕赤酵母hcp的试剂盒（cygnustechnologies，pichipastorishcpelisakit）检出限度降低近10倍。

3、专属性验证

用稀释液将实施例1制备得到的hcp稀释至1μg/ml，取10μl加入90μl的人血白蛋白样品中，终浓度为100ng/ml，样品设置3个重复，并设置人血白蛋白对照组，验证该方法的专属性，结果见下表。

结果显示，经本发明所述方法制备的毕赤酵母hcp抗体可特异性的检出产品中残留的宿主蛋白，且与人血白蛋白无交叉反应。

4、准确度验证

由高到低设置4个不同浓度进行回收率检测，由同一板上的校正曲线回归方程计算出浓度。每个样品分别做3个平行样品，分析该方法的准确度，结果见下表。

结果显示，100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml四个浓度标准的回收率均达到85%以上。

5、精密度验证

对上述4个浓度样品（100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml）连续测定三次，分析该方法的精密度，结果见下表。

结果显示，100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml四个浓度标准的cv值均小于10%。

上述结果表明，本发明所述的毕赤酵母hcp抗原制备方法所得多克隆抗体，针对毕赤酵母hcp覆盖面全、免疫原性强，利用该抗体建立的elisa检测方法检测结果特异性强、稳定可靠、检测灵敏度高，从而为毕赤酵母表达生物制品宿主蛋白残留的检测提供了一种快速有效、简单可靠、适于大规模推广应用的检测方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明进行了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不脱离本发明的构思和范围内所做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。