基因突变体及其应用的制作方法

文档序号：11647220阅读：906来源：国知局

本发明涉及基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的核酸、分离的多肽、筛选易患复发性流产的生物样品的方法、筛选易患复发性流产的生物样品的系统、用于筛选易患复发性流产的的生物样品的试剂盒、构建体以及重组细胞。

背景技术：

临床上多将连续2次或者2次以上的妊娠周期不足20周的自然流产定义为反复自然流产(recurrentspontaneoussabortion，rsa)。rsa可能是由很多因素造成的，例如年龄因素、生活习惯、遗传因素、免疫因素、感染因素、内分泌因素，生殖系统因素等。除已知因素外仍有约50％的rsa发病原因不明，这类已排除已知病因的不明原因反复流产被称为特发性反复流产(idiopathicrecurrentmiscarriage，irm)。

irm对于临床医生是一个棘手的问题，由于发病机制不明，无法确定有效的治疗方法且无法提供给患者合适的生育建议。对于患者而言，反复流产带来的身体创伤和各种心理精神障碍，以及下一个妊娠结果的不确定性，对育龄夫妻都是沉重的负担。因此，研究irm的病因，对更加全面清晰地认识其发病机制，寻找有效的干预、治疗方法起着十分重要的作用。

现有研究表明，某些基因多态性影响复发性流产：hla-dqb1/drb1、pai-1、tgfb1、ogg1、gpx4、comt和abcb1等；一些基因纯合突变具有胚胎致死性，如哺乳动物胚胎致死性基因：lig4、nfat5、smad2和tbx5，tdp43、opa1和ryr2纯合突变。但仍存在着相当一部分未知致病基因位点。

因而，目前对复发性流产的研究仍有待深入。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患复发性流产的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了复发性流产的新的致病突变。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与seqidno：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变:c.1501c>t突变和c.17c>t突变；或者与seqidno：2相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变:c.270g>t突变和c.1191c>g突变。其中，seqidno：1是野生型esr2基因的序列，seqidno：2是野生型ar基因的序列。根据本发明的实施例，发明人确定了esr2、ar基因突变体，这些新突变体与复发性流产的发病密切相关，从而通过检测这些新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患复发性流产。

在发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与seqidno：3相比，所述多肽具有选自下列的至少一种突变：p.r501c突变和p.s6l突变；或者与seqidno：4相比，所述多肽具有选自下列的至少一种突变：p.q90h突变和p.s397r突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患复发性流产。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患复发性流产的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列与seqidno：1相比，是否具有选自下列的至少一种突变:c.1501c>t突变和c.17c>t突变；或者与seqidno：2相比，是否具有选自下列的至少一种突变:c.270g>t突变和c.1191c>g突变，判断所述生物样品是否易患复发性流产。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患复发性流产的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患复发性流产的生物样品。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患复发性流产的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测esr2、ar基因突变体的至少一种的试剂，其中与seqidno：1相比，所述esr2基因突变体具有选自下列的至少一种突变:c.1501c>t突变和c.17c>t突变；或者与seqidno：2相比，所述ar基因突变体具有选自下列的至少一种突变:c.270g>t突变和c.1191c>g突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患复发性流产的生物样品。

在本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的核酸”表示，本发明的构建体包含与seqidno：1相比的具有选自下列的至少一种突变:c.1501c>t突变和c.17c>t突变的核苷酸序列或者与seqidno：2相比的具有选自下列的至少一种突变：c.270g>t突变和c.1191c>g突变的核苷酸序列。由此，本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作复发性流产相关研究的模型。

在本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作复发性流产相关研究的模型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的筛选易患复发性流产的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

a为根据本发明实施例的筛选易患复发性流产的生物样品的系统的示意图，

b为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

c为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例，检出新突变的患者的相应复发性流产致病基因突变位点的sanger测序验证峰图，其中，

a是复发性流产患者esr2基因c.1501c>t突变位点的测序验证峰图，

b是复发性流产患者esr2基因c.17c>t突变位点的测序验证峰图，

c是复发性流产患者ar基因c.270g>t突变位点的测序图，

d是复发性流产患者ar基因c.1191c>g突变位点的测序图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

基因突变体

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与seqidno：1相比，该核酸具有选自下列的至少一种突变:c.1501c>t突变和c.17c>t突变；或者与seqidno：2相比，该核酸具有选自下列的至少一种突变:c.270g>t突变和c.1191c>g突变。在本文中所使用的表达方式“编码基因突变体的核酸”，是指与编码基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于dna、rna或 cdna。其中，seqidno：1是野生型esr2基因序列,seqidno：2是野生型ar基因序列。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码基因突变体的核酸为dna。根据本发明的实施例，发明人确定了esr2基因或ar基因的新突变体，这些新突变体与复发性流产的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患复发性流产，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患复发性流产。

对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及seqidno：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及esr2或ar基因序列，实际也包括相应的rna序列。

该编码esr2或ar突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的复发性流产的致病基因esr2或ar基因的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“目标区域捕获测序”是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。

其中，野生型esr2基因序列如下所示：

1atggatataaaaaactcaccatctagccttaattctccttcctcctacaactgcagtcaa

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841ctgatcagccgccccagtgcgcccttcaccgaggcctccatgatgatgtccctgaccaag

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961gagctcagcctgttcgaccaagtgcggctcttggagagctgttggatggaggtgttaatg

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1201aaggccatgatcctgctcaattccagtatgtaccctctggtcacagcgacccaggatgct

1261gacagcagccggaagctggctcacttgctgaacgccgtgaccgatgctttggtttgggtg

1321attgccaagagcggcatctcctcccagcagcaatccatgcgcctggctaacctcctgatg

1381ctcctgtcccacgtcaggcatgcgagtaacaagggcatggaacatctgctcaacatgaag

1441tgcaaaaatgtggtcccagtgtatgacctgctgctggagatgctgaatgcccacgtgctt

1501cgcgggtgcaagtcctccatcacggggtccgagtgcagcccggcagaggacagtaaaagc

1561aaagagggctcccagaacccacagtctcagtga(seqidno：1).

与seqidno:1相比，本发明的发生c.1501c>t突变的esr2基因突变体的核酸序列如下，其中突变碱基下划线示出：