一种修复畜禽消化道损伤的多肽、其生产方法及应用与流程

本申请涉及一种多肽、其合成方法及应用，属于生物领域。

背景技术：
获得健康、无药残的肉食品及较高的产蛋率，对于畜禽养殖业至关重要，以此才能得到高的经济回报。然而如果养殖的禽类患了传染性疾病，会使产蛋量等经济指标突然下降，而且多数情况下，治愈后也很难恢复到原来的水平。其中，当爆发新城疫时，会使鸡产蛋率从90％下降到20％～40％，鸡群感染禽流感时会在3～5天内从产蛋高峰下降到10％以下。患病鸡在产蛋期间如服用过量金刚烷胺、磺胺类、红霉素、链霉素等药物，不但会使产蛋水平下降而且会有药物残留问题。随着生活水平逐步提高，人们对畜产品的需求量越来越大，对食品质量安全要求也越来越高。产蛋水平降低、药物残留等问题势必会影响经济收益。没有药物残留问题的情况下，增加鸡产蛋率、降低鸡群发病率、降低肉料比是亟待解决的问题。

技术实现要素：
根据本申请的一个方面，提供了一种多肽，该多肽具有修复消化道损伤的功能，尤其具有修复畜禽消化道损伤的功能，属于一种修复肽。在畜禽类养殖中使用该多肽，可以增加产蛋率、降低发病率、降低肉料比，显著提高养殖业的经济效益。所述多肽为，如下(A)或(B)的多肽：(A)氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly的多肽；(B)在(A)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有修复消化道损伤功能的由(A)衍生的多肽。本申请中，所述“修复消化道损伤的功能”，是指保持消化道的健康状态、以及在消化道受损的情况下促进消化道恢复健康状态。所述多肽可以通过调节体内与消化道受损及修复相关因子的平衡，缓解外界不利因素对机体的危害。既而发挥修复消化道损伤的功能。作为一个优选地实施方式，所述多肽为下列多肽中的任意一种：多肽I：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly；多肽II：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Gly；多肽III：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Val-Gly；多肽IV：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Ala-Gly。根据本申请的又一方面，提供了合成上述多肽的方法，该方法合成的多肽具有修复消化道损伤的功能，尤其具有修复畜禽类消化道损伤的功能。该方法合成的多肽产品纯度高、成本低，显著提高经济效益。所述合成上述多肽的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：(1)氨基酸-树脂交联：根据目标多肽的氨基酸序列，将C端第一位的氨基保护的氨基酸与树脂混合，在交联催化剂的存在下，得到惰性交联产物；(2)氨基酸N端去保护：将步骤(1)中得到的惰性交联产物与去保护剂混合，得到活性交联产物；(3)氨基酸缩合反应：将步骤(2)中得到的活性交联产物与氨基酸序列中C端下一位的氨基保护的氨基酸混合，在缩合催化剂的存在下，进行氨基酸的缩合反应；(4)根据多肽固相合成法，按照目标多肽的氨基酸序列，重复步骤(2)的去保护和步骤(3)的氨基酸缩合反应，自C端向N端依次将目标多肽的氨基酸序列上的氨基酸同树脂上的多肽缩合，直至形成目标多肽的氨基酸序列，得到目标多肽-树脂交联产物；(5)目标多肽与树脂分离：将步骤(4)得到的目标多肽-树脂交联产物与切割剂混合，使目标多肽与树脂分离，经纯化，得到目标多肽；所述目标多肽的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一种：序列I：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly；序列II：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Gly；序列III：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Val-Gly；序列IV：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Ala-Gly。根据本申请的又一方面，提供了一种分支多肽，该分支多肽具有修复消化道损伤的功能，尤其具有修复畜禽类消化道损伤的功能，在畜禽类养殖中使用该分支多肽，可以增加产蛋率、降低发病率、降低肉料比，显著提高养殖业的经济效益。所述分支多肽，其特征在于，至少一个分支的氨基酸序列包含序列I～序列IV中的一种。优选地，所述分支多肽中的每一个分支的氨基酸序列分别由序列I～序列IV中的一种构成。进一步优选地，所述分支多肽中的每一个分支的氨基酸序列均相同，且与序列I～序列IV中的任意一个序列相同。所述序列I～序列IV的氨基酸序列如下：序列I：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly；序列II：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Gly；序列III：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Val-Gly；序列IV：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Ala-Gly。更进一步优选地，所述分支多肽中的每一个分支的氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly。本申请中，“分支多肽”，是指由赖氨酸骨架构成的具有树形分支结构的多肽。作为一个优选地实施方式，所述分支多肽的结构式如式I、式II或式III所示：其中，式I、式II、式III中所述肽链的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一种：序列I：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly；序列II：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Gly；序列III：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Val-Gly；序列IV：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Ala-Gly。根据本申请的又一个方面，提供了一种合成上述分支多肽的方法，该方法合成的分支多肽具有修复消化道损伤的功能，尤其具有修复畜禽类消化道损伤的功能。该方法合成的多肽产品纯度高、成本低，显著提高经济效益。所述合成上述分支多肽的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：(a)建立分支多肽骨架：将氨基保护的赖氨酸与树脂进行反应，在交联催化剂的存在下，得到惰性赖氨酸交联产物I；将得到的惰性赖氨酸交联产物I与去保护剂混合，得到具有二分支骨架的活性赖氨酸交联产物I；或者，将氨基保护的赖氨酸与树脂进行反应，在交联催化剂的存在下，得到惰性赖氨酸交联产物I；将得到的惰性赖氨酸交联产物I与去保护剂混合，得到具有二分支骨架的活性赖氨酸交联产物I；将氨基保护的赖氨酸与所述活性赖氨酸交联产物I进行反应，在缩合催化剂的存在下，得到惰性赖氨酸交联产物II；将得到的惰性赖氨酸交联产物II与去保护剂混合，得到具有四分支骨架的活性赖氨酸交联产物II；或者，将氨基保护的赖氨酸与树脂进行反应，在交联催化剂的存在下，得到惰性赖氨酸交联产物I；将得到的惰性赖氨酸交联产物I与去保护剂混合，得到具有二分支骨架的活性赖氨酸交联产物I；将氨基保护的赖氨酸与活性赖氨酸交联产物I进行反应，在缩合催化剂的存在下，得到惰性赖氨酸交联产物II；将得到的惰性赖氨酸交联产物II与去保护剂混合，得到具有四分支骨架的活性赖氨酸交联产物II；将氨基保护的赖氨酸与活性赖氨酸交联产物II进行反应，在缩合催化剂的存在下，得到惰性赖氨酸交联产物III；将得到的惰性赖氨酸交联产物III与去保护剂混合，得到具有八分支骨架的活性赖氨酸交联产物III；(b)氨基酸缩合反应：将活性赖氨酸交联产物I、活性赖氨酸交联产物II或活性赖氨酸交联产物III与氨基保护的目标分支氨基酸序列C端第一位氨基酸混合，在缩合催化剂的存在下，进行氨基酸的缩合反应，得到惰性分支多肽交联产物；(c)氨基酸N端去保护：将步骤(b)中得到的所述惰性分支多肽交联产物与所述去保护剂混合，得到活性分支多肽交联产物；(d)按照多肽固相合成法重复步骤(b)的氨基酸缩合反应和步骤(c)的去保护，自C端向N端依次将目标分支氨基酸序列上的氨基保护的氨基酸同树脂上的多肽缩合，直至形成目标多肽的氨基酸序列，得到目标多肽交联产物；(e)目标多肽与树脂分离：将步骤(d)得到的目标多肽交联产物与切割剂混合，使目标多肽与树脂分离，经纯化，得到目标多肽；所述目标多肽的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一种：序列I：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Val-Gly；序列II：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Gly；序列III：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Val-Gly；序列IV：氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Val-Lys-Ala-Gly。本领域技术人员可以依据目标分支多肽的分支数量，建立相应分支多肽骨架。作为一种实施方式，所述步骤(a)进行一次赖氨酸与树脂的交联反应，可以得到赖氨酸与树脂的一级骨架结构，如式IV所示。由于赖氨酸具有两个氨基，因此在一个赖氨酸与树脂的交联位点上可以同时合成两条肽链，如式V所示。Lys-树脂式IV作为一种实施方式，在完成步骤(a)之后，如步骤(b)中的一种技术方案所述，将式IV所示赖氨酸与树脂的交联产物与氨基保护的赖氨酸再进行一次氨基酸缩合反应，式IV所示树脂上的赖氨酸的两个氨基均会与氨基保护的赖氨酸发生缩合反应，得到具有如式VI所示的二级赖氨酸骨架。由于第二级的两个赖氨酸总共具有四个氨基，因此在式VI所示的一个赖氨酸与树脂的交联位点上可以同时合成四条肽链，如式VII所示。作为一种实施方式，如步骤(b)中的一种技术方案所述，在得到的上述式VI所示结构的基础上再进行一次氨基酸缩合反应，得到具有如式VIII所示的三级赖氨酸骨架。由于第三级的四个赖氨酸共具有八个氨基，因此在一个赖氨酸与树脂的交联位点上可以同时合成八条肽链，如式VII所示。本领域技术人员可以依据多肽固相合成的需要选取所述树脂的种类。作为一个具体的实施方式，所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂(简称二氯树脂，英文2-chlorotritylchlorideresin)。优选地，所述氨基保护的氨基酸为Fmoc-氨基酸或Boc-氨基酸。作为一个优选地实施方式，所述氨基保护的氨基酸为Fmoc-氨基酸。优选地，所述氨基保护的赖氨酸为Fmoc-赖氨酸或Boc-赖氨酸。作为一个优选地实施方式，所述氨基保护的赖氨酸为Fmoc-赖氨酸(简写为Fmoc-Lys)。氨基酸上的Fmoc基团可用碱性物质脱除。当采用Fmoc基团作为氨基酸的α-氨基的保护基团时，所述去保护剂为碱性物质即可脱除氨基酸上的Fmoc基团。本申请所述合成上述多肽的方法，采用Fmoc基团作为氨基酸的α-氨基的保护基团，侧链保护基团采用酸性脱除的基团，在合成过程中，肽链只经受碱处理，而侧链保护基团一直处于稳定状态。在肽链合成结束时用酸处理，可以同时将侧链保护基团和第一个氨基酸与树脂之间的连接键打断。因此，本申请的合成上述多肽的技术方案收率高、副产物少、成本低，能够高效地合成本申请所述目标多肽。优选地，所述去保护剂为碱性物质。进一步优选地，所述去保护剂为有机碱。作为一个具体的实施方式，所述去保护剂为哌啶。所述树脂与去保护剂的重量比为1:10～1:50。本申请技术方案中的多肽固相合成过程，本领域技术人员可以根据具体合成方案采用适宜的有机溶剂。优选地，所述有机溶剂包括二氧六环、富马酸二甲酯(简写为DMF)、二甲基亚砜(简写为DMSO)中的至少一种。作为一个优选地实施方式，所述有机溶剂为富马酸二甲酯。优选地，所述树脂与氨基保护的氨基酸的重量比为1:1～1:5。优选地，所述氨基酸与树脂的交联反应的反应温度为20～30℃。进一步优选地，所述氨基酸与树脂的交联反应的反应温度为20～25℃。所述交联催化剂具有催化氨基酸的羧基与树脂发生交联反应的能力。优选地，所述交联催化剂含有苯并三唑四甲基四氟硼酸(简写为TBTU)、N,N'-二异丙基乙胺(简写为DIEA)中的至少一种。作为一个优选地实施方式，所述交联催化剂为N,N'-二异丙基乙胺。优选地，所述树脂与交联催化剂的重量比为1:0.1～1:1。所述缩合催化剂具有催化氨基酸之间的缩合反应的能力。优选地，所述缩合催化剂含有环己基碳二亚胺(简写为DCC)、1-羟基-苯并-三氮唑(简写为HOBT)、苯并三唑四甲基四氟硼酸、N,N'-二异丙基乙胺中的至少一种。作为一个优选地实施方式，所述缩合催化剂由1-羟基-苯并-三氮唑、苯并三唑四甲基四氟硼酸和N,N'-二异丙基乙胺组成；所述树脂与所述缩合催化剂中的1-羟基-苯并-三氮唑的重量比为1:1～1:10，所述树脂与所述缩合催化剂中的苯并三唑四甲基四氟硼酸的重量比为1:1～1:5，所述树脂与所述缩合催化剂中的N,N'-二异丙基乙胺的重量比为1:0.1～1:1。优选地，所述氨基酸缩合反应的反应温度为20～30℃。进一步优选地，所述氨基酸缩合反应的反...