本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及生物活性物质，更具体地，本发明涉及干细胞生物活性组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
干细胞(Stem Cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞，它是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞与成体干细胞。其中成体干细胞(Adult stem cell，ASC)分布广、增殖能力强、具有多向分化潜能且无伦理或宗教问题，可来源于骨髓、脂肪、皮肤、肌肉、角膜等各类组织，包括间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)、造血干细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、胃肠干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细胞、神经元干细胞、脐带血干细胞等。
近年来，随着对干细胞研究的逐渐深入，发现其在增殖分化过程中产生或分泌了大量的生物活性物质，这是一种包含了生长因子、蛋白质、活性多肽、微量元素等多种促进细胞生长、活化与再生的物质，如表皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、转化生长因子β(TGF-β)、白介素－6(IL-6)、白介素－7(IL-7)、天然免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD等。
然而，目前制备干细胞生物活性物质的技术以及制备获得的干细胞生物活性物质的产量和质量仍有待改进。
技术实现要素：
目前实际中应用的干细胞生物活性物质大多存在以下不足：1.直接从胎盘等组织中提取，致使所得到的干细胞生物活性物质纯度低；2.采用含有动物源成分(如胎牛血清)的培养液进行干细胞的扩增培养，提取的物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的病毒等，安全性低；3.干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等非常重要，但这些物质并不分泌到细胞外，故常在提取过程中被遗漏；4.多采用单一的胚胎干细胞或成体干细胞进行培养而收集上清，未考虑到体内细胞复杂的生长环境与不同种类细胞之间的相互作用，导致提取的生物活性物质的产量不高。本发明旨在至少 在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
根据本发明的一个方面，本发明提出一种具有高纯度、高产量、高生物活性的干细胞生物活性组合物，所述干细胞生物活性组合物含有1.69-22.24pg/mL EGF、2443.17-4459.43pg/mL bFGF、1.44-134.36pg/mL beta-NGF、1.55-355.14pg/mL VEGF、11.87-159.70pg/mL PDGF-DD、135.79-688.13pg/mL KGF、1176.99-3825.79pg/mL TGF-β1，上述干细胞生物活性组合物具有较高的生物活性，并且所述干细胞生物活性组合物中各个生物活性因子具有较高含量。
根据本发明的一个实施例，所述干细胞生物活性组合物含有18.47pg/mL EGF、4447.00pg/mL bFGF、32.66pg/mL beta-NGF、27.77pg/mL VEGF、77.04pg/mL PDGF-DD、688.13pg/mL KGF、3312.99pg/mL TGF-β1。所述干细胞生物活性组合物具有较高的生物活性，并且所述干细胞生物活性组合物中各个生物活性因子具有较高含量。
根据本发明的一个实施例，所述干细胞生物活性组合物是通过将间充质干细胞和脂肪基质细胞进行非接触式共培养获得的。相关研究表明，干细胞体外培养时在不同程度上需要依赖另外一些细胞对它们的滋养、支持作用。基质细胞是一类能够对干细胞起滋养作用的滋养细胞，多种基质细胞系已经被用来支持干细胞的体外培养。它们的存在可以更好地模拟体内环境，而且它们可以分泌多种已知的、未知的生长因子来支持干细胞的生长。脂肪组织提供了多能基质细胞的来源。研究发现，脂肪组织位于可以较易获得的结缔组织中，其中存在着抽脂术细胞，其克隆细胞株被称为脂肪基质细胞(Adipose tissue-derived stromal cell，ADSC)，这些细胞体内分布广、取材创伤小、细胞获得量大(每克脂肪组织存在高达8.6×104个基质细胞)，可补充、增殖稳定、具有美容效果等，是合适的基质细胞。当然，具有与脂肪基质细胞相似特点的细胞还可来自于其它组织，这些组织包括但不限于骨、骨髓、软骨、结缔组织、韧带组织或腱、骨骼肌、平滑肌、皮肤、外周血、脐带血、胎盘。虽然这些基质细胞并不相同，但它们所拥有的共性使它们可在体外行使相似的功能，尤其是可作为饲养层支持胚胎干细胞或成体干细胞的增殖并维持在未分化状态。进一步地，非接触式共培养在同一体系中实现两种细胞共培养，避免了直接接触式共培养中所存在的干细胞分离纯化困难、免疫安全性差、容易引起病毒传播等问题，解决了不同细胞的分离问题，便于培养结束后获得高纯度的干细胞；此外当培养模型中细胞间相互作用需要通过建立细胞间紧密连接和/或需要采用旁分泌的作用方式时，非接触式共培养不会引起干细胞的变化。
根据本发明的再一个方面，本发明提出一种制备所述干细胞活性组合物的方法，包括以下步骤：(1)利用培养基，对间充质干细胞和脂肪基质细胞进行非接触式共培养；(2)收集含有间充质干细胞的培养液；以及(3)将所述含有间充质干细胞的培养液中的间充质 干细胞进行裂解后进行离心，并收集上清液，所述上清液构成所述干细胞活性组合物。利用该方法制备获得具有高纯度、高产量、高生物活性的干细胞生物活性组合物。需要说明的是，所述含有间充质干细胞的培养液中包含有间充质干细胞和培养基。
根据本发明的一个实施例，所述非接触式共培养采用非接触培养装置，所述非接触培养装置包括：培养皿，所述培养皿中限定出下室，所述脂肪基质细胞接种于所述下室；Transwell，所述Transwell中限定出上室，所述Transwell具有PET膜，所述PET膜使所述上室和所述下室呈流体连通，所述间充质干细胞接种于所述上室。本发明所述方法采用Transwell培养板建立非接触式的干细胞和基质细胞体外共培养体系，培养结束后便于干细胞与基质细胞的分离，以便获得高纯度的干细胞生物活性物质。
根据本发明的一个实施例，所述方法步骤(3)中进一步包括：(3-1)将所述含有间充质干细胞的培养液放入-20℃冷冻后，放入5℃中进行解冻，以便获得冻融后的含有间充质干细胞的培养液；(3-2)在振幅50％的情况下，对所述冻融后的含有间充质干细胞的培养液进行超声0-90min，收集并混合超声后的液体，以便获得超声后的含有间充质干细胞的培养液；(3-3)将所述超声后的含有间充质干细胞的培养液在10000rpm下离心30min后，于0.22μm微孔滤膜进行过滤，并收集上清液，所述上清液构成所述干细胞活性组合物。本发明所述方法采用超声破碎、低温冻融与高速离心等方法提取、分离、纯化细胞培养上清及干细胞内产生的生物活性物质，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性物质。
根据本发明的一个实施例，所述方法步骤(3-2)在振幅50％的情况下，对所述冻融后的含有间充质干细胞的培养液进行超声50min，收集并混合超声后的液体，以便获得超声后的含有间充质干细胞的培养液。由此，利用本发明所述方法，可以获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性物质。
由此可知，本发明中由所述方法制备获得的细胞生物活性组合物具有以下优势：1.克服了现有技术直接从脐带或胎盘等组织中提取的生物活性物质纯度、产量与活性不高的缺点。本发明采用Transwell培养板建立干细胞和基质细胞体外非接触共培养体系，采用超声破碎、低温冻融与高速离心等方法提取、分离、纯化细胞培养上清及干细胞内产生的生物活性物质，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性物质；2.克服了现有技术中应用含动物源成分培养基的不足，本发明中的共培养体系均采用无血清培养基，未使用任何含动物源成分的培养基，避免了动物源成分造成的安全隐患；3.克服了现有技术中未提取干细胞自身产生的生物活性物质的缺陷，本发明通过超声破碎等方法，在提取干细胞分泌的生物活性物质的同时，也提取了干细胞内的生物活性物质；4.克服了现有技术中多采用单一的胚胎干细胞或成体干细胞进行培养从而提取的生物活性物质的产量不高的缺陷，本发明采用干细胞和基质细胞体外共培养体系，通过基质细胞的滋养作用促进干细胞 的生长及未分化状态的维持，且进一步模拟了体内组织细胞和干细胞之间的相互作用，所得生物活性物质产量较高；5.克服了现有共培养技术中干细胞与基质细胞接触式共培养的不足，本发明采用Transwell培养板建立非接触式的干细胞和基质细胞体外共培养体系，培养结束后便于干细胞与基质细胞的分离，以便获得高纯度的干细胞内生物活性物质。
本发明中的干细胞生物活性组合物可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。因此，本发明中的干细胞生物活性组合物在美容产品、保健品、组织工程领域具有广泛的应用前景。
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种化妆品，包含上述干细胞生物活性组合物或利用上述方法制备获得的干细胞生物活性组合物，所述化妆品具有抗衰老，增强皮肤弹性的功能，对损伤的皮肤能自动地进行护理、调养与修复，使皮肤变得更柔嫩、更富有弹性。
根据本发明的第四方面，本发明提出了一种保健品，包含上述干细胞生物活性组合物或利用上述方法制备获得的干细胞生物活性组合物，所述保健品具有抗衰老、增强机体免疫力、促进损伤或衰老组织再生以及改善组织器官功能的作用。
根据本发明的第五方面，本发明提出一种促进干细胞/祖细胞增殖和/或分化功能的方法，在存在上述干细胞生物活性组合物或上述方法制备获得的干细胞生物活性组合物的条件下，培养所述干细胞/祖细胞，利用该方法能够促进细胞增殖与分化的功能。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例，间充质干细胞和脂肪基质细胞进行非接触式共培养装置的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例
实施例1、脂肪基质细胞的分离纯化
患者知情并同意后，经吸脂术获取脂肪组织。患者年龄在37-54岁之间，身体质量指数(kg/m2)在28-35之间，除肥胖外，身体健康状况良好，无糖尿病或其它并发症。吸脂后，将脂肪组织置于生理盐水中于术后2h内送至实验室，2倍体积的Krebs-Ringer Bicarbonate 缓冲液洗涤3-4次去除血污，再用1倍体积的Ⅰ型胶原酶(1g/L of KRB，1％BSA)在间歇搅拌下37℃消化60min。消化完成后，300g离心5min以去除漂浮的脂肪细胞。将得到的基质细胞接种到细胞培养瓶中置37℃，5％CO2培养箱中进行培养，细胞的初始密度为3.5×103个/cm2，培养4-5天后细胞约长到80％。用0.5mM EDTA/0.05％胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心5min，再将细胞用Dulbecco’s modified Eagle’s–Ham’s F-10medium(V/V＝1:1)(含10％胎牛血清，15mM HEPES(pH 7.4)，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素，0.25mg/mL两性霉素B)重悬，调整细胞密度为1×104个/cm2，37℃，5％CO2培养箱中进行培养。待长到80％时按上述方法传代，得到第2代脂肪基质细胞。
实施例2、胎盘间充质干细胞的分离纯化
取足月顺产或剖腹产的胎盘组织，剥除母体侧蜕膜，剪取小块胎儿蜕膜侧胎盘组织，PBS冲洗，去除血迹。将胎盘组织剪成碎片，加入0.1％Ⅳ型胶原酶，37℃消化30min，过100目筛网，收集细胞悬液，加入配好的培养基(含DMEM，10％FBS，5ng/mL bFGF，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，25mmol/L谷氨酰胺)，调整培养细胞密度为1×105个/mL，置于37℃，5％CO2的培养箱培养，每3-4d进行换液，胎儿蜕膜侧胎盘组织消化后获得细胞中仅有少量的贴壁细胞，经2周后逐渐形成扁平单层细胞，细胞按常规方法传代、冻存、复苏。最多传代至第5代，收集5代以内的细胞。此时收集的干细胞生物学性状稳定，增殖能力强。
实施例3、脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系的建立
采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行脂肪基质细胞与间充质干细胞的非接触式共培养。取对数生长期的细胞，用0.05％/0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，培养基采用MSC无血清培养基。实验组将脂肪基质细胞接种于Transwell培养小室的下室，然后将Transwell悬挂式培养小室的上室置于孔中，在Transwell悬挂式培养小室内接种MSC，让上下室的培养液相互通融，从而建立起脂肪基质细胞与间充质干细胞的共培养体系；对照组则将MSC单独接种于Transwell小室内，下层为基础培养液。将共培养体系在37℃，5％CO2条件下进行培养。
实施例4、脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系生物活性物质的提取
从培养箱中取出培养48h后的按实施例3处理的实验组或对照组的细胞培养体系。1200rpm离心5min，取细胞培养上清与MSC，混合均匀，放入－20℃冰箱中过夜，第二天拿出放入5℃冰箱中至完全溶解，如此反复冻融3次。冻融结束后用超声破碎仪在振幅 50％的情况下分别超声0、10、20、30、40、50、60、90min，再分别将超声后的液体在10000rpm下离心30min，0.22μm微孔滤膜过滤，获得不同超声时间的干细胞生物活性物质混合液。
实施例5、脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系生物活性因子的含量测定
取实施例4获得的实验组或对照组的干细胞生物活性物质混合液，分别用R&D的酶联免疫吸附试验盒(ELISA)测定干细胞生物活性物质混合液中表皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(beta-NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生因子-DD(PDGF-DD)、角质细胞生长因子(KGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)的含量。方法参照试剂盒说明。如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的测定：取已包被抗人bFGF的96孔酶标板，往每孔中加入100μL测试稀释液，再分别加入100μL标准品、样品或空白对照，充分混匀，室温孵育2h，常规洗板，每孔加入200μL人bFGF特异性的已连接酶的单克隆抗体，室温孵育2h，洗板后加入200μL酶底物室温反应30min，加入50μL终止液终止反应，在450nm处测吸光度，并用540nm处的吸光度扣背景。根据标准曲线计算细胞因子含量。结果表明，共培养体系中EGF含量为1.69-22.24pg/mL、bFGF含量为2443.17-4459.43pg/mL、beta-NGF含量为1.44-134.36pg/mL、VEGF含量为1.55-355.14pg/mL、PDGF-DD含量为11.87-159.70pg/mL、KGF含量为135.79-688.13pg/mL、TGF-β1含量为1176.99-3825.79pg/mL；对照组中EGF含量为1.50-17.98pg/mL、bFGF含量为1334.43-3079.65pg/mL、beta-NGF含量为1.14-95.41pg/mL、VEGF含量为1.45-235.43pg/mL、PDGF-DD含量为10.99-100.47pg/mL、KGF含量为120.12-503.23pg/mL、TGF-β1含量为787.69-2585.47pg/mL。由结果可知，脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系中细胞因子的分泌量均在一定程度上高于间充质干细胞单独培养时的细胞因子分泌量，说明通过基质细胞的滋养作用可促进干细胞的生长与生物活性因子的分泌。
实施例6、脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系生物活性物质的提取
从培养箱中取出培养48h后的按实施例3处理的实验组或对照组的细胞培养体系。1200rpm离心5min，取细胞培养上清与MSC，混合均匀，放入－20℃冰箱中过夜，第二天拿出放入5℃冰箱中至完全溶解，如此反复冻融3次。冻融结束后用超声破碎仪在振幅50％的情况下超声50min，再将超声后的液体在10000rpm下离心30min，0.22μm微孔滤膜过滤，得干细胞生物活性物质混合液。
实施例7、脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系生物活性因子的含量测定
取实施例6获得的实验组或对照组的干细胞生物活性物质混合液，分别用R&D的酶联免疫吸附试验盒(ELISA)测定干细胞生物活性物质混合液中表皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(beta-NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生因子-DD(PDGF-DD)、角质细胞生长因子(KGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)的含量。方法参照试剂盒说明。如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的测定：取已包被抗人bFGF的96孔酶标板，往每孔中加入100μL测试稀释液，再分别加入100μL标准品、样品或空白对照，充分混匀，室温孵育2h，常规洗板，每孔加入200μL人bFGF特异性的已连接酶的单克隆抗体，室温孵育2h，洗板后加入200μL酶底物室温反应30min，加入50μL终止液终止反应，在450nm处测吸光度，并用540nm处的吸光度扣背景。根据标准曲线计算细胞因子含量。结果表明，共培养体系中EGF含量为18.47pg/mL、bFGF含量为4447.00pg/mL、beta-NGF含量为32.66pg/mL、VEGF含量为27.77pg/mL、PDGF-DD含量为77.04pg/mL、KGF含量为688.13pg/mL、TGF-β1含量为3312.99pg/mL；
对照组中EGF含量为12.13pg/mL、bFGF含量为2870.75pg/mL、beta-NGF含量为20.33pg/mL、VEGF含量为26.89pg/mL、PDGF-DD含量为58.90pg/mL、KGF含量为495.78pg/mL、TGF-β1含量为1997.53pg/mL。由结果可知，脂肪基质细胞与间充质干细胞共培养体系中细胞因子的分泌量均在一定程度上高于间充质干细胞单独培养时的细胞因子分泌量，说明通过基质细胞的滋养作用可促进干细胞的生长与生物活性因子的分泌。
实施例8、干细胞生物活性物质生物活性测定
将人干细胞生物活性物质按120μg/孔/天加入小鼠骨髓细胞中37℃培养，第2天计细胞数，并镜下观察细胞形态变化，与对照组相比给干细胞生物活性物质组能够促进细胞的贴壁并刺激小鼠骨髓细胞的增殖。
实施例9、干细胞生物活性物质在美容产品中的应用
将干细胞生物活性物质以10-100μg/ml的比例加入到化妆品的配方中，均质处理后制成化妆品。含有干细胞生物活性物质的化妆品具有抗衰老，增强皮肤弹性的功能，对损伤的皮肤能自动地进行护理、调养与修复，使皮肤变得更柔嫩、更富有弹性。
如将细胞因子加入含有聚乙烯醇、甘油、咪唑烷基脲、乙醇、月桂醇聚氧乙烯醚、水等成分的面膜液中，混匀，制备成面膜，长期面部应用可以起到皮肤美白、修复、抗衰老的作用。
实施例10、干细胞生物活性物质在保健品中的应用
将干细胞生物活性物质按1:1000-1:8000比例加入特定食品中制成保健品。含有二者的保健品具有抗衰老、增强机体免疫力、促进损伤或衰老组织再生以及改善组织器官功能的作用。
实施例11、干细胞生物活性物质在组织工程中的应用
将干细胞生物活性物质以10-200μg/ml的比例加入体外干/祖细胞培养体系中，发现其具有促进细胞增殖与分化的功能。
取培养至5代的胎盘间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液、计数，以5×103个/孔种入96孔板，分为两组，一组加入100μLα-MEM培养基，另一组加入100μL含有10μg干细胞生物活性物质的α-MEM培养基，CO2培养箱培养48h。每孔加入10μL CCK-8试剂，CO2培养箱中37℃孵育2h，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度(OD)值。结果表明加入干细胞生物活性物质组的细胞增殖率是未加干细胞生物活性物质组的123.07％±2.13％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。